CN102212020B - 一种新的氧肟酸类嗜铁素及其在病害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的嗜铁素及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。本发明的氧肟酸类嗜铁素是从一株植物生长促生细菌恶臭假单胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas putida)中经有机溶剂提取、萃取、经常规柱色谱和高效液相色谱分离得到，它对农业病害具有一定的防治作用，因此可以用于制备新型生物农药。

Description

一种新的氧肟酸类嗜铁素及其在病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及一种新的嗜铁素，具体涉及一种氧肟酸类嗜铁素的制备方法及其在黄瓜枯萎病中的应用。

背景技术

利用有益菌进行病虫害防治，已是目前研究的一个热点问题，至今已有多种菌株成功地被开发成产品并得到推广。它们在病虫害防治中的重要地位来自他们固有的一些属性。假单胞杆菌(Peudomonas spp.)是一类得到广泛研究的生防细菌，这类细菌能产生特殊物质嗜铁素，而分泌嗜铁素是其控制真菌病害的一种主要机制，因而成为科研工作者研究的热点对象。嗜铁素是一类小分子量(500～1000Da)能特异地螯合Fe³⁺的螯合因子，绝大多数细菌和真菌都能通过非核糖途径合成分泌一种或几种嗜铁素，它的产生是地球上微生物适应地壳高氧低铁环境的结果。嗜铁素按照它的螯合基团的化学特性可分为三大类：一类为氧肟酸类(hydroxamate)嗜铁素、一类为儿茶酚类(catechol)嗜铁素、还有一类为混合型(mixed ligand)嗜铁素，有的报道称其为α-羟基羧酸(α-hydroxycarboxylic)(也称作柠檬酸型)。关于嗜铁素的研究，国内外目前仍处于基础性研究阶段。其提纯和结构分析方面的研究起步较早，而国内却鲜见报道，迄今为止，人们已经发现500多种化学结构不同的嗜铁素。目前，国内外对嗜铁素的研究主要集中在其所参与的生防活动。例如，许煜泉(1999)对生防菌Peudomonas sp.JKD-2在低铁条件下抑制稻瘟菌的生长的研究验证了嗜铁素铁竞争这一抗病性功能。陈双雅(2003)和陈旋(2006)研究中提到嗜铁素的抗生作用，即嗜铁素直接通过抑制病原菌来起到控制病害目的。MarlaGuineth(2000)也提到嗜铁素的抗生作用。冉隆贤(2005)通过对嗜铁素缺失突变体控制桉树灰霉病的研究提到了嗜铁素对病害的诱导抗性作用。Vanpeer R(1992)，Leeman M(1996)和V.Ramamoorthy(2000)也提到嗜铁素的诱导作用。此外，嗜铁素近年来还探索应用于医药等领域^[18]。总之，嗜铁素的功能是多样的，它不但是依赖受体的高亲和性的铁转运系统，还是生长因子或萌发因子，也可以是抗生素或毒力因子。由此可见，嗜铁素是一种很有开发和利用价值的新型生物活性物质。

发明内容

本发明的目的是从恶臭假单胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas putida)(菌株HZ-2，是本发明人于2008年3月分离自浙江省杭州市多年种植蔬菜的杭州下沙乔司监狱旁的大棚，经鉴定属于恶臭假单胞菌)中分离出新的具有实用价值嗜铁素和该化合物的制备方法，及其在防治植物病害，特别是防治黄瓜枯萎病中的应用。恶臭假单胞菌的从不同地地域采的菌株也可以得到此类新物质。

一方面，本发明提供一种异羟肟酸类型嗜铁素，具有如下结构：

本发明的异羟肟酸类型嗜铁素从植物促生细菌恶臭假单胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas putida)中分离得到的，其结构式由通式表示(如下图)：

另一方面，本发明还提供一种新氧肟酸类型嗜铁素的制备方法，包括以下的步骤：

(1)、发酵液体的准备：菌种恶臭假单胞菌HZ-2在固体KMB培养基上活化24h后，挑取单菌落接入5mL液体KMB培养基中，置于摇床中，28℃，150r/分钟条件下培养24h，然后接种到固体种子培养基KMB中，在28℃下培养24h，得到一级种子；然后将培养好的一级种子挑取一环，在MKB培养基中发酵，其中以上所有用到固体或液体KMB培养基在1000毫升体积下成分包括：酪蛋白氨基酸5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g，Fe³⁺的含量为0.1mg/L。

(2)、收集步骤(1)中发酵液1000mL旋转蒸发(43℃)浓缩成稍粘稠液体，离心去除白色不溶物，上清液用HCl将pH调至4备用；

(3)、把步骤(2)中得到的上清液样品上到大孔吸附树脂柱后液体浓缩后用CAS检测液检查，不显示活性，再用不同极性的洗脱液依次洗脱，对洗脱液进行减压浓缩后，测定活性，其中不同极性的依次洗脱的洗脱液为：离子水、0.2％盐酸溶液、10％甲醇-水溶液、30％甲醇-水溶液、50％甲醇-水溶液、80％甲醇-水溶液、100％甲醇、100％丙酮溶液洗脱。

优选的，将步骤(3)洗脱的样品用HPLC分离，分离的条件为：材料ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：30％甲醇-水溶液洗脱30分钟。

更优选的、HPLC分离的条件为：材料：ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：5-60％甲醇-水进行梯度洗脱30分钟；检测器：UV210nm；

其中实验过的分离条件为：材料：ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：10％甲醇-水；100％甲醇；5-60％甲醇-水(30分钟)；5-40％甲醇-水(30分钟)；10-30％甲醇-水(60分钟)；5-15％甲醇-水(30分钟)；10-40％甲醇-水；10-30％甲醇-水(30分钟)；10-30％甲醇-水(30分钟)；检测器：UV210nm。最终选取合适的条件：材料：ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：30％甲醇-水溶液(30分钟)下分离得到的活性组分20mg进行进一步分离。

优选的，在步骤(1)之后还对发酵液进行CAS测试液检测。发酵液浓缩后，加入同等体积的CAS检测液，呈明显橙红色，证明发酵液中富含有嗜铁素。然后进行Arnow Assay试验：分析结果溶液显黄色因此初步确定发酵液可能含氧肟酸类型嗜铁素。

优选的，在步骤(1)中的方法中发酵培养基先要用1g8-羟基喹啉处理除去痕量铁。

优选的，在步骤(6)中的方法中，高效液相色谱仪是大连依利特P230型配备UV-230紫外可见检测器，其中ODS柱型号ODS-BP，尺寸是200×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司。

最佳的，本试验使用到的玻璃器皿均用浓盐酸溶液浸泡1昼夜，然后用去离子水清洗。避免使用铁制器械。

另一方面，本发明提供一种微生物农药试剂，包括一种氧肟酸类型嗜铁素，该氧肟酸类型嗜铁素的结构如下：

有益效果

本发明操作简单，所得到的新氧肟酸类型嗜铁素属微生物代谢产物具有毒性低，易在自然界降解等优点，可以作为微生物农药开发的新型化合物，因而具有良好的应用前景。特别是针对植物病害，例如黄瓜枯萎病的防治农药。

附图说明

图1为分离纯化步骤图；

图2：为用HPLC分离在初步洗脱条件下的活性组分出峰时间图，其中材料为：ODS-BP；柱长：200mm；检测器：UV 210nm；柱径：4.6mm；进样量：100μl，流速：1ml/分钟；流动相：5-60％甲醇-水，梯度洗脱30分钟；

图3：为用HPLC分离在初步洗脱条件下的活性组分出峰时间图，其中材料为：材料：ODS-BP；柱长：200mm；检测器：UV 210nm；柱径：4.6mm；进样量：100μl；流速：1ml/分钟；流动相：10％甲醇，梯度洗脱30分钟；

图4：为用HPLC分离在调整洗脱条件下的活性组分出峰时间图，其中材料：ODS-BP柱长：200mm  检测器：UV 210nm柱径：4.6mm  进样量：60μl；流速：1ml/分钟；流动相：10-40％甲醇，梯度洗脱30分钟；

图5：为用HPLC分离在调整洗脱条件下的活性组分出峰时间图，其中材料材料：ODS-BP；柱长：200mm；检测器：UV 210nm；柱径：4.6mm进样量：100μl；流速：1ml/分钟；流动相：5-30％甲醇，梯度洗脱30分钟；

图6：HPLC分离精制结果的时间图：材料：ODS-BP；柱长：200mm检测器：UV 210nm；柱径：4.6mm；进样量：40μl；流速：1ml/分钟；流动相：5-30％梯度洗脱30分钟。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1

1.实验所有仪器和设备

UV：Jasco V550紫外分光光度计

IR：JascoFT-IR4100红外光谱仪

核磁：BRUCKER AVANCE DMX500型超导核磁共振仪

质谱：ESI-MS：HP5989B型质谱仪

APEX III 7.0傅里叶变换离子回旋共振质谱仪

Satorius BSA124S电子天平       北京赛多利斯天平有限公司

低温高速离心机                 BECKMAN

高效液相色谱                   伊利特

溶剂：均为市售AR级             天津市永大化学试剂有限公司

柱层析：LS610大孔吸附树脂      浙江省农科院

ODS反相硅胶                    北京慧德易科技有限公司

反相高效薄层层析板             Merk公司

显色剂：紫外灯，碘缸，磷钼酸显色剂

本试验使用到的玻璃器皿均用浓盐酸溶液浸泡1昼夜，然后用去离子水清洗。避免使用铁制器械。

实施例1：嗜铁素的制备

具体参见说明书附图1。

(1)、发酵培养。以MKB培养基作为富产嗜铁素的发酵培养基，恶臭假单胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas putida)作为发酵菌种，发酵培养起始pH值调到6.5，在摇床中28℃，150r/分钟条件下培养48h，得到发酵培养液。适合我们所用菌种恶臭假单胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas putida)的嗜铁素分泌的最佳培养条件是：pH值为6.5，接种量为2％，发酵时间为48h，装瓶量为50/150mL。其中培养基为改进的MKB培养基，其包括：酪蛋白氨基酸5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g，Fe³⁺的含量为0.1mg/L，蒸馏水定容到1000mL。

其中常用的MKB培养基的基本成分为：酪蛋白氨基酸5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，K₂HPO₄·3H₂O2.5g，甘油15mL，蒸馏水定容到1000mL，pH值7.2，但在本发明中我们发现，培养基中不加甘油，所产的嗜铁素的量比加甘油的要多，嗜铁素产生量能增加10％，另外在培养基中也加入微量的Fe³⁺，并使其最终浓为0.1mg/L，这样更容易产生嗜铁素，嗜铁素产生量增加17％(具体实验数据略)。

(2)、嗜铁素制备前检测。先进行CAS测试液检测：取1mL发酵液浓缩至100μL，加入铬天青(CAS)(杭州市常青化工有限公司购买)检测液100μL，呈明显橙红色，证明发酵液中富含有嗜铁素。然后进行Arnow分析试验：取1mL发酵液浓缩至100μL后，依次加入100μL0.5N盐酸溶液，和100μL亚硝酸钠-钼酸钠混合液，溶液显黄色，继续加入100μL 1N的氢氧化钠溶液，颜色仍然呈黄色，因此初步确定发酵液可能含氧肟酸类型嗜铁素。

(3)、发酵液的分离纯化。收集1000mL发酵培养基，旋转蒸发(43℃)浓缩成稍粘稠液体后，离心(10000rpm，4℃，15分钟)去除白色不溶物，上清液用HCl将pH调至4备用，将该提取物进行大孔吸附树脂柱(LS610)层析(LS610大孔吸附树脂提前用饱和食盐水浸泡，5％盐酸冲洗，浸泡过夜，去离子水冲洗pH7，无水乙醇冲洗，去离子水冲洗至无乙醇味)，上大孔吸附柱后液体浓缩后用CAS检测液检查，不显示活性。用不同极性的洗脱液依次洗脱：依次用去离子水、0.2％盐酸溶液、10％甲醇-水溶液、30％甲醇-水溶液、50％甲醇-水溶液、80％甲醇-水溶液、100％甲醇、100％丙酮溶液洗脱。减压浓缩后，得到活性组分(30％甲醇-水溶液部位)50mg，再用CAS检测液检查，测定活性。

根据ODS反相板层析结果，对活性组分进行进一步开放ODS柱分离，以反相硅胶作填料。活性组分(甲醇-水溶液部份)50mg进一步分离得到活性组分20mg。

(4)、HPLC分离。最后，根据各活性组分紫外波长(200-600nm)波长扫描结果，HPLC分离情况及CAS检测结果，确定分离条件，选取活性组分(30％甲醇-水溶液部位)分离得到的活性组分(20％甲醇-水溶液部位)20mg进行进一步分离。其HPLC初步分离结果如图1所示：

首先，根据紫外波长(200-600nm)波长扫描结果和反相薄层层析结果，通过不同甲醇-水洗脱体系进行洗脱(材料：ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：5-60％甲醇-水进行梯度洗脱(图2)和10％甲醇-水进行进行梯度洗脱(图3)；检测器：UV210nm)，回收样品，初步确定高效液相活性组分出峰时间，如图2、图3中箭头所示。

其次，根据高效液相活性组分的初步洗脱情况，对洗脱液甲醇-水比例进行了调节(材料：ODS-BP；流速：1ml/分钟；流动相：10-40％甲醇-水进行梯度洗脱(图4)，5-30％甲醇-水进行梯度洗脱(图5)；检测器：UV210nm)，确定了活性组分高效液相分离洗脱液比例。活性组分如箭头所示，与其他组分较明显分离。如图4和图5所示。

最后，按照所确定的最佳洗脱剂比例(5-30％甲醇-水进行梯度洗脱)，采用分析柱多次进样累积回收对活性组分分别进行分离累积，最后得到纯的活性组分，如图6箭头所指活性组分出峰。

实施例2：嗜铁素化合物的结构鉴定和数据归属

化合物为浅黄色固体，Mp：239-240℃(分解)。在甲醇中难溶解，易溶于水，且CAS检测液检测显示与对照的CAS检测液有颜色变化，RP-18反相薄层层析板上点样展开，反相薄层层析碘缸显色为黄棕色。说明可能为hydroxymates类型铁载体。

分子式：C20H23N4O5

¹HNMR谱给出9组峰，其积分比(由低场至高场)为4∶2∶4∶2∶1∶1∶1∶2∶2。

a δ3.11，3.27都为dd峰，分别相当于2个质子，二者有相同的偶合常数(J＝14.5)，同时¹H-¹H COSY谱表明二者具有相关性，因此δ3.11、δ3.27氢质子峰归属为2个H-7和2个H-14。

b δ3.53，3.63都为dd峰，分别相当于1个质子，二者有相同的偶合常数(J＝11.5)，同时¹H-¹H COSY谱表明二者具有相关性，因此δ3.53、δ3.63氢质子峰归属为H-11和H-11。

c δ3.76为多重峰，由于化合物量少影响氢谱积分，约相当于1个质子，同时¹H-¹H COSY谱表明与δ3.53、δ3.63具有相关性，因此δ3.76处氢质子峰可归属为H-10。

d δ3.97为四重峰，分别相当于2个质子，与δ3.27、δ3.11有相同的偶合常数(J＝5.0、J＝8.0)，同时¹H-¹H COSY谱表明三者具有相关性，因此δ3.97处氢质子峰可归属为H-8和H-13。

e δ7.41，7.36都为三重峰，δ7.31为二重峰，分别相当于4个质子、2个质子和4个质子，而且三者偶合常数相同，¹H-¹H COSY谱表明δ7.41峰与δ7.36，7.31处氢质子峰相关，因此可将δ7.41氢质子峰归属为H-2，H-4，H-17，H-19，δ7.36氢质子峰归属为H-3，H-18，δ7.31氢质子峰归属为H-1，H-5，H-16，H-20。

f  样品的¹HNMR谱与可能化合物的结构基本相符。

样品的¹³CNMR中共有9个峰，可能为一结构对称分子，对应于分子中20个碳原子，与分子式中的碳原子数相符。

a δ176.6为羰基碳原子峰，HSQC谱表明无相关质子峰，因此此峰可归属为C-9，C-12位羰基碳峰。

b δ137.8，132.0，131.8，130.4可能为苯环碳原子峰，HSQC谱表明δ137.8无相关质子峰，HSQC谱表明δ132.0，131.8，130.4分别跟¹HNMR δ7.41，7.31，7.36质子峰相关，因此δ137.8，132.0，131.8，130.4碳原子峰可归属为苯环上C-6，C-15，C-2，C4，C-17，C-19，C-1，C5，C-16，C-20，C-3，C-18碳原子峰。

c δ74.7碳原子DEPT135°谱表明为叔碳峰，与δ3.76质子峰相关，HMBC谱表明与¹HNMR3.63，3.53质子峰相关，且与¹HNMR其他质子H无相关峰，因此δ74.7碳原子峰可归属为C-10碳原子峰。

d δ65.2碳原子HSQC谱表明与¹HNMR3.63，3.53质子峰相关，且3.63，3.53质子峰为dd峰，而与¹HNMR其他质子H无相关峰，因此δ65.2碳原子峰可归属为C-11碳原子峰。

e δ58.7可能为与氨基相连碳原子峰，HSQC谱表明δ58.7跟¹HNMR δ3.97质子峰相关，¹HNMR δ3.97为四重峰，HMBC谱表明与¹HNMR δ3.27，3.21质子峰相关，因此δ58.7碳原子峰可归属为C-8，C-13碳原子峰。

f δ39.0可能为与苯环相连苄位碳原子峰，HSQC谱表明δ39.0跟¹HNMR δ3.27，3.21质子峰相关，¹HNMR δ3.27，3.21为dd峰，HMBC谱表明与¹HNMR δ3.97，7.31质子峰相关，因此δ39.0碳原子峰可归属为C-7，C-14碳原子峰。

g 根据¹³CNMR，HSQC，HMBC谱可见样品的碳原子数及其类型与可能化合物的分子结构基本相符，可能为该化合物。

表1样品的¹HNMR测定数据

(D₂O；内标：3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠盐(4，4-二甲基-4-硅杂戊-1-磺酸钠DSS)

表2样品的¹³CNMR测定数据

(D₂O；内标：3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠盐(4，4-二甲基-4-硅杂戊-1-磺酸钠DSS)

ESI-Ms m/z：401[M-1]，M＝402。

根据化合物红外光谱：3431cm^-1为OH的伸缩振动峰，而且峰型宽，说明分子中有缔合型OH，3406cm^-1有吸收峰，为NH₂的伸缩振动峰，3033cm^-1有吸收峰，为苯基C-H的伸缩振动峰，2962cm^-1有吸收峰，为烷基C-H的伸缩振动峰，1625cm^-1有吸收峰，为酰胺羰基的伸缩振动峰，1564cm^-1为苯环结构的C＝C伸缩振动峰，1459cm^-1吸收峰表明有-CH2-的吸收，747cm^-1，700cm^-1两个吸收带证明为一元取代苯。

表3样品红外光谱测定数据

质谱可能裂解途径：

m/z：330可能为两个稳定的苯丙氨酸分子离子峰碰撞生成。

样品在中性溶液(水)中的紫外吸收λ＝254nm为苯丙氨酰残基的吸收带，λ＝378nm为异羟肟酸基团的吸收带，显示样品与预测化合物的紫外吸收光谱基本一致。

表4样品的紫外-光谱数据

实施例3：恶臭菌素对黄瓜枯萎病的的抗病效果试验

恶臭菌素的化合物的结构为(如下)

本试验所用黄瓜种子，未经任何种衣剂处理，消毒后，播种于装有两次高压灭菌的肥沃菜园土基质的塑料钵中，苗钵置于浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所的温室中，待子叶完全展开后，进行诱导接种并同时挑战接种。

抗病效果试验采用温室盆栽法：样品化合物用蒸馏水溶解，配制成50mg/L的水溶液，空白对照用清水和阳性对照用50mg/L多菌灵。诱导接种采用灌根法，将已制备好的50mg/L恶臭菌素、清水和50mg/L多菌灵分别注入黄瓜根际，每钵15mL。三天后，采用土壤接种法进行黄瓜枯萎病菌的挑战接种。具体操作是将长满黄瓜枯萎病菌的麦粒沙培养基风干、捣碎，与灭菌土以1∶20的比例充分混匀后撒入种植有黄瓜苗的小钵中，再覆盖一层灭茵土。适时浇水，使土壤保持适当的温度和湿度。每周观察并记录生长状况及成苗率。最后对结果进行统计分析。

按照上述方法进行测试发现50mg/L恶臭菌素对黄瓜枯萎病有较好的防效，结果见表5。处理14d后，方差分析与Duncan氏显著性测验，成株率较对照明显提高，并呈显著性差异(P＝0.05)。21d时仍保持较好的相对防效，达到53.84％。与对照呈显著性差异(P＝0.05)。

表5恶臭菌素处理黄瓜对枯萎病的防治效果

注：采用新复极差测验，数值后不同字母表示差异显著(P＝0.05)。

Claims (1)

1.一种异羟肟酸类型嗜铁素化合物在制备防治黄瓜枯萎病农药试剂中的用途，其中，所述的异羟肟酸类型嗜铁素化合物的结构如下：

其中，异羟肟酸类型嗜铁素化合物的浓度为50mg/L。