CN101748093B - 壮观链霉菌SpLE-16及其在生产大观霉素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株可生产大观霉素的新菌株——壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)SpLE-16及其应用。所述壮观链霉菌SpLE-16保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏编号CCTCCNo：M 2010018。本发明菌株在优化条件下培养生产大观霉素，产大观霉素水平达到8000U/L；本发明菌株具有遗传稳定性好，产量性状稳定，大观霉素保持较高水平，且所需原料便宜易获取，适合于工业化生产大观霉素。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株可生产大观霉素的新菌株——壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)SpLE-16及其应用。
(二)背景技术
大观霉素(Spectinomycin)，又名壮观霉素，是上世纪六十年代发现的一种由壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)产生的广谱性氨基环醇类抗生素，其对多数的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有活性，并对由这些细菌引起的感染效果较好。临床上大观霉素对肺炎杆菌、流感杆菌、支原体均有较好的抑制作用，特别是对淋球菌的效果较佳，因此临床上作为特效药用于治疗由淋球菌引起的尿路感染、尿道炎、子宫颈炎、直肠炎等疾病。除此之外，大观霉素由于具有低毒性和广谱性，而作为饲料添加剂用于畜牧业养殖。最近几年大观霉素也逐渐地应用于农业病害如由Xanthomonas菌引起的梨子枯萎病、Xanthomonscitri引起的柑橘癌肿病和Xanthomonas oryzae引起的水稻枯叶病的防治。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种生产大观霉素的菌株及利用该菌株生产大观霉素的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种生产大观霉素的菌株——壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)SpLE-16，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏编号CCTCC No：M 2010018。
所述菌株具有大观霉素、链霉素、乙硫氨酸抗性，所述菌株对大观霉素的抗性浓度为5500～6000U/L，链霉素的抗性浓度为80～100U/L，乙硫氨酸的抗性浓度为100～400mg/L。
本发明的大观霉素生产菌株可以这样得到：出发菌株经过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(简称‘亚硝基胍’、NTG)、60Coγ-射线诱变处理，将诱变处理后的孢子涂布于不同抗性药物的抗性平板上，经过继代培养后获得不同药物的抗性突变菌株。不同抗性突变菌株之间通过多轮的基因组重排育种，通过菌落对峙法初筛、生物效价法复筛高产的突变菌株。用于筛选的出发菌株为实验室筛选保藏的壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)，用于筛选的抗性标记药物有乙硫氨酸、链霉素、大观霉素。
本发明菌株由如下方法获得：
一、菌株的诱变方法：
(1)出发菌株：壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)(菌落红色、中间皱褶隆起，大观霉素抗性为1500U/L)。
(2)60Coγ-射线诱变：壮观链霉菌原始菌株经自然分离的平板用1KGy60Coγ射线，垂直距离1m照射1h。取诱变后平板一小块菌体置于含无菌生理盐水和玻璃珠的50mL三角瓶中，打散成单细胞悬浮液后稀释成10-1、10-2、10-3三个浓度，各取0.2mL涂布于大观霉素5000、5500、6000U/L的抗性平板上，倒置平板于28℃培养3d，挑单菌落在同等条件下进行继代培养5代后进行复筛抗性稳定的菌株。得到诱变菌株Sp-40，大观霉素抗性为4000U/L，在抗性平板上菌落无色，中间凸起无皱褶。
(3)亚硝基胍诱变：在大观霉素4000U/L的抗性斜面上培养壮观链霉菌菌株Sp-40 6d，生理盐水5mL洗涤培养斜面，剧烈振荡后得到菌株Sp-40分生孢子，离心浓缩孢子悬液制成孢子浓度为108的孢子悬液。孢子悬液在生理盐水中培养3～5h后涂平板，培养基配方为：牛肉膏0.1％，可溶性淀粉2.0％，K2HPO4 0.05％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.05％，FeSO4.7H2O 0.001％，胰蛋白胨0.2％，pH 7.2(上述百分比浓度为质量体积百分比，下同。某组分浓度1％表示100mL培养基中含有1g该物质)。置于待涂布平板于安全柜中，待培养基表面干燥后进行亚硝基胍诱变。具体操作方法可参考(沈萍，陈向东，微生物学实验，高等教育出版社)。诱变后处理的突变菌株分别涂布于链霉素(80、100U/L)和乙硫氨酸(250、400mg/L)的抗性平板上。抗性菌株在链霉素、乙硫氨酸抗性平板上经过连续的5代继代培养，获得链霉素抗性菌株SpL-12、SpL-30、SpL-38三个菌株(在抗性平板上菌落为暗红色，中间凸起无皱褶，边缘不规则)；获得乙硫氨酸抗性菌株SpE-8和SpE-15(抗性平板上菌落为鲜红色，中间凸起，边缘梅花状散开)。
(4)基因组重排改良：分别培养SpL-12、SpL-30、SpL-38、SpE-8和SpE-15菌株于S培养基(配方为：酵母膏0.4％，葡萄糖1.0％，蛋白胨0.4％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.2％，K2HPO4 0.4％，pH7.0)，培养温度为30℃、180rpm、黑暗培养20～36h，离心收集菌丝体，用1.5mg/L的溶菌酶高渗缓冲液35℃下处理20min，用高渗P溶液(蔗糖103g，K2SO4 0.25g，MgCl2.6H2O 2.02g，微量元素溶液2mL(1L微量元素溶液中含有ZnCl2 40mg，FeCl3.6H2O 200mg，CuCl2.2H2O 10mg，MnCl2.4H2O10mg，Na2B4O7.10H2O 10mg，(NH4)6Mo7O24.4H2O 10mg)用蒸馏水定容至800mL，然后分装成80mL/瓶于121℃灭菌20min。使用前每瓶加入灭好菌的KH2PO4(0.5％)1mL，CaCl2·2H2O(3.68％)10mL，TES缓冲液(2％Tris，调节pH7.2)10mL。)洗涤原生质体3次，等分量混合SpL-12、SpL-30、SpL-38、SpE-8和SpE-15的原生质体(每个菌体原生质数量为108)，于35％M3500的PEG促融合。融合子涂布于大观霉素3500U/L、链霉素80U/L和乙硫氨酸200mg/L的抗性平板上，30℃、黑暗培养5～7天后挑选抗性菌株。在抗性平板上继代3代后，抑菌圈法初步评价抗性菌株的抑菌能力[以藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)为指示菌]，筛选5株抑菌能力最强的菌株制备抗性菌株的原生质体，进行新的一轮菌株间的原生质体融合(原生质体制备和融合方法与前面相同)。如此进行连续的4轮原生质体融合，获得稳定的抗性菌株，经过初筛、摇瓶发酵复筛获得高产大观霉素的抗性菌株SpLE-16、SpLE18、SpLE-3。
关于菌株诱变方法，现有技术中，采用物理化学诱变后筛选突变菌株的标记比较单一，如：
1)刘伟，大观霉素优良菌株的培养，赤峰学院学报，2005，21(5)：87～88；
2)于广成，王建华，邵淑田，壮观霉素自身耐药高产菌株的选育，中国医药工业杂志，1994，25(2)：58～61；
3)韩香玲，曲音波，孙树申，张焕青，大观霉素高产菌株的选育，华中农业大学学报，2005，24(5)：474～476；
4)王宏斌，邵素兰，原生质体-再生技术在大观霉素菌种选育中的应用，中国抗生素杂志，2003，28(11)：696-697
本发明诱变方法具有以下优点：1，采用多种药物的多重抗性为目标，筛选出的突变菌株稳定性好，在大观霉素生产中不易产生回复突变而造成大观霉素的产量下降；2，第一次采用物理化学等传统诱变与先进的基因组重排技术改良大观霉素的生产菌种——壮观链霉菌。
二、高产菌株发酵培养基的优化筛选：
种子培养基：鱼粉0.5％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.2％，用NaOH调pH至7.2，115℃灭菌30min；
种子培养时装液量为30mL/250mL的三角瓶，培养温度为28～30℃，摇瓶转速为180rpm。
筛选培养基：
碳源选择：通过单因素实验结果表明糊精、玉米浆、可溶性淀粉3种碳源较佳；
氮源选择：通过单因素实验结果表明酵母膏、鱼粉、棉子粉3种氮源较好；
现有技术中，用响应面优化大观霉素的发酵培养基，得到最优培养基为：葡萄糖15.7g/L，淀粉40g/L，酵母粉10.7g/L，玉米浆41.2g/L，鱼粉4.0g/L，KH2PO4 1.5g/L，KCl 1.5g/L，CaCO3 2.0g/L，pH为7.2～7.4；大观霉素的最高产量为1741U/L。
本发明同样以响应面优化，根据爬坡实验和中心组合实验优化的最佳培养基为：黄豆粉10～50g/L，玉米浆05～30g/L，酵母粉20～50g/L，CaCl2 0.1～20g/L，糊精15～50g/L，可溶性淀粉40～80g/L，KH2PO40.1～7g/L，KCl 0.1～5g/L，CaCO3 2～10g/L，pH为7.2～7.4；最终得到大观霉素的产量为8400U/L。
按照本发明，可以通风发酵的方式培养合适的微生物进行大观霉素的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。将菌株以10～15％(v/v)接种量转接到发酵培养基中，培养温度为28～30℃，摇床转速为180～200rpm，pH 7.2～7.4，培养时间为96～110h。
本发明还涉及所述的壮观链霉菌SpLE-16在生产大观霉素中的应用。
具体的，所述应用为：将壮观链霉菌SpLE-16接种至适用于壮观链霉菌的发酵培养基，pH 6.0～8.0、28～32℃培养时间96～110小时，于发酵液中获得所述大观霉素。
优选的，所述适用于壮观链霉菌的发酵培养基终浓度组成如下：黄豆粉10～50g/L，玉米浆5～30g/L，酵母粉20～50g/L，CaCl2 0.1～20g/L，糊精15～50g/L，可溶性淀粉40～80g/L，KH2PO4 0.01～7g/L，KCl0.01～5g/L，CaCO3 2～10g/L，pH 7.2～7.4。
本发明的有益效果主要体现在：本发明菌株在优化条件下培养生产大观霉素，产大观霉素水平达到8000U/L；本发明菌株具有遗传稳定性好，产量性状稳定，大观霉素保持较高水平，且所需原料便宜易获取，适合于工业化生产大观霉素。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
菌株：壮观链霉菌SpLE-16；
种子培养基：鱼粉5g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨2g/L，用NaOH调pH至7.2，115℃灭菌30min；
发酵培养基：黄豆粉15g/L，玉米浆13g/L，酵母粉20g/L，CaCl25g/L，糊精30g/L，可溶性淀粉50g/L，KH2PO4 3g/L，KCl 2g/L，CaCO34g/L，pH为7.2；
种子培养基装液量为30mL/250mL的三角瓶，接入壮观链霉菌SpLE-16菌种，培养温度为28～30℃，摇瓶转速为180rpm培养24h，得种子液。
制取发酵培养基500mL，分装20个250mL的三角瓶中，以10％体积比接种种子液，30℃，180rpm，黑暗培养105h后，10000rpm离心除去菌丝体，发酵液进行检测，以大观霉素标样为对照，测定发酵液中大观霉素的生物学效价为8020U/L。
实施例2：
菌株：壮观链霉菌SpLE-18；
种子培养基：鱼粉5g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨2g/L，用NaOH调pH至7.2，115℃灭菌30min；
发酵培养基：黄豆粉15g/L，玉米浆13g/L，酵母粉20g/L，CaCl25g/L，糊精30g/L，可溶性淀粉50g/L，KH2PO4 3g/L，KCl 2g/L，CaCO34g/L，pH为7.2；
种子培养基装液量为30mL/250mL的三角瓶，接入壮观链霉菌SpLE-16菌种，培养温度为28～30℃，摇瓶转速为180rpm培养24h，得种子液。
制取发酵培养基500mL，分装20个250mL的三角瓶中，以10％体积比接种种子液，30℃，180rpm，黑暗培养105h后，10000rpm离心除去菌丝体，发酵液进行检测，以大观霉素标样为对照，测定发酵液中大观霉素的生物学效价为7900U/L。
实施实例3：
菌株：壮观链霉菌SpLE-16；
种子培养基：鱼粉15g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨2g/L，用NaOH调pH至7.2，115℃灭菌30min；
发酵培养基：黄豆粉10g/L，玉米浆20g/L，酵母粉25g/L，CaCl2 5g/L，糊精30g/L，可溶性淀粉60g/L，KH2PO4 3g/L，KCl 2g/L，CaCO34g/L，pH为7.2；
种子培养基装液量为30mL/250mL的三角瓶，接入壮观链霉菌SpLE-16菌种，培养温度为28～30℃，摇瓶转速为180rpm培养24h，得种子液。
制取发酵培养基500mL，分装20个250mL的三角瓶中，以10％体积比接种种子液，30℃，180rpm，黑暗培养105h后，10000rpm离心除去菌丝体，发酵液进行检测，以大观霉素标样为对照，测定发酵液中大观霉素的生物学效价为8400U/L。
实施例4：
菌株：壮观链霉菌SpLE-3；
种子培养基：鱼粉15g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨2g/L，用NaOH调pH至7.2，115℃灭菌30min；
发酵培养基：黄豆粉10g/L，玉米浆20g/L，酵母粉25g/L，CaCl25g/L，糊精30g/L，可溶性淀粉60g/L，KH2PO4 3g/L，KCl 2g/L，CaCO34g/L，pH为7.2；
种子培养基装液量为30mL/250mL的三角瓶，接入壮观链霉菌SpLE-16菌种，培养温度为28～30℃，摇瓶转速为180rpm培养24h，得种子液。
制取发酵培养基500mL，分装20个250mL的三角瓶中，以10％体积比接种种子液，30℃，180rpm，黑暗培养105h后，10000rpm离心除去菌丝体，发酵液进行检测，以大观霉素标样为对照，测定发酵液中大观霉素的生物学效价为7890U/L。
Claims (4)
1.一种生产大观霉素的菌株——壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)SpLE-16，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏编号CCTCCNo：M 2010018。
2.如权利要求1所述的壮观链霉菌SpLE-16在生产大观霉素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将壮观链霉菌SpLE-16接种至适用于壮观链霉菌的发酵培养基，pH 6.0～8.0、28～32℃培养时间96～110小时，于发酵液中获得所述大观霉素。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述适用于壮观链霉菌的发酵培养基终浓度组成如下：黄豆粉10～50g/L，玉米浆5～30g/L，酵母粉20～50g/L，CaCl20.1～20g/L，糊精15～50g/L，可溶性淀粉40～80g/L，KH2PO40.01～7g/L，KCl 0.01～5g/L，CaCO32～10g/L，pH7.2～7.4。
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