CN102175635A - 检测维生素c工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定：(2)聚类分析；(3)过程分析，利用本发明的方法可以从整体上研究维生素C工业混菌发酵过程中，细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

Description

检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C工业混菌发酵中细胞内蛋白质变化的方法。

背景技术

蛋白质是构成细胞的重要组成部分，是生理功能的调控者和执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，二维凝胶电泳是目前最经典的蛋白分离方式，可以在一块胶上分离几百甚至上千种蛋白质，同时，质谱技术的发展使得蛋白鉴定准确度大大提高。基于二维凝胶电泳分离，MALDI-TOF/TOF鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。

维生素C的工业混菌发酵是由巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌共同作用完成发酵的，其内在调控机理尚不明确，这就使优化工业生产过程变得困难，也增加了生产中控制发酵过程的难度。

发明内容

本发明的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解维生素C混菌发酵过程中的蛋白质变化规律，进一步揭示两种菌在发酵过程中的相互关系，从而弥补现有混菌发酵过程难于控制的不足，提供一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤：

(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的3-5份破碎细胞100～200mg分别置于离心管中，加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，加4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；

③蛋白浓度测定：

将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按500～1000μg分装，-80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为2％的CHAPS，体积百分浓度为0.5％的IPG buffer，余量为水；

④一维等电聚焦电泳

采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500～1000μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.0～1.5mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡10～20min、平衡液II平衡10～20min；所述平衡液I的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为1％～2％的二硫苏糖醇，6mol·L-1尿素，体积浓度为20～40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

所述平衡液II的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为2％～3％的碘乙酰胺，6mol·L-1尿素，体积浓度为20～40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

⑤SDS-PAGE电泳

配制SDS-PAGE溶液：质量浓度为11％～15％的聚丙烯酰胺，3.75M·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.2‰～0.3‰的过硫酸铵，体积浓度为0.5‰～1.5‰的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白marker，加入4～5ml质量浓度为0.9％～1.5％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在80～100V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；

⑥图像分析

将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；

⑦差异表达蛋白鉴定

将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-TOF-TOF，测定差异蛋白；

(2)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。

利用本发明的方法可以从整体上研究维生素C工业混菌发酵过程中，细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

附图说明

图1为维生素C发酵过程中不同时间点SDS-PAGE胶图；

图2为巨大芽孢杆菌胞内与芽孢形成相关蛋白含量在发酵过程中的变化趋势；

图3为维生素C混菌发酵过程中蛋白聚类分析；

图4为氧化葡糖杆菌胞内与生长及产酸相关蛋白含量在发酵过程中的变化趋势；

图5为维生素C混菌发酵过程嘌呤代谢中相关蛋白含量变化趋势。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

本发明所用的细胞裂解液：7mol·L-1尿素，2mol·L-1硫尿，质量浓度为的4％CHAPS，40mmol·L-1Tris，余量为水。

实施例1

一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：

(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得5份破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的3-5份破碎细胞100～200mg分别置于离心管中，加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，加4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；

③蛋白浓度测定：

将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按1000μg分装，-80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为2％的CHAPS，体积百分浓度为0.5％的IPG buffer，余量为水；

④一维等电聚焦电泳

采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个1000μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.25mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡15min、平衡液II平衡15min；

所述平衡液I的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为2％的二硫苏糖醇，6mol·L-1尿素，体积浓度为30％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

所述平衡液II的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为3％的碘乙酰胺，6mol·L-1尿素，体积浓度为30％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

⑤SDS-PAGE电泳

配制SDS-PAGE溶液：质量浓度为13％的聚丙烯酰胺，3.75M·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.3‰的过硫酸铵，体积浓度为1.0‰的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白marker，加入5ml质量浓度为1.0％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在90V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；

⑥图像分析

将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；

⑦差异表达蛋白鉴定

将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-TOF-TOF，测定差异蛋白；

(2)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。

在维生素C工业混菌发酵过程中，两种菌胞内鉴定到的蛋白分别如表1.1及表1.2所示。

表1.1巨大芽孢杆菌胞内蛋白

表1.2氧化葡糖杆菌胞内蛋白

如图2所示，巨大芽孢杆菌在发酵18h，与产芽孢相关的基因表达量出现激增，结合显微镜观察，证实巨大芽孢杆菌在18h左右产生芽孢。如图3聚类分析所示，有142种蛋白具有第一种变化规律，即在发酵18h，含量最大，可能由于氧化葡糖杆菌在18h，受到巨大芽孢杆菌产孢中释放的物质刺激，胞内一系列蛋白表达上调；而巨大芽孢杆菌由于本身产孢破裂，胞内蛋白外泄，使自身蛋白含量减少。

如图4所示，氧化葡糖杆菌胞内细胞分裂蛋白FtsZ，在巨大芽孢杆菌产孢以后，呈现上调趋势，这与氧化葡糖杆菌在混菌体系的生长曲线相符合，说明巨大芽孢杆菌通过产孢刺激了氧化葡糖杆菌的细胞分裂。同时，参与L-山梨糖转化为2-酮-古龙酸的山梨糖/山梨酮脱氢酶(Sorbose/Sorbosone Dehydrogenase，SSDH)，在发酵过程中，也呈现类似规律，这与胞外2-酮-古龙酸含量曲线在18h后迅速积累现象相一致。值得注意的是SSDH的第一个时间点，6h胞内含量较高，这是因为巨大芽孢杆菌接种前，置于4℃，部分出现产孢现象，对氧化葡糖杆菌胞内SSDH有明显促进作用。此现象也进一步说明巨大芽孢杆菌产孢对氧化葡糖杆菌产酸能力的促进作用。

如图5所示，巨大芽孢杆菌中参与次黄嘌呤核苷单磷酸、黄嘌呤核苷单磷酸以及鸟嘌呤核苷单磷酸转化的肌醇-5-单磷酸脱氢酶与谷氨酸水化酶含量也是在18h达到最大值。核酸类物质在芽孢产生过程中，会发生降解，产生一系列嘌呤嘧啶衍生物。氧化葡糖杆菌胞内参与降解过程的核苷酸酶在18h、23h表达量上调，提示其可能利用巨大芽孢杆菌产孢释放的核酸类物质生产自身生长需要的中间代谢物。

磷酸戊糖途径，是氧化葡糖杆菌中重要的代谢途径，是还原力NADPH的重要产生途径。6-磷酸葡萄糖酸内酯脱氢酶、转酮酶是途径中比较关键的酶，氧化葡糖杆菌中，此两种酶在18h、23h表达量出现激增，说明氧化葡糖杆菌在巨大芽孢杆菌产孢刺激下，磷酸戊糖途径有较明显提高。谷胱甘肽是微生物体内含量最高的硫醇类物质，氧化型与还原型谷胱甘肽的转化对于维持微生物的氧化还原状态有重要作用，此转化过程需要NADPH参与，磷酸戊糖途径的提高可以间接利于维持氧化葡糖杆菌的氧化还原平衡状态，使得其有较好的生长及产酸环境。

综上所述，巨大芽孢杆菌产生芽孢对于混菌发酵体系有重要作用，结合相关蛋白变化、生长曲线及产酸情况，说明产生芽孢的过程有利于促进氧化葡糖杆菌的生长及产酸。本发明通过混菌蛋白的研究，证明巨大芽孢杆菌产孢时间对发酵过程有至关重要作用，从而为工业发酵工艺的改进提供了可调控的位点。

实施例2

一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：

(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得4份破碎细胞；

③蛋白浓度测定：

将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按500μg分装，-80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为2％的CHAPS，体积百分浓度为0.5％的IPG buffer，余量为水；

④一维等电聚焦电泳

采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.0mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡10min、平衡液II平衡10min；

所述平衡液I的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为1％的二硫苏糖醇，6mol·L-1尿素，体积浓度为20％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

所述平衡液II的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为2％的碘乙酰胺，6mol·L-1尿素，体积浓度为20％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

⑤SDS-PAGE电泳

配制SDS-PAGE溶液：质量浓度为11％的聚丙烯酰胺，3.75M·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.2‰的过硫酸铵，体积浓度为0.5‰的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白marker，加入4ml质量浓度为1.5％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在80V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；

⑥图像分析

将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；

⑦差异表达蛋白鉴定

将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-TOF-TOF，测定差异蛋白；

(2)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。

通过实验证明，结果与实施例1相似。

实施例3

一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：

(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3份破碎细胞；

③蛋白浓度测定：

将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按1000μg分装，-80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为2％的CHAPS，体积百分浓度为0.5％的IPG buffer，余量为水；

④一维等电聚焦电泳

采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个1000μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.5mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡20min、平衡液II平衡20min；

所述平衡液I的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为2％的二硫苏糖醇，6mol·L-1尿素，体积浓度为40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

所述平衡液II的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为3％的碘乙酰胺，6mol·L-1尿素，体积浓度为40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

⑤SDS-PAGE电泳

配制SDS-PAGE溶液：质量浓度为15％的聚丙烯酰胺，3.75M·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.3‰的过硫酸铵，体积浓度为1.5‰的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白marker，加入5ml质量浓度为0.9％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在100V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；

⑥图像分析

将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；

⑦差异表达蛋白鉴定

将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-TOF-TOF，测定差异蛋白；

(2)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。

通过实验证明，结果与实施例1相似。

本发明所采用的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的其它菌株也可以用于本发明。

Claims (1)

1.一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤：

(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的3-5份破碎细胞100～200mg分别置于离心管中，加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，加4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；

③蛋白浓度测定：

将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按500～1000μg分装，-80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为2％的CHAPS，体积百分浓度为0.5％的IPG buffer，余量为水；

④一维等电聚焦电泳

采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500～1000μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.0～1.5mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡10～20min、平衡液II平衡10～20min；

所述平衡液I的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为1％～2％的二硫苏糖醇，6mol·L-1尿素，体积浓度为20～40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

所述平衡液II的组成为：50mmol·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为2％的SDS，质量浓度为2％～3％的碘乙酰胺，6mol·L-1尿素，体积浓度为20～40％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；

⑤SDS-PAGE电泳

配制SDS-PAGE溶液：质量浓度为11％～15％的聚丙烯酰胺，3.75M·L-1pH为8.8的Tris-HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.2‰～0.3‰的过硫酸铵，体积浓度为0.5‰～1.5‰的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白marker，加入4～5ml质量浓度为0.9％～1.5％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在80～100V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；

⑥图像分析

将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；

⑦差异表达蛋白鉴定

将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-TOF-TOF，测定差异蛋白；

(2)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。

Images