CN103320359A

CN103320359A - 一种大观霉素高产菌株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103320359A
Application number: CN2013102422944A
Authority: CN
Inventors: 王绘砖; 杨丽锋; 魏伟
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Hebei Shengxue Dacheng Tangshan Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN103320359B

Abstract

本发明公开了一种大观霉素高产菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在大观霉素生产中的应用。本发明提供的大观霉素高产菌株的名称为壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO.6221，保藏日期为2012年06月14日。本发明提供的大观霉素高产菌株筛选方法可快速筛选高产菌株，简单易行；本发明所述DC15-01菌株的大观霉素发酵产率提高了30.6%。

Description

一种大观霉素高产菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株及其筛选方法和其在发酵领域中的应用，具体涉及一种大观霉素高产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

大观霉素(Spectniomycni) 是壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)有氧发酵后生成的次级代谢产物，为氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制能力，尤其对耐瑟氏淋球菌作用最强，对耐青霉素、四环素的淋球菌亦有高度敏感性。大观霉素一般无过敏现象，副作用小，安全性好。大观霉素也可用于动物治疗，并能促进动物生长，是良好的动物饲料添加剂。

目前选育壮观链霉菌优良菌种的方法通常是采用紫外诱变方式，该方法操作简便，但其诱变类型的局限性以及不确定性往往导致诱变结果的失败。王宏斌等人介绍了一种使用原生质体再生技术制备壮观链霉菌7-23号菌株的方法（王宏斌，邵素兰.原生质体—再生技术在大观霉素菌种选育中的应用.中国抗生素杂志2003,28（11）：696-697.），壮观链霉菌7-23号菌株的菌落形态为馒头型带红边。该方法先将出发菌株制成原生质体，原生质体再经过紫外诱变得到变异菌株，原生质体由于无细胞壁屏障，将其直接用于诱变处理能使诱变效应增加，进而使获得正突变株的几率大大增加。但该菌株未经药物抗性筛选，且其发酵产率较低，其最高发酵效价为225μg/ml；专利CN201010107484.1提供了一种新的壮观链霉菌种诱变方法：出发菌株先经过亚硝基胍、γ-射线诱变处理，再将诱变后的孢子涂布于加入了链霉素、新霉素和大观霉素的平板上进行筛选，筛选后的菌株再经过基因组重排技术进行改良，最终得到改良后的壮观链霉菌株。该方法虽然筛选出了对多种药物具有良好抗性的菌株，但该方法制备出的菌株发酵产率仍然较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种大观霉素高产菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在大观霉素生产中的应用。

为实现本发明的目的，本发明提供了一种大观霉素高产菌株，该菌株的名称为壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6221，保藏日期为2012年06月14日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的DC15-01菌株其微生物学特征如下：

单菌落形态为：菌落呈桔红色、馒头形；孢子呈白色，显微镜下观察孢子呈椭圆形，表面光滑。

本发明所提供的DC15-01菌株筛选方法，包括以下步骤：

（1）孢子悬液制备：将出发株（编号4.467，购自中科院微生物研究所）接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%的条件下培养4-8天，然后向斜面培养基中加入无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液；

（2）孢子悬液预处理：向制备好的孢子悬液中加入LiCl溶液，使孢子悬液中LiCl的质量浓度在0.1%-0.5%之间，振荡30-60s，混匀后于30±0.5℃下静置2-6 h；

（3）紫外线诱变：将预处理后的孢子悬液转移至灭菌的培养皿中，置于波长为254 nm、功率30 W紫外灯的正下方30cm处，搅拌、避光条件下紫外照射15-90 s；

（4）理性化筛选：在红光环境中，将经紫外线照射过的孢子悬液稀释至1×10³-1×10⁴个/mL，将稀释液涂布在含大观霉素和LiCl的分离培养基上，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%的条件下避光培养4-8天，其中第一天正向培养，其余时间倒置培养；

（5）高产菌株筛选：在完成培养的分离培养基上挑取直径在5 mm以上的单菌落接种到斜面培养基上，在28.0±0.5℃、40%-60%湿度条件下，培养4-8天，菌种成熟后将其接种到种子培养基中，在30.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养24-32 h，菌种成熟后将其接种到发酵培养基中，在30.0±0.5℃、220 rpm的条件下震荡培养3-5天，得到发酵液，测定各发酵液中大观霉素的效价，效价最高的发酵液对应的菌株即为壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01。

本发明所述步骤（1）中孢子悬液的孢子浓度为10¹²-10¹⁴个/mL。按质量体积比计算，本发明所述步骤（1）或（5）中所用的斜面培养基，其成分为：1.0-2.0%可溶性淀粉，0.1-0.3%蔗糖，0.1-0.5%牛肉膏，0.02-0.20%磷酸二氢钾，0.05-0.15%氯化钠，1.8-2.2%琼脂，其余为水；将斜面培养基的pH调节至7.0±0.2。

本发明所述步骤（4）所述的分离培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-2.0%可溶性淀粉，0.1-0.3%蔗糖，0.1-0.5%牛肉膏，0.02-0.20%磷酸二氢钾，0.05-0.15%氯化钠，1.8-2.2%琼脂，0.3-1.0%大观霉素，0.2%-0.4%的LiCl，其余为水；将分离培养基的pH调节至7.0±0.2。

按质量体积比计算，本发明所述步骤（5）中的种子培养基，其成分为：1.0-2.0%葡萄糖，1.0-1.5%酵母粉，2.0-3.0%鱼粉，0.2-0.5%蛋白胨，0.05-0.30%豆油，其余为水；将种子培养基的pH调节至6.8±0.1。

按质量体积比计算，本发明步骤（5）中所述的发酵培养基，其成分为：2-5%玉米淀粉，2.5-4.0%玉米浆，0.5-2.0%酵母粉，0.5-1.5%葡萄糖，1.0-2.0%鱼粉，0.1-0.5%硫酸铵，0.1-0.5%磷酸二氢钾，0.1-0.5%氯化钾，0.1-0.5%氢氧化钠，0.1-0.5%碳酸钙，0.1-0.3%聚醚消沫剂，0.02-0.10%巴比妥，其余为水；将发酵培养基的pH调节至7.0±0.1。

本发明所述的DC15-01菌株可应用于大观霉素的发酵生产中，其发酵步骤如下：将壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养4-8天，菌种成熟后将其转接至种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养24-32h，菌种成熟后转接至发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220rpm的条件下震荡培养3-5天，制得含有大观霉素的发酵液。

本发明采用了紫外诱变与氯化锂处理相结合的复合诱变手段，大大提高了基因突变的丰度，保证了高产菌株的产生。氯化锂作为转录抑制剂参与蛋白质合成，通过顺式作用元件作用于DNA，使之形成基因增强子或启动多拷贝基因，从而产生诱变效应。氯化锂通过前处理进入细胞，与DNA分子结合，吸收紫外能量后可增强紫外线的诱变效应。

壮观链霉菌中大观霉素合成基因与大观霉素抗性基因为连锁基因，因此，菌体内大观霉素合成水平与菌体对大观霉素的耐受性成正比，也就是说，真正的高产菌株一定具备很强的耐自身能力。根据这一理论基础，本发明以高浓度大观霉素为筛选压力，对随机诱变得到的高丰度突变库进行筛选，从而快速得到了大观霉素高产菌株。

综上所述，本发明的诱变与筛选方法高效可靠。根据壮观链霉菌DC15-01的复试及稳定性考察结果来看，其具有良好的传代稳定性，同时有效提高了大观霉素的发酵产率。

附图说明

图1 为大观霉素高产菌株的筛选方法流程图

图2 为菌株DC15-01单菌落形态图

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但不以任何方式对本发明进行限制。

实施例1 大观霉素高产菌株的筛选

(1) 孢子悬液的制备：将出发菌株（编号4.467，购自中科院微生物研究所）接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%的条件下培养7天，然后向斜面培养基中加入4ml的无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，孢子悬液中的孢子浓度为10¹³个/ml。

斜面培养基的制备：称取15g可溶性淀粉，2g蔗糖，3g牛肉膏，1g磷酸二氢钾，1g氯化钠，20g琼脂，加水定容至1000ml，然后用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2，121℃下灭菌20min。灭菌完成后分装置若干试管中，铺成斜面，凝固后得到斜面培养基。

孢子悬液预处理：向制备好的孢子悬液中加入LiCl溶液，使孢子悬液中LiCl的质量浓度为0.3%，振荡50s，混匀后于30±0.5℃下静置6 h，制得预处理后的孢子悬液；

（2）紫外线诱变：将预处理的孢子悬液转移至灭菌的培养皿中，置于波长为254 nm、功率为30 W的紫外灯正下方30 cm处，搅拌、避光条件下紫外照射60 s；

（3）理性化筛选：在红光环境中，将紫外线照射的孢子悬液进行稀释，稀释液涂布在分离培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下黑暗培养6天，培养时第一天正常培养，第二天起倒置培养。分离培养基的制备：称取15g可溶性淀粉，1g蔗糖，5g牛肉膏，1.2g磷酸二氢钾，1.2g氯化钠，3g LiCl，5g大观霉素，20g琼脂，加水定容至1000ml，然后用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2，在121℃下灭菌20min；

（4）高产菌株筛选：在分离培养基上挑取直径在5 mm以上的单菌落接种到斜面培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养8天；斜面培养成熟后接种到种子培养基中，在30.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养32 h；菌种成熟后接种到发酵培养基中，在30.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养5天，得到发酵液。种子培养基的制备：20g葡萄糖，15g酵母粉，25g鱼粉，2.5g蛋白胨，2.5g豆油，加水定容至1000ml，然后用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.1，在121℃下灭菌20min；发酵培养基的制备：50g玉米淀粉，30g玉米浆，14g酵母粉，10g葡萄糖，15g鱼粉，3g硫酸铵，3g磷酸二氢钾，3g氯化钾，3g氢氧化钠，3g碳酸钙，2g聚醚消沫剂，0.6g巴比妥，加水定容至1000ml，然后用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.1，在121℃下灭菌20min；

（5）效价检测：用高效液相色谱对发酵液进行效价检测，效价最高值为3582 U/ml，将其对应的菌株命名为壮观链霉菌DC15-01，并将其保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 6221，保藏日期为2012年06月14日。

实施例2 菌种复试

斜面培养基的制备：10g可溶性淀粉，3g蔗糖，2g牛肉膏，0.3g磷酸二氢钾，0.5g氯化钠，20g琼脂，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.2，在121℃下灭菌20min。

种子培养基的制备：10g葡萄糖，12g酵母粉，30g鱼粉，2.5g蛋白胨，1.5g豆油，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至6.8±0.1，在121℃下灭菌20min。

发酵培养基的制备：20g玉米淀粉，40g玉米浆，5g酵母粉，10g葡萄糖，20g鱼粉，1g硫酸铵，3g磷酸二氢钾，5g氯化钾，1g氢氧化钠，3g碳酸钙，1g聚醚消沫剂，0.2g巴比妥，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.1，在121℃下灭菌20min。

将壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养4天，菌种成熟后将其转接至种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养28 h，菌种成熟后转接至发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养5天，制得含有大观霉素的发酵液。测定发酵液中大观霉素的效价，结果为3480U/mL。

实施例3 菌种复试

斜面培养基的制备：15g可溶性淀粉，2g蔗糖，3g牛肉膏，1.2g磷酸二氢钾，1g氯化钠，18g琼脂，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.2，在121℃下灭菌20min。

种子培养基的制备：15g葡萄糖，10g酵母粉，20g鱼粉，3g蛋白胨，0.5g豆油，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至6.8±0.1，在121℃下灭菌20min。

发酵培养基的制备：30g玉米淀粉，25g玉米浆，16g酵母粉，5g葡萄糖，10g鱼粉，5g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，1g氯化钾，3g氢氧化钠，5g碳酸钙，3g聚醚消沫剂，0.6g巴比妥，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.1，在121℃下灭菌20min。

将壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养6天，菌种成熟后将其转接至种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养32 h，菌种成熟后转接至发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养4天，制得含有大观霉素的发酵液。测定发酵液中大观霉素的效价，结果为3662U/ml。

实施例4 菌种复试

斜面培养基的制备：20g可溶性淀粉，1g蔗糖，5g牛肉膏，2g磷酸二氢钾，1.5g氯化钠，22g琼脂，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.2，在121℃下灭菌20min。

种子培养基的制备：20g葡萄糖，15g酵母粉，25g鱼粉，5g蛋白胨，3g豆油，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至6.8±0.1，在121℃下灭菌20min。

发酵培养基的制备：50g玉米淀粉，36g玉米浆，20g酵母粉，15g葡萄糖，15g鱼粉，3g硫酸铵，5g磷酸二氢钾，3g氯化钾，5g氢氧化钠，1g碳酸钙，2g聚醚消沫剂，1g巴比妥，加水定容至1000ml；使用40%氢氧化钠溶液将培养基的pH调节至7.0±0.1，在121℃下灭菌20min。

将壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养8天，菌种成熟后将其转接至种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养24 h，菌种成熟后转接至发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养3天，制得含有大观霉素的发酵液。测定发酵液中大观霉素的效价，结果为3619U/ml。

实施例5 稳定性考察

取壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于实施例3制备的斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养6天，将其再次接种于斜面培养基中进行培养，重复两次。将这三次培养出的菌株分别各自转接至实施例3制备的种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养32 h，菌种成熟后各自转接至实施例3制备的发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养4天，制得三组含有大观霉素的发酵液。检测发酵液中大观霉素的效价，按照培养顺序依次为：3607U/ml、3649U/ml、3625U/ml。从实验结果可以看出，壮观链霉菌DC15-01具有较好的传代稳定性。

实施例6 出发菌株对比实验

以壮观链霉菌DC15-01的出发菌株（编号4.467，购自中科院微生物研究所）为发酵菌株，采用实施例3的发酵条件进行三次平行实验，检测发酵液中大观霉素的效价，分别为2819U/ml、2866U/ml、2731U/ml，平均值为2805U/ml。比较出发菌株发酵液的平均效价与实施例3所得发酵液的效价可知，与出发菌株相比本发明所述的壮观链霉菌DC15-01的大观霉素发酵产率提高了30.6%。

Claims

1.一种大观霉素高产菌株，其特征在于，该菌株的名称为壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）DC15-01，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6221，保藏日期为2012年06月14日。

2.权利要求1所述大观霉素高产菌株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）孢子悬液制备：将壮观链霉菌的出发株接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%的条件下培养4-8天，然后向斜面培养基中加入无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液；其中斜面培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-2.0%可溶性淀粉，0.1-0.3%蔗糖，0.1-0.5%牛肉膏，0.02-0.20%磷酸二氢钾，0.05-0.15%氯化钠，1.8-2.2%琼脂，其余为水，将斜面培养基的pH调至7.0±0.2；

（3）紫外线诱变：将预处理后的孢子悬液转移至灭菌的培养皿中，置于波长为254 nm、功率30 W的紫外灯正下方30cm处，搅拌、避光条件下紫外照射15-90 s；

（5）高产菌株筛选：在完成培养的分离培养基上挑取直径在5 mm以上的单菌落接种到斜面培养基上，在28.0±0.5℃、40%-60%相对湿度的条件下，培养4-8天，菌种成熟后将其接种到种子培养基中，在30.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养24-32 h，菌种成熟后将其接种到发酵培养基中，在30.0±0.5℃、220 rpm的条件下震荡培养3-5天，得到发酵液，测定各发酵液中大观霉素的效价，效价最高的发酵液对应的菌株即为壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01。

3.权利要求2所述大观霉素高产菌株的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中孢子悬液的孢子浓度为10¹²-10¹⁴个/mL。

4.权利要求2所述大观霉素高产菌株的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的分离培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-2.0%可溶性淀粉，0.1-0.3%蔗糖，0.1-0.5%牛肉膏，0.02-0.20%磷酸二氢钾，0.05-0.15%氯化钠，1.8-2.2%琼脂，0.3-1.0%大观霉素，0.2-0.4%的LiCl，其余为水；将分离培养基的pH调至7.0±0.2。

5.权利要求2所述大观霉素高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的种子培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-2.0%葡萄糖，1.0-1.5%酵母粉，2.0-3.0%鱼粉，0.2-0.5%蛋白胨，0.05-0.30%豆油，其余为水；将种子培养基的pH调至 6.8±0.1。

6.权利要求2所述大观霉素高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的发酵培养基，按质量体积比计算，其成分为：2-5%玉米淀粉，2.5-4.0%玉米浆，0.5-2.0%酵母粉，0.5-1.5%葡萄糖，1.0-2.0%鱼粉，0.1-0.5%硫酸铵，0.1-0.5%磷酸二氢钾，0.1-0.5%氯化钾，0.1-0.5%氢氧化钠，0.1-0.5%碳酸钙，0.1-0.3%聚醚消沫剂，0.02-0.10%巴比妥，其余为水；将发酵培养基的pH调节至7.0±0.1。

7.权利要求1所述菌株在大观霉素发酵生产中的应用。

8.根据权利要求8所述菌株在大观霉素发酵生产中的应用，其特征在于：将壮观链霉菌（Streptomyces spectablies）DC15-01接种于斜面培养基，在28.0±0.5℃，相对湿度40%-60%的条件下培养4-8天，菌种成熟后将其转接至种子培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养24-32h，菌种成熟后转接至发酵培养基中，在28.0±0.5℃，220 rpm的条件下震荡培养3-5天，制得含有大观霉素的发酵液。