CN102965311B - 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102965311B CN102965311B CN201210464170.6A CN201210464170A CN102965311B CN 102965311 B CN102965311 B CN 102965311B CN 201210464170 A CN201210464170 A CN 201210464170A CN 102965311 B CN102965311 B CN 102965311B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- subtilis
- polyglutamic acid
- pga
- gamma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 39
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 16
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 16
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 16
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 12
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-M glutaminate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 26
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 description 19
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 4
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 2
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001007 Nylon 4 Polymers 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种枯草芽孢杆菌其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC？NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。利用该菌株在仅含有L-谷氨酸的培养基中培养，在优化条件下能积累γ-D-聚谷氨酸30~60g/L。该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，操作方便简单，γ-D-聚谷氨酸产量高，生产成本低，能广泛应用于植物保水，食品添加等领域。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产γ-D-聚谷氨酸（γ-D-PGA）的微生物菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid,简称γ-PGA）是由多种杆菌（如炭疽芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等）产生的一种胞外聚合物。γ-PGA是谷氨酸单体以γ-羧基与氨基相缩合的一种均聚氨基酸，主链为nylon-4结构（1）。γ-PGA具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性，在注重环保、强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物有十分广阔的应用前景。可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域。
至今发现的聚γ-PGA产生菌主要集中在芽孢杆菌属（Bacillus sp.），包括枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌（B. lichemiformis）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）等。至今发现的在枯草芽孢杆菌中发酵生产的γ-PGA都为γ-D,L-PGA。而高聚物的单体构型往往会影响产品的性能和应用。L-异构体含量高的γ-PGA可以更好的应用在化妆品领域及降解材料；D-异构体含量高的γ-PGA则更适用于农业保水剂及食品添加剂等方面。在γ-PGA工业化生产方面，美国ADM公司、日本明治制果、味之素和台湾味丹企业等已对γ-PGA进行了商业化试生产。我国内地在该领域的研究相对起步较晚，与其它国家与机构相比还是存在一定的差距。关于γ-PGA工业化生产方面，尤其是在应用方面的研究都较少。
目前未见高光学纯度天然γ-PGA的产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株能够产高光学纯度的γ-D-PGA的枯草芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题，是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
发明人实验室选育的微生物菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。登记入册的编号是CGMCC NO.6324，保藏日期是：2012年7月10日。以此菌作为生产菌株。
CGMCC NO.6324菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.7~1.0×1.5~2.7μm大小的杆菌，37°C培养2~3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中32°C培养12h菌体可以大量生长。菌落呈白色，边缘有褶皱，不透明，不闪光。
2、生理与生化特性：
（1）培养温度：28~37°C，最适温度为32°C；
（2）在pH6.0~7.5范围内生长；
（3）革兰氏染色：阳性；
（4）甲基红实验：阴性；
（5）硝酸盐还原：阳性；
（6）吲哚生产：阴性；
（7）H2S生产：阴性；
（8）耐NaCl浓度：7%浓度以上可以生长。
3、16S rDNA序列分析：
测得16S rDNA大部分序列1443bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与枯草芽孢杆菌达到99.9%同源。所以认定本发明使用的是枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8。
4、营养特征：
枯草芽孢杆菌的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量为：碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~25g/L，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的一种或多种；氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的一种或多种；培养基中还包括钾盐、钠盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐等常用的无机盐类。
上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。
具体的方法是：将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸。
其中，所述的发酵培养基包含如下组分：谷氨酸或谷氨酸盐1~90g/L，碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~25g/L，其余为水，pH6.0~7.5。
其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。其中，所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0~7.5、培养温度为28~37°C、培养时间为24~72小时。
其中，发酵结束后，除去菌体的发酵液可提取γ-D-PGA。
其中，制备得到的γ-聚谷氨酸中，D-异构体含量为100%。
具体地说：
本发明提供的制备γ-D-PGA的方法，是将菌株CGMCC No.6324的接种到斜面1~2天后（斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基），在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养24~72小时，可以生成30~60g/Lγ-D-PGA，通常发酵条件还包括：培养基为：葡萄糖或糖蜜10~90g/L，L-谷氨酸10~90g/L，(NH4)2SO41~5g/L，K2HPO41~20g/L。发酵温度28~37°C，较佳的为30~37°C；培养基的初始pH范围为6.0~7.5，较佳的为6.8~7.2；好氧培养。
有益效果：本发明具有如下优势：
（1）本发明筛选到一株γ-PGA生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产γ-D-PGA，操作方便简单，培养条件十分粗放。
（2）该菌株可以合成高光学纯度的γ-D-PGA，即D-异构体含量100%。
（3）可以使用纤维素水解糖液（替代葡萄糖或蔗糖）、豆饼粉（替代酵母膏或蛋白胨）和味精废水（替代谷氨酸）作为γ-PGA发酵培养基的碳源、氮源和合成前体，使发酵原料成本大幅下降。
附图说明
图1为水解液薄层层析，其中，1,4谷氨酸标样；2,3γ-PGA水解液。
图2为L-/D-型谷氨酸混合单体标准品液相色谱图。
图3为水解液液相色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：7.5L罐分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
发酵培养基：葡萄糖40g/L，味精40g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、30°C、200r/min的摇床条件下培养15h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：30°C，400r/min，通气量1.2L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或氨水控制发酵液pH值在6.5-7.5之间。发酵48h，γ-D-PGA浓度达到40.2g/L。
取发酵液用浓盐酸调pH2.8-3.5，9000rpm离心30min去除菌体，取上清加入2-5倍体积的乙醇，将沉淀用水复溶，透析去除小分子物质，滤液冷冻干燥得到γ-PGA粗品。用该粗品配制1g/L溶液，1.5mL溶液加入1.5mL浓盐酸，装入安瓿瓶中密封，110°C水解24-36h，取出后用6M NaOH调pH6.5-7.0，得到谷氨酸水解液。将水解液进行薄层层析分析，薄层：纤维素、硅胶GF254，铺板(自制)；展开剂：正丁醇:冰醋酸:吡啶:水=4:1:1:2(V/V)；显色剂：0.2%的茚三酮正丁醇溶液。结果如图1所示，水解液在硅胶板上只有一个斑点，且与谷氨酸标液一致，表明γ-PGA被完全水解成谷氨酸单体，无残留高聚物。
采用蒸发光散射检测器测定γ-PGA水解液中总谷氨酸浓度，条件如下：流动相：2%乙腈，0.2%三氟乙酸，0.06%七氟丁酸；流速：0.5mL/min；蒸发室温度：117°C；氮气流速：3.2L/min。γ-PGA水解液中L-谷氨酸浓度采用SBA-40C型生物传感器检测，该仪器利用L-谷氨酸酶膜专一检测L-型谷氨酸单体。检测结果未在SBA中检测到L-型谷氨酸单体，故证实该产物为100%γ-D-PGA。
实施例2：7.5L罐分阶段控制转速发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用NaOH溶液调pH7.0。
发酵培养基：酸处理糖蜜20g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨2g/L，(NH4)2SO45g/L，味精废水80g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH7.0。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32°C、220r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32°C，通气量1.2L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。转速控制条件：0~12h，600r/min；12~48h，400r/min，在此条件下，γ-D-PGA浓度达到48.5g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
采用色谱柱Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)检测水解液中D-型、L-型谷氨酸单体。流动相A：0.05mol/L醋酸钠溶液，流动相B：甲醇:乙腈(V:V)=45:55；梯度洗脱程序：0-25min，4.5%-5.5%B，25-40min,5.5%-15.5%B；流速：1.0mL/min；柱温：20°C；荧光检测波长：λEx=340nm，λEm=445nm；进样量：10μL。用L-型谷氨酸单体及D-型谷氨酸单体配制成混合标液进样，结果如图2所示，L-型及D-型单体可以很好地分开；再将水解液进样，结果如图3所示，表明水解液中不存在L-型单体。
实施例3：7.5L罐补料分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
发酵培养基：糖蜜90g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO45g/L，味精废水90g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32°C、200r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按4%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：32°C，400r/min，通气量1.4L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在10g/L时，打开补料装置，将含糖浓度为500g/L的糖蜜补入发酵液中，控制发酵液中糖浓度保持在10~15g/L左右，进行补料发酵。发酵72h，γ-D-PGA浓度达到58.5g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例1中所述。
实施例4：1吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
一级种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨2.5g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，NaCl1g/L，谷氨酸钠1g/L，pH7.0。
二级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖2g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO40.2g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，pH7.0。
发酵培养基：葡萄糖90g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O10g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，谷氨酸40g/L，pH7.0。
一级种子制备：将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量100mL，30°C，200r/min培养16小时。
二级种子制备：按3%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m3/h，搅拌转速为120r/min，32°C下培养8小时。
1吨发酵罐生产：按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到1吨发酵罐中，通风量200m3/h，搅拌转速为100r/min，32°C下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L，发酵72h，γ-D-PGA浓度达53.6g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。
实施例5：10吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
一级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨2.5g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，NaCl1g/L，谷氨酸钠1g/L，pH6.8。
二级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO40.2g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，pH6.8。
发酵培养基：糖蜜60g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O10g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，味精废水30g/L，谷氨酸10g/L，pH6.8。
一级种子制备：将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量100mL，37°C，200r/min培养14小时。
二级种子制备：按4%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m3/h，搅拌转速为120r/min，32°C下培养8小时。
10吨发酵罐生产：按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到10吨发酵罐中，通风量240m3/h，搅拌转速为60r/min，32℃下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的糖蜜及葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L，发酵72h，γ-D-PGA浓度达46.1g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、和碳源、和氮源、和无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸；
所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0～7.5、培养温度为28～37℃、培养时间为24～72小时。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基由如下组分组成：谷氨酸或谷氨酸盐1～90g/L、碳源10～90g/L，氮源1～40g/L，无机盐0.01～25g/L，其余为水，pH6.0～7.5；
所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的应用，其特征在于，制备得到的γ-聚谷氨酸中，D-异构体含量为100％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210464170.6A CN102965311B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210464170.6A CN102965311B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102965311A CN102965311A (zh) | 2013-03-13 |
| CN102965311B true CN102965311B (zh) | 2015-03-25 |
Family
ID=47795747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210464170.6A Active CN102965311B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102965311B (zh) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103194374B (zh) * | 2013-04-01 | 2014-12-31 | 南京工业大学 | 一种发酵生产γ-聚谷氨酸的柱式固定化反应器及其工艺 |
| CN103397056B (zh) * | 2013-08-15 | 2016-02-24 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种制备l-氨基酸的方法 |
| CN105622176A (zh) * | 2014-10-26 | 2016-06-01 | 广西来宾市天仁生物有机肥有限责任公司 | 糖厂滤泥资源化生产生物有机肥的方法 |
| CN104673851B (zh) * | 2015-02-15 | 2018-06-08 | 南京轩凯生物科技有限公司 | 一种利用食用菌菌渣固体发酵产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN106591190B (zh) * | 2016-12-16 | 2019-07-16 | 大连理工大学 | 一种芽孢杆菌及其在制备γ-聚谷氨酸中的应用 |
| CN106701644A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-05-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用 |
| CN107365808A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-21 | 常州市天宁区鑫发织造有限公司 | 一种用于生产γ‑聚谷氨酸生物颗粒的制备方法 |
| CN107384840B (zh) * | 2017-09-07 | 2020-01-07 | 北京农业生物技术研究中心 | 一株抗旱促生复合菌剂及其应用 |
| CN108102957B (zh) * | 2017-12-19 | 2021-03-12 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一株具有解磷且高产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN108941191A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-12-07 | 上海松沅环境修复技术有限公司 | 一种石油污染土壤的微生物修复方法 |
| CN109182404A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-01-11 | 天津科技大学 | 一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110643526B (zh) * | 2019-08-31 | 2022-06-14 | 暨南大学 | 一种促进褐球固氮菌在植物根际定殖的方法 |
| CN111733106B (zh) * | 2020-07-06 | 2022-02-18 | 山东卓苒生物科技有限公司 | 松鼠葡萄球菌f-e8-1的培养方法及应用 |
| CN111876364B (zh) * | 2020-09-10 | 2021-07-23 | 南京轩凯生物科技股份有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及调控发酵产物γ-聚谷氨酸分子量的方法 |
| CN115058352B (zh) * | 2022-03-28 | 2023-08-11 | 四川师范大学 | 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1425762A (zh) * | 2002-12-30 | 2003-06-25 | 南京工业大学 | 利用枯草芽孢杆菌NX－2制备γ－聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体 |
| CN101486977A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-07-22 | 西北农林科技大学 | 枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101948785A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-19 | 南京医科大学 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
-
2012
- 2012-11-16 CN CN201210464170.6A patent/CN102965311B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1425762A (zh) * | 2002-12-30 | 2003-06-25 | 南京工业大学 | 利用枯草芽孢杆菌NX－2制备γ－聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体 |
| CN101486977A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-07-22 | 西北农林科技大学 | 枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101948785A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-19 | 南京医科大学 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Cultivation of Bacteria Producing Polyamino Acids with Liquid Manure as Carbon and Nitrogen Source;Markus Pötter等;《Applied and Environmental Microbiology》;20010228;第67卷(第2期) * |
| g-聚谷氨酸产生菌的筛选及发酵条件;桑莉等;《过程工程学报》;20041030;第4卷(第5期) * |
| 谷氨酰转肽酶产生菌的筛选和培养条件的研究;张新民等;《生物加工过程》;20031130;第1卷(第2期) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102965311A (zh) | 2013-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102965311B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 | |
| CN101948785B (zh) | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 | |
| Sagnak et al. | Bio-hydrogen production from acid hydrolyzed waste ground wheat by dark fermentation | |
| CN101955980B (zh) | 一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株 | |
| CN101445786B (zh) | 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法 | |
| CN110241041B (zh) | 一种复合微生物制剂、其制备方法及应用 | |
| CN101607835B (zh) | 利用糖蜜酒精废液生产复合微生物液体肥料的方法 | |
| CN106635869A (zh) | 一种应用解淀粉芽孢杆菌生产生物表面活性素的方法 | |
| CN103614323B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌的培养基及应用 | |
| CN110004093A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆菌霉素d产量的培养基 | |
| CN109929897A (zh) | 一种促进hau-m1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用 | |
| CN102433262B (zh) | 一种适用于低温沼气发酵的复合微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN101886095B (zh) | 采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度d-乳酸的方法及其专用培养基 | |
| CN103627698A (zh) | 乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻 | |
| CN101475967A (zh) | 一种混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法 | |
| CN100455670C (zh) | 一株产l-丝氨酸的菌株及用该菌株生产l-丝氨酸的方法 | |
| CN103013863B (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌及其在制备鼠李糖胶中的应用 | |
| CN103146595B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及用于发酵生产d-核糖的方法 | |
| CN102382771B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法 | |
| CN105175275B (zh) | 一种l‑鸟氨酸的分离纯化方法 | |
| CN100526470C (zh) | 一种功能性甜味剂d-塔格糖的制备方法 | |
| CN111019996A (zh) | 一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法 | |
| CN103468606B (zh) | 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用 | |
| CN1693450A (zh) | 一种好氧高温堆肥发酵功能菌培养基的配制方法 | |
| CN104178438A (zh) | 一株适合于糖蜜发酵生产高纯度l-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200731 Address after: 210000 Building 10, Building A, Phase I, Zhongdan Life Science Industrial Park, 3-1 Xinjinhu Road, Jiangbei New District, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: NANJING SHINEKING BIOTECH Co.,Ltd. Address before: 509-5 room 15, building 210029, hi tech Development Zone, Jiangsu, Nanjing Co-patentee before: NANJING TECH University Patentee before: NANJING SHINEKING BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 10 / F, building a, phase I, Zhongdan Life Science Industrial Park, No. 3-1, xinjinhu Road, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province 210000 Patentee after: Nanjing xuankai Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 10 / F, building a, phase I, Zhongdan Life Science Industrial Park, No. 3-1, xinjinhu Road, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province 210000 Patentee before: NANJING SHINEKING BIOTECH Co.,Ltd. |