CN102965311B - 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种枯草芽孢杆菌其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)PG-8,已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,登记入册的编号是CGMCC?NO.6324,保藏日期是2012年7月10日。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。利用该菌株在仅含有L-谷氨酸的培养基中培养,在优化条件下能积累γ-D-聚谷氨酸30~60g/L。该菌株能利用多种碳源和氮源,培养条件粗放,操作方便简单,γ-D-聚谷氨酸产量高,生产成本低,能广泛应用于植物保水,食品添加等领域。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域,涉及一种高产γ-D-聚谷氨酸(γ-D-PGA)的微生物菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid,简称γ-PGA)是由多种杆菌(如炭疽芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等)产生的一种胞外聚合物。γ-PGA是谷氨酸单体以γ-羧基与氨基相缩合的一种均聚氨基酸,主链为nylon-4结构(1)。γ-PGA具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性,在注重环保、强调可持续发展的今天,γ-PGA及其衍生物有十分广阔的应用前景。可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域。
至今发现的聚γ-PGA产生菌主要集中在芽孢杆菌属(Bacillus sp.),包括枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. lichemiformis)和短小芽孢杆菌(B. pumilus)等。至今发现的在枯草芽孢杆菌中发酵生产的γ-PGA都为γ-D,L-PGA。而高聚物的单体构型往往会影响产品的性能和应用。L-异构体含量高的γ-PGA可以更好的应用在化妆品领域及降解材料;D-异构体含量高的γ-PGA则更适用于农业保水剂及食品添加剂等方面。在γ-PGA工业化生产方面,美国ADM公司、日本明治制果、味之素和台湾味丹企业等已对γ-PGA进行了商业化试生产。我国内地在该领域的研究相对起步较晚,与其它国家与机构相比还是存在一定的差距。关于γ-PGA工业化生产方面,尤其是在应用方面的研究都较少。
目前未见高光学纯度天然γ-PGA的产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株能够产高光学纯度的γ-D-PGA的枯草芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题,是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
发明人实验室选育的微生物菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PG-8,目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编:100101。登记入册的编号是CGMCC NO.6324,保藏日期是:2012年7月10日。以此菌作为生产菌株。
CGMCC NO.6324菌株具有下述性质:
1、菌落形态学特征:
在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.7~1.0×1.5~2.7μm大小的杆菌,37°C培养2~3天形成芽孢,芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中32°C培养12h菌体可以大量生长。菌落呈白色,边缘有褶皱,不透明,不闪光。
2、生理与生化特性:
(1)培养温度:28~37°C,最适温度为32°C;
(2)在pH6.0~7.5范围内生长;
(3)革兰氏染色:阳性;
(4)甲基红实验:阴性;
(5)硝酸盐还原:阳性;
(6)吲哚生产:阴性;
(7)H2S生产:阴性;
(8)耐NaCl浓度:7%浓度以上可以生长。
3、16S rDNA序列分析:
测得16S rDNA大部分序列1443bp,如SEQ ID No:1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较,构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明:菌株与枯草芽孢杆菌达到99.9%同源。所以认定本发明使用的是枯草芽孢杆菌,具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PG-8。
4、营养特征:
枯草芽孢杆菌的培养基中不需要添加生长因子,可以利用多种化合物作为碳源,这些物质既可以单独使用,也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量为:碳源10~90g/L,氮源1~40g/L,无机盐0.01~25g/L,其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的一种或多种;氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的一种或多种;培养基中还包括钾盐、钠盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐等常用的无机盐类。
上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。
具体的方法是:将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中,在合适生长的条件下进行好氧培养,生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸。
其中,所述的发酵培养基包含如下组分:谷氨酸或谷氨酸盐1~90g/L,碳源10~90g/L,氮源1~40g/L,无机盐0.01~25g/L,其余为水,pH6.0~7.5。
其中,所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合;氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合;无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。其中,所述的合适生长的条件是:初始pH为6.0~7.5、培养温度为28~37°C、培养时间为24~72小时。
其中,发酵结束后,除去菌体的发酵液可提取γ-D-PGA。
其中,制备得到的γ-聚谷氨酸中,D-异构体含量为100%。
具体地说:
本发明提供的制备γ-D-PGA的方法,是将菌株CGMCC No.6324的接种到斜面1~2天后(斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基),在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养24~72小时,可以生成30~60g/Lγ-D-PGA,通常发酵条件还包括:培养基为:葡萄糖或糖蜜10~90g/L,L-谷氨酸10~90g/L,(NH4)2SO41~5g/L,K2HPO41~20g/L。发酵温度28~37°C,较佳的为30~37°C;培养基的初始pH范围为6.0~7.5,较佳的为6.8~7.2;好氧培养。
有益效果:本发明具有如下优势:
(1)本发明筛选到一株γ-PGA生产菌,该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产γ-D-PGA,操作方便简单,培养条件十分粗放。
(2)该菌株可以合成高光学纯度的γ-D-PGA,即D-异构体含量100%。
(3)可以使用纤维素水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)、豆饼粉(替代酵母膏或蛋白胨)和味精废水(替代谷氨酸)作为γ-PGA发酵培养基的碳源、氮源和合成前体,使发酵原料成本大幅下降。
附图说明
图1为水解液薄层层析,其中,1,4谷氨酸标样;2,3γ-PGA水解液。
图2为L-/D-型谷氨酸混合单体标准品液相色谱图。
图3为水解液液相色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:7.5L罐分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基:葡萄糖5g/L,牛肉膏5g/L,蛋白胨5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,利用NaOH溶液调pH6.8。
发酵培养基:葡萄糖40g/L,味精40g/L,酵母膏5g/L,(NH4)2SO45g/L,K2HPO4·3H2O2.5g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,利用NaOH溶液调pH6.8。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、30°C、200r/min的摇床条件下培养15h,将种子液按5%(v/v)的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养,培养条件:30°C,400r/min,通气量1.2L/min,发酵过程中开启pH自动控制装置,利用HCl或氨水控制发酵液pH值在6.5-7.5之间。发酵48h,γ-D-PGA浓度达到40.2g/L。
取发酵液用浓盐酸调pH2.8-3.5,9000rpm离心30min去除菌体,取上清加入2-5倍体积的乙醇,将沉淀用水复溶,透析去除小分子物质,滤液冷冻干燥得到γ-PGA粗品。用该粗品配制1g/L溶液,1.5mL溶液加入1.5mL浓盐酸,装入安瓿瓶中密封,110°C水解24-36h,取出后用6M NaOH调pH6.5-7.0,得到谷氨酸水解液。将水解液进行薄层层析分析,薄层:纤维素、硅胶GF254,铺板(自制);展开剂:正丁醇:冰醋酸:吡啶:水=4:1:1:2(V/V);显色剂:0.2%的茚三酮正丁醇溶液。结果如图1所示,水解液在硅胶板上只有一个斑点,且与谷氨酸标液一致,表明γ-PGA被完全水解成谷氨酸单体,无残留高聚物。
采用蒸发光散射检测器测定γ-PGA水解液中总谷氨酸浓度,条件如下:流动相:2%乙腈,0.2%三氟乙酸,0.06%七氟丁酸;流速:0.5mL/min;蒸发室温度:117°C;氮气流速:3.2L/min。γ-PGA水解液中L-谷氨酸浓度采用SBA-40C型生物传感器检测,该仪器利用L-谷氨酸酶膜专一检测L-型谷氨酸单体。检测结果未在SBA中检测到L-型谷氨酸单体,故证实该产物为100%γ-D-PGA。
实施例2:7.5L罐分阶段控制转速发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基:葡萄糖5g/L,牛肉膏5g/L,蛋白胨5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,利用NaOH溶液调pH7.0。
发酵培养基:酸处理糖蜜20g/L,葡萄糖10g/L,蔗糖10g/L,蛋白胨2g/L,(NH4)2SO45g/L,味精废水80g/L,K2HPO4·3H2O2.5g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,利用NaOH溶液调pH7.0。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32°C、220r/min的摇床条件下培养16h,将种子液按5%(v/v)的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养,培养条件:整个发酵过程中保持温度32°C,通气量1.2L/min,发酵过程中开启pH自动控制装置,利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。转速控制条件:0~12h,600r/min;12~48h,400r/min,在此条件下,γ-D-PGA浓度达到48.5g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
采用色谱柱Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm,5μm)检测水解液中D-型、L-型谷氨酸单体。流动相A:0.05mol/L醋酸钠溶液,流动相B:甲醇:乙腈(V:V)=45:55;梯度洗脱程序:0-25min,4.5%-5.5%B,25-40min,5.5%-15.5%B;流速:1.0mL/min;柱温:20°C;荧光检测波长:λEx=340nm,λEm=445nm;进样量:10μL。用L-型谷氨酸单体及D-型谷氨酸单体配制成混合标液进样,结果如图2所示,L-型及D-型单体可以很好地分开;再将水解液进样,结果如图3所示,表明水解液中不存在L-型单体。
实施例3:7.5L罐补料分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
种子培养基:葡萄糖5g/L,牛肉膏5g/L,蛋白胨5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,利用NaOH溶液调pH6.8。
发酵培养基:糖蜜90g/L,蛋白胨5g/L,(NH4)2SO45g/L,味精废水90g/L,K2HPO4·3H2O2.5g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,利用NaOH溶液调pH6.8。
将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32°C、200r/min的摇床条件下培养16h,将种子液按4%(v/v)的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养,培养条件:32°C,400r/min,通气量1.4L/min,发酵过程中开启pH自动控制装置,利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在10g/L时,打开补料装置,将含糖浓度为500g/L的糖蜜补入发酵液中,控制发酵液中糖浓度保持在10~15g/L左右,进行补料发酵。发酵72h,γ-D-PGA浓度达到58.5g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例1中所述。
实施例4:1吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
一级种子培养基:葡萄糖5g/L,牛肉膏2g/L,蛋白胨2.5g/L,(NH4)2SO45g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,K2HPO4·3H2O1g/L,NaCl1g/L,谷氨酸钠1g/L,pH7.0。
二级种子培养基:糖蜜20g/L,葡萄糖2g/L,牛肉膏2g/L,蛋白胨5g/L,(NH4)2SO45g/L,KH2PO40.2g/L,K2HPO4·3H2O2g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,pH7.0。
发酵培养基:葡萄糖90g/L,蛋白胨3g/L,(NH4)2SO45g/L,K2HPO4·3H2O10g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,谷氨酸40g/L,pH7.0。
一级种子制备:将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中,三角瓶装液量100mL,30°C,200r/min培养16小时。
二级种子制备:按3%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m3/h,搅拌转速为120r/min,32°C下培养8小时。
1吨发酵罐生产:按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到1吨发酵罐中,通风量200m3/h,搅拌转速为100r/min,32°C下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置,利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时,打开补料装置,将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中,控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L,发酵72h,γ-D-PGA浓度达53.6g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。
实施例5:10吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。
一级种子培养基:糖蜜20g/L,葡萄糖5g/L,牛肉膏2g/L,蛋白胨2.5g/L,(NH4)2SO45g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,K2HPO4·3H2O1g/L,NaCl1g/L,谷氨酸钠1g/L,pH6.8。
二级种子培养基:糖蜜20g/L,葡萄糖5g/L,牛肉膏2g/L,蛋白胨5g/L,(NH4)2SO45g/L,KH2PO40.2g/L,K2HPO4·3H2O2g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,pH6.8。
发酵培养基:糖蜜60g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨3g/L,(NH4)2SO45g/L,K2HPO4·3H2O10g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.25g/L,味精废水30g/L,谷氨酸10g/L,pH6.8。
一级种子制备:将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中,三角瓶装液量100mL,37°C,200r/min培养14小时。
二级种子制备:按4%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m3/h,搅拌转速为120r/min,32°C下培养8小时。
10吨发酵罐生产:按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到10吨发酵罐中,通风量240m3/h,搅拌转速为60r/min,32℃下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置,利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时,打开补料装置,将母液浓度为500g/L的糖蜜及葡萄糖补入发酵液中,控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L,发酵72h,γ-D-PGA浓度达46.1g/L。
γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。
水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。

Claims (5)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PG-8,已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,登记入册的编号是CGMCC NO.6324,保藏日期是2012年7月10日。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、和碳源、和氮源、和无机盐和水的无菌发酵培养基中,在合适生长的条件下进行好氧培养,生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸;
所述的合适生长的条件是:初始pH为6.0~7.5、培养温度为28~37℃、培养时间为24~72小时。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的发酵培养基由如下组分组成:谷氨酸或谷氨酸盐1~90g/L、碳源10~90g/L,氮源1~40g/L,无机盐0.01~25g/L,其余为水,pH6.0~7.5;
所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合;氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合;无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的应用,其特征在于,制备得到的γ-聚谷氨酸中,D-异构体含量为100%。
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