CN102680562A - 分析vc生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，步骤：（1）混菌传代培养；（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定；（3）主成分分析；（4）过程分析：将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。本发明的方法通过对不同传代时间的巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌的小分子代谢物分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的代谢物分子和代谢途径，为提高2–酮基–L–古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向，为优化发酵过程，提高维生素C产量奠定基础。

Description

分析VC生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种分析维生素C生产菌株混菌传代培养过程小分子代谢物变化的方法。

背景技术

随着经济发展和人民生活水平的提高，维生素C(VC)在食品、药品等方面的需求逐年增加。目前，我国多为“二步发酵法”生产维生素C。第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。其中，第二步发酵中巨大芽孢杆菌为伴生菌，氧化葡糖杆菌为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力得到提高，但其作用机理尚不明确。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分析检测维生素C生产菌株传代培养过程中小分子代谢物变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-5个时间取样，取3-5个样；

③分纯：

将步骤（1）②获得的3-5个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养10-15h；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液100–200mL，分别在1000–3000rpm离心3–10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2–7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1–3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞制成干粉，各称取30–60mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入0.5–1.5mL提取液，加入30-70μL浓度为0.020-0.060mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；1000–3000rpm离心3–10min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入40-100μL浓度为10-30mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

所述提取液为体积分数为50-70%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：

将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃-280℃，载气为高纯氦气，恒压80-100KPa，分流比3：1-20：1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃，保持3min-6min，以4℃/min-8℃/min的升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；

（3）主成分分析：

①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；

②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；

（4）过程分析

将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。

所述细胞制成干粉的方法为液氮研磨细胞。

本发明提供的一种分析检测维生素C生产菌种传代培养过程中小分子代谢物的方法，涉及代谢物的提取和分析检测，通过对不同传代时间的巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌的小分子代谢物分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的代谢物分子和代谢途径，为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，为提高2–酮基–L–古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向，为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量奠定基础。

附图说明

图1为不同传代时间的氧化葡糖杆菌小分子代谢物的主成分分析得分图（图1-1）和载荷图（图1-2）；

图2为不同传代时间的氧化葡糖杆菌传代培养过程中小分子代谢物标志物的含量变化；

图3为不同传代时间的巨大芽孢杆菌小分子代谢物的主成分分析得分图（图3-1）和载荷图（图3-2）；

图4为不同传代时间的巨大芽孢杆菌传代培养过程中小分子代谢物标志物的含量变化；

图5为不同传代时间的混菌小分子代谢物的主成分分析得分图（图5-1）和载荷图（图5-2）；

图6为不同传代时间的混菌传代培养过程中小分子代谢物标志物的含量变化；

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，并不对本发明作任何限制。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种分析维生素C生产菌株传代过程小分子代谢物变化的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取液氮的100μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacteroxydans）和100μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养36h；

（2）种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，240rpm摇床振荡培养36h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，在30℃，240rpm摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为5%为传代比接入新的种子培养基中，传代150天得到混菌细胞，在传代第0，50，100，150天时间点取4个样；

③分纯：

将步骤（1）②获得的4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，30℃培养36h；再分别转入新的种子培养基，在30℃，240rpm摇床振荡培养36h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，在30℃，240rpm摇床振荡培养13h；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液150mL，分别在2000rpm离心5min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.3的磷酸盐缓冲液洗细胞2次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞用液氮研磨的方法制成干粉，各称取50mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入1.0mL提取液，加入50μL浓度为0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；2000rpm离心5min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入50μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃水浴中肟化反应90min；再加入80μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于37℃水浴进行硅烷化反应30min；

所述提取液为体积分数为50的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：

将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，恒压91KPa，分流比10：1，柱温箱升温程序为：初始70℃，保持5min，以5℃/min的升到280℃，保持5min，使用EI电离源，源温250℃，检测器电压2500V，电离电压70eV，电流40μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；

（3）主成分分析：

①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；

②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；

（4）过程分析

将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的代谢物分子及相关代谢途径，从而为揭示混菌传代培养过程中两菌的相互作用机制和以提高2-酮基L--古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。

以0、50、100和150代的氧化葡糖杆菌传代培养的小分子代谢物的相对含量为样本矩阵，进行主成分分析（图1）。其得分图（图1-1）明显可以分为四类，其中150代明显与0、50和100代的代谢物谱差异较远，0代与50代相距较近，说明其传代进化差异不是很大。图2为区分氧化葡糖杆菌不同传代时间的分子标志物相对含量变化图，其中十六烷酸、十八烯酸和十八烷酸随着传代时间的延长含量降低，说明细胞生长过程中消耗更多的脂肪酸生成细胞膜磷脂，因此游离脂肪酸在100代后显著减少。

以0、50、100和150代的巨大芽孢杆菌传代培养的小分子代谢物的相对含量为样本矩阵，进行主成分分析（图3），从得分图（图3-1）中可以看出巨大芽孢杆菌不同传代培养的代谢物谱差异较大，明显分为四类。图4为区分不同传代时间巨大芽孢杆菌小分子代谢标志物随时间的变化其相对含量的变化趋势图。其中十六烷酸和十八烷酸随着巨大芽孢杆菌传代时间的延长含量显著降低，说明细胞生长消耗更多的脂肪酸生成细胞膜磷脂，因此游离脂肪酸显著减少。此外多数氨基酸，如脯氨酸和4-羟基脯氨酸显著减少，5-氧脯氨酸和谷氨酰胺等的含量也都有较明显的减少，也说明传代过程中巨大芽孢杆菌消耗大量氨基酸用来维持自身生长，合成胞内蛋白。

以混菌细胞在传代时间为0、50、100和150天时的小分子代谢物的相对含量为样本矩阵进行主成分分析（图5），得分图（图5-1）显示0代与50、100和150代的混菌样本明显区分，说明混菌传代培养过程中，由于两菌的相互作用，其传代进化的菌株体系与原始出发菌体系明显不同，但50代和100代较为接近，在第一主成分上不能明显区分。图6为区分不同传代时间混菌小分子代谢物标志物相对含量的变化趋势图。在这些标志物中，多数氨基酸如脯氨酸、甘氨酸、4-羟基脯氨酸、5-氧脯氨酸和谷氨酰胺等随着传代时间的延长含量成降低趋势，尤其是脯氨酸和5-氧脯氨酸在150代混菌中浓度达到最低，这两种物质是影响混菌发酵2-酮古龙酸产量的关键物质。这些变化表明，随着混菌传代增加，两菌相互作用更加协调，有助于目的产物的生成。

实施例2

1．一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10μL保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和10μL保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28℃，培养48h；

②种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200rpm摇床振荡培养，以48h为传代周期，以体积比为1%为传代比接入新的种子培养基中，传代100天得到混菌细胞，在传代0-100天选定3个时间取样，取3样，分别为0天、50天、100天；

③分纯：

将步骤（1）②获得的3样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28℃培养48h；再分别转入新的种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养48h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200rpm摇床振荡培养15h；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液100mL，分别在1000rpm离心10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液洗细胞1次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞用液氮研磨细胞的方法制成干粉，各称取30mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入0.5mL提取液，加入30μL浓度为0.020mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；1000rpm离心10min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入40μL浓度为10mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃水浴中肟化反应60min；再加入50μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃水浴进行硅烷化反应30min；

所述提取液为体积分数为70%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：

将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃，载气为高纯氦气，恒压80KPa，分流比3：1，柱温箱升温程序为：初始50℃，保持3min，以4℃/min的升到260℃，保持3min，使用EI电离源，源温230℃，检测器电压2300V，电离电压60eV，电流30μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；

（3）主成分分析：

①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；

②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；

（4）过程分析

将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。

实施例3

一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的500μL保藏于体积浓度为30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和500μL保藏于体积浓度为30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，35℃，培养24；

②种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养24，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280rpm摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为10%为传代比接入新的种子培养基中，传代150天得到混菌细胞，在传代0-150天中选定4个时间取样，取4个样，分别在第0、50、100和第150天取4个样；

③分纯：

将步骤（1）②获得的4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，35℃培养24h；再分别转入新的种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养24h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为30%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280rpm摇床振荡培养10；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液200mL，分别在3000rpm离心3min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞用液氮研磨细胞的方法制成干粉，各称取60mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入1.5mL提取液，加入70μL浓度为0.060mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；3000rpm离心3min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入100μL浓度为30mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于40℃水浴中肟化反应120min；再加入100μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于40℃水浴进行硅烷化反应60min；

所述提取液为体积分数为60%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：

将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，恒压100KPa，分流比20：1，柱温箱升温程序为：初始80℃，保持6min，以8℃/min的升到300℃，保持8min，使用EI电离源，源温260℃，检测器电压2700V，电离电压80eV，电流50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；

（3）主成分分析：

①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；

②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；

（4）过程分析

将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。

本发明提供了一种分析检测维生素C生产菌种传代培养过程中小分子代谢物的方法，涉及代谢物的提取和分析检测，通过对不同传代时间的巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌的小分子代谢物分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的代谢物分子和代谢途径，为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量奠定基础。

实验证明，实施例2和实施例3与实施例1的结果类似。

本发明所采用的固体培养基、种子培养基的组成选自中国专利申请号为201110314740.9公开的培养基，例如：

固体培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCO₃ 1g，加水至1L，调pH=6.8，121°C灭菌20min，制成固体培养基。

种子培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCO₃ 1g，加水至1L，调pH=6.8，121°C灭菌20min，制成种子培养基。

本发明所采用的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌的其它菌株也可以用于本发明。

Claims (2)

1.一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样，取3-4个样；

③分纯：

将步骤（1）②获得的3–5个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养10-15h；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液100-200mL，分别在1000-3000rpm离心3–10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1-3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞制成干粉，各称取30-60mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入0.5–1.5mL提取液，加入30-70μL浓度为0.020-0.060mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；1000–3000rpm离心3–10min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入40-100μL浓度为10-30mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

所述提取液为体积分数为50-70%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：

将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃-280℃，载气为高纯氦气，恒压80-100KPa，分流比3：1-20：1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃，保持3min-6min，以4℃/min-8℃/min的升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；

（3）主成分分析：

①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；

②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；

（4）过程分析

将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。

2.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程小分子代谢物变化的方法，其特征是所述细胞制成干粉的方法为液氮研磨细胞。

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