CN105063121B - 一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基及其优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基及其优化方法，涉及生物制药领域。该发酵培养基由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.0‑3.0％、玉米淀粉3.0‑6.0％、鱼粉0.0‑2.0％、酵母粉0.5‑2.0％、花生饼粉0‑2.0％、生物氮素0‑2.0％、磷酸二氢钾0.05‑0.25％、氯化钾0.01‑0.2％、硫酸铵0.1‑1.0％、巴比妥0.01‑0.05％、碳酸钙0.1‑1.0％，其余为水，pH值6.5‑7.0。本发明所产生的有益效果在于：本发明提供的发酵培养基，大大提高了以链霉菌作为发酵菌株生产大观霉素的能力，对于大观霉素产量的提高效果明显，适用于大规模稳定、高效的发酵生产大观霉素。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基及其优化方法。
背景技术
大观霉素，英文名称Spectinomycin，是由壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)经有氧发酵后生成的次级代谢产物，为氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制能力，尤其对淋病奈瑟菌有高度抗菌活性，对耐青霉素、四环素的淋球菌亦有高度敏感性，对许多肠杆菌科细菌有中度抗菌活性。大观霉素具有杀菌谱广，无过敏现象，副作用小，安全性好等特点。目前，临床上用于治疗淋球菌引起的性病，同时也可用于动物治疗，并能促进动物生长，是良好的动物饲料添加剂。由于大观霉素独特的优点，使其具有良好的社会和环境效益以及广阔的市场前景。
目前关于大观霉素发酵培养基优化的报到较少，于广成等人研究碳源只用淀粉，摇瓶发酵单位由747μg/mL提高到946μg/mL。通过黄豆饼粉和酵母粉组成氮源代替玉米浆和鱼粉，优化后的发酵单位提高到了1520μg/mL(于广成，郭殿武，邵淑田.大观霉素发酵培养基优化.中国医药工业杂志1998,29(12))。专利CN103484509A提出了大观霉素种子罐和发酵罐的培养基中均含有玉米油、麦芽糖、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉，解决了成本的问题，并最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，但是其原材料还是受地域限制，且其培养基中的蚯蚓粉属于动物源性原材料，根据兽用及人用GMP管理规定，其在工业生产中难以实现。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基，实现大观霉素稳定、高效的生产。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基，其特征在于：该发酵培养基由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.0-3.0％、玉米淀粉3.0-6.0％、鱼粉0.0-2.0％、酵母粉0.5-2.0％、花生饼粉0-2.0％、生物氮素0-2.0％、磷酸二氢钾0.05-0.25％、氯化钾0.01-0.2％、硫酸铵0.1-1.0％、巴比妥0.01-0.05％、碳酸钙0.1-1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步的技术方案在于：该发酵培养基的优化组方一由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉2.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步的技术方案在于：该发酵培养基的优化组方二由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉1.0％、花生饼粉1.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步的技术方案在于：该发酵培养基的优化组方三由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉0.5％、生物氮素1.5％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步的技术方案该发酵培养基的优化组方四由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、花生饼粉1.5％、生物氮素1.0％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步的技术方案在于：一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基的优化方法，其特征在于组方一的优化方法如下：在常规培养基，口服葡萄糖1.0-2.0％、玉米淀粉4.0-6.0％、鱼粉0.0-2.0％、酵母粉0.5-1.5％、磷酸二氢钾0.05-0.25％、氯化钾0.01-0.2％、硫酸铵0.1-1.0％、巴比妥0.01-0.05％、碳酸钙0.1-1.0％，其余为水，pH6.5-7.0的基础上，选择葡萄糖和玉米淀粉为碳源，鱼粉和酵母粉为氮源，以磷酸二氢钾为无机盐，通过响应面优化实验，发酵条件为：750mL三角瓶中装液量80mL，接种量10％，在转速220r/min，温度为28℃的恒温摇床中培养103h，测定大观霉素的含量，达到8040U/mL，即得优化组方一。
进一步的技术方案在于：一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基的优化方法，其特征在于组方二的优化方法如下：在优化组方一的基础上，以花生饼粉部分替代鱼粉，确定花生饼粉的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的花生饼粉替代鱼粉，观察随着花生饼粉配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当花生饼粉添加量为1.0％时，大观霉素产量最高，达到8625U/mL，即得优化组方二。
进一步的技术方案在于：一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基的优化方法，其特征在于组方三的优化方法如下：在优化组方一的基础上，以生物氮素部分替代鱼粉，确定生物氮素的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的生物氮素替代鱼粉，观察随着生物氮素配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当生物氮素添加量为1.5％时，大观霉素产量最高，达到8854U/mL，即得优化组方三。
进一步的技术方案在于：一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基的优化方法，其特征在于组方四的优化方法如下：参照配方2和配方3的过程中花生饼粉和生物氮素各自对大观霉素的影响，用组合培养基进行发酵，大观霉素产量达9273U/mL,即得优化组方四。
进一步的技术方案在于：所述培养基的发酵菌株为链霉菌，所述链霉菌为经过紫外和氯化锂复合诱变的链霉菌突变株DC15-01。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明提供的发酵培养基，大大提高了以链霉菌作为发酵菌株生产大观霉素的能力，对于大观霉素产量的提高效果明显，适用于大规模稳定、高效的发酵生产大观霉素。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基，该发酵培养基由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.0-3.0％、玉米淀粉3.0-6.0％、鱼粉0.0-2.0％、酵母粉0.5-2.0％、花生饼粉0-2.0％、生物氮素0-2.0％、磷酸二氢钾0.05-0.25％、氯化钾0.01-0.2％、硫酸铵0.1-1.0％、巴比妥0.01-0.05％、碳酸钙0.1-1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步优选的：该发酵培养基的优化组方一由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉2.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步优选的：该发酵培养基的优化组方二由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉1.0％、花生饼粉1.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步优选的：该发酵培养基的优化组方三由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉0.5％、生物氮素1.5％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步优选的：该发酵培养基的优化组方四由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、花生饼粉1.5％、生物氮素1.0％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0。
进一步优选的：组方一的优化方法如下：在常规培养基，口服葡萄糖1.0-2.0％、玉米淀粉4.0-6.0％、鱼粉0.0-2.0％、酵母粉0.5-1.5％、磷酸二氢钾0.05-0.25％、氯化钾0.01-0.2％、硫酸铵0.1-1.0％、巴比妥0.01-0.05％、碳酸钙0.1-1.0％，其余为水，pH6.5-7.0的基础上，选择葡萄糖和玉米淀粉为碳源，鱼粉和酵母粉为氮源，以磷酸二氢钾为无机盐，通过响应面优化实验，发酵条件为：750mL三角瓶中装液量80mL，接种量10％，在转速220r/min，温度为28℃的恒温摇床中培养103h，测定大观霉素的含量，达到8040U/mL，即得优化组方一。
进一步优选的：组方二的优化方法如下：在优化组方一的基础上，以花生饼粉部分替代鱼粉，确定花生饼粉的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的花生饼粉替代鱼粉，观察随着花生饼粉配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当花生饼粉添加量为1.0％时，大观霉素产量最高，达到8625U/mL，即得优化组方二。
进一步优选的：组方三的优化方法如下：在优化组方一的基础上，以生物氮素部分替代鱼粉，确定生物氮素的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的生物氮素替代鱼粉，观察随着生物氮素配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当生物氮素添加量为1.5％时，大观霉素产量最高，达到8854U/mL，即得优化组方三。
进一步优选的：组方四的优化方法如下：参照配方2和配方3的过程中花生饼粉和生物氮素各自对大观霉素的影响，用组合培养基进行发酵，大观霉素产量达9273U/mL,即得优化组方四。
进一步优选的：所述培养基的发酵菌株为链霉菌，所述链霉菌为经过紫外和氯化锂复合诱变的链霉菌突变株DC15-01。
实验菌种为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)DC15-01，其保藏号CGMCCNO.6221，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年06月14日。
(一)确定常规培养基的最适实施例1：在常规培养基(口服葡萄糖1.0-2.0％、玉米淀粉4.0-6.0％、鱼粉0.0-2.0％、酵母粉0.5-1.5％、磷酸二氢钾0.05-0.25％、氯化钾0.01-0.2％、硫酸铵0.1-1.0％、巴比妥0.01-0.05％、碳酸钙0.1-1.0％，pH6.5-7.0)的基础上，选择葡萄糖和玉米淀粉为碳源，鱼粉和酵母粉为氮源，以磷酸二氢钾为无机盐，通过响应面优化实验，观察大观霉素的产量，进行常规培养基配方选择。
发酵条件为：750mL三角瓶中装液量80mL，接种量10％，在转速220r/min，温度为28℃的恒温摇床中培养103h，测定大观霉素的含量。
响应面优化实验完成后，确定常规的培养基实施例1各组分最适配比为：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉2.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH6.5-7.0。
用实施例1进行发酵，大观霉素产量为8040U/mL。
(二)确定花生饼粉培养基的最适实施例2：在实施例1的基础上，以花生饼粉部分替代鱼粉，确定花生饼粉的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的花生饼粉替代鱼粉，观察随着花生饼粉配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当花生饼粉添加量为1.0％时，大观霉素产量最高，达到8625U/mL。
因此，实施例2各组分的配比为：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉1.0％、花生饼粉1.0％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH6.5-7.0。
(三)确定生物氮素培养基的最适实施例3：在实施例1的基础上，以生物氮素部分替代鱼粉，确定生物氮素的最适添加量，分别以0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％共6个水平的生物氮素替代鱼粉，观察随着生物氮素配比在配方中的变化对大观霉素产量的影响，最后确定当生物氮素添加量为1.5％时，大观霉素产量最高，达到8854U/mL。
因此，实施例3各组分的配比为：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、鱼粉0.5％、生物氮素1.5％、酵母粉1.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH6.5-7.0。
(四)确定在实施例1中同时添加花生饼粉和生物氮素培养基的最适实施例4：参照实施例2和实施例3的过程中花生饼粉和生物氮素各自对大观霉素产量的影响，设计L9(34)正交实验表，4个影响因素分别为：花生饼粉(因素A)、生物氮素(因素B)、酵母粉(因素C)、鱼粉(因素D)，它们的添加水平分别如表1所示。
表1四因素三水平L9(34)正交实验表
| 影响因素 | 水平1(％) | 水平2(％) | 水平3(％) |
| 花生饼粉(因素A) | 0.5 | 1 | 1.5 |
| 生物氮素(因素B) | 1.0 | 1.5 | 2 |
| 酵母粉(因素C) | 1 | 1.2 | 1.5 |
| 鱼粉(因素D) | 0 | 1 | 2 |
从实验结果可知，用A3B1C1D1组合培养基进行发酵，大观霉素产量达9273U/mL，产量最高，因此实施例4的最佳组分配比为：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、花生饼粉1.5％、生物氮素1.0％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH6.5-7.0。
目前常规大观霉素的产量与本发明实施例1-4的数据对比如下标所示：
本发明提供的发酵培养基，大大提高了以链霉菌作为发酵菌株生产大观霉素的能力，对于大观霉素产量的提高效果明显，适用于大规模稳定、高效的发酵生产大观霉素。
Claims (1)
1.一种用于提高大观霉素产量的发酵培养基，其特征在于：
该发酵培养基的优化组方由下述重量％数的物质配比而成：口服葡萄糖1.5％、玉米淀粉5.0％、花生饼粉1.5％、生物氮素1.0％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钾0.2％、硫酸铵0.5％、巴比妥0.05％、碳酸钙1.0％，其余为水，pH值6.5-7.0；
所述培养基的发酵菌株为链霉菌，所述链霉菌为经过紫外和氯化锂复合诱变的链霉菌突变株DC15-01。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |