CN101955980B

CN101955980B - 一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株

Info

Publication number: CN101955980B
Application number: CN 201010238685
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 朱兵峰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2030-07-28
Also published as: CN101955980A

Abstract

本发明公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，具体地说是一种微生物利用还原糖发酵积累前体乙偶姻、以及乙偶姻和氨经非酶促反应合成四甲基吡嗪的两步法生产工艺，属于生物工程技术领域。所述微生物为枯草芽孢杆菌(CCTCC NO：M 208157)、地衣芽孢杆菌(CGMCC NO：3961)地衣芽孢杆菌(CGMCC NO：3962)以及地衣芽孢杆菌(CGMCCNO：3963)中任一一株，上述菌株利用还原糖发酵获得生物量并积累内源前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应合成四甲基吡嗪。本发明的优点如下：1.获得较高的菌体量，且乙偶姻积累量得以有效提高(38-44g/L)；2.高浓度的内源前体乙偶姻和氨在适宜的条件下可快速反应生成四甲基吡嗪(16-20g/L)；3.内源乙偶姻的积累以及原位发酵环境，显著提高了前体的利用率(40.3％)。

Description

一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株。

背景技术

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又名川芎嗪，是吡嗪环碳原子上均连接甲基的含氮杂环化合物。TTMP天然存在于可可制品、咖啡、乳制品、肉、花生、榛子、朗姆酒、威士忌酒和大豆制品中，作为天然香料具有烘烤、花生、榛子、可可香气，主要用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配；同时，TTMP作为活血行气祛瘀中药材川芎（Ligusticum wallichii）根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等药理作用，现已作为一种新型的钙离子拮抗剂广泛应用于临床，是循环、中枢神经、呼吸及其它系统相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾小球疾病等的治疗；近年来，在中国传统白酒中亦检测到TTMP和其它烷基吡嗪类化合物，它们通常具有较低的风味阈值，因此被认为对中国白酒的酱香型风味有重要的贡献；同时，TTMP可以用作光敏剂以及医药和农药的中间体。

TTMP的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。TTMP的直接萃取法由于川芎植物来源有限，且TTMP在川芎中的含量较低，导致后提取成本过高，在工业化大规模生产方面仍存在困难。利用美拉德反应和Strecker降解化学法合成吡嗪类化合物由于产物成分复杂且产率较低，尚未有大规模工业化生产的报道。利用非Strecker降解的方法化学合成TTMP亦有大量的研究，包括化学合成法和催化合成法，但普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不属于‘天然’或‘生物合成’范畴。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物工程的手段生产四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点而广受消费者关注。

利用微生物发酵生产TTMP的相关研究较晚，且目前普遍认为发酵体系中TTMP的合成是细胞自身代谢过程中酶促催化反应的产物。1993年，日本Yamaguchi等人考察了不同碳源对Bacillus natto液态发酵生产吡嗪类化合物的影响，发现以葡萄糖为碳源时总吡嗪产量较高，但仅为42 mg/L；法国Besson等人利用B. subtilis IFO3013以大豆为培养基固态发酵法生产TTMP，通过添加适量前体乙偶姻，发酵14天后，TTMP产量达2.5g/kg固态培养基（相当于0.58 g/L）。由上可知，虽然枯草杆菌能够利用自身的代谢途径“从头合成”吡嗪类化合物，且添加前体物质可以有效强化代谢通路，但野生菌株发酵生产TTMP的能力仍较低，难以进行工业化生产。

本实验室在前期研究的基础上，开发出了一株枯草芽胞杆菌XZ1124，该菌株发酵120小时，TTMP的产量达3.92 g/L；在研究中还发现，该菌株能够大量合成TTMP前体物质乙偶姻，研究人员推测乙偶姻可能通过生物酶催化的方式生成TTMP（一株高产四甲基吡嗪的枯草芽胞杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，专利申请号：200810235366.1）；然而，局限于尚未有对微生物发酵生产TTMP特性的考察以及基于TTMP合成特性的发酵调控方面的报道，未能开发出相应技术，通过应用该菌株发酵积累前体乙偶姻以及发酵体系中TTMP的合成特性，进一步提高TTMP的产量。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供生产四甲基吡嗪（TTMP）的菌株，所述菌株其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-L1、MT-6和MT-15，已于2010年6月28日保藏于CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，其保藏编号分别为CGMCC NO：3961、3962和3963；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 208157（一株高产四甲基吡嗪的枯草芽胞杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，专利申请号：200810235366.1）。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种生产四甲基吡嗪（TTMP）的方法。

为解决上述技术问题，本发明建立了微生物两步法制备TTMP的工艺；首先，利用微生物发酵积累前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应生成TTMP；其以内源方式积累前体乙偶姻，有效提高了乙偶姻的利用率以及TTMP的产量。

本发明所采用的具体技术方案如下：

1．微生物发酵积累内源前体乙偶姻

（1）弱酸胁迫的发酵策略

在利用Bacillus licheniformis BL-L1、MT-6和MT-15以及Bacillus subtilis XZ1124发酵积累前体乙偶姻的过程中，通过流加8 mol/L HCl或8 mol/L NaOH控制发酵体系pH为5.5-6.0，发酵时间48 h。

（2）补加葡萄糖的发酵策略

在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XZ1124发酵积累前体乙偶姻的过程中，初始葡萄糖浓度为80 g/L，培养36 h时，补加50-80 g/L葡萄糖，继续发酵至乙偶姻达到峰值。

在地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-L1、MT-6和MT-15发酵积累前体乙偶姻的过程中，初始葡萄糖浓度为60 g/L，培养24 h时，补加70-100 g/L葡萄糖，继续发酵至乙偶姻达到峰值。

（3）两阶段搅拌转速控制策略

在枯草杆菌(Bacillus subtilis)发酵积累前体乙偶姻的过程中，0-14h，控制培养温度搅拌转速为700rpm；14h后，控制搅拌转速为500rpm，继续发酵至乙偶姻达到峰值。

在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-L1、MT-6和MT-15发酵积累前体乙偶姻的过程中，0-12h，控制培养温度搅拌转速为650rpm；12h后，控制搅拌转速为500rpm，继续发酵至乙偶姻达到峰值。

上述摇瓶种子液的培养基为YPG培养基，以g/L计：葡萄糖100，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，121℃灭菌20min，装液量50mL/250mL；培养方法：斜面活化培养：37C培养18-24h；种子培养：从斜面上挑取一环菌体接入液体种子培养基，在摇床上以200r/min的转速进行培养。

上述发酵罐发酵的培养基为YG培养基，以g/L计：葡萄糖100，酵母膏30，磷酸氢二铵30，121℃灭菌20min；培养方法：7.5L全自动发酵罐分批发酵：装液量5L/7.5L发酵罐，接种量4％，通气量1vvm，37℃，流加8mol/L HCl或8mol/L NaOH控制pH 5.5-6.0。

2.乙偶姻和氨反应生成TTMP

将上述含有乙偶姻的微生物培养液以10000rpm离心10min，去除菌体，取上清液测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍相应乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55℃水浴摇床(150rpm)反应16-20h。

本发明运用代谢流量分析的手段，确定了Bacillus subtilis XZ1124、Bacillus licheniformisBL-L1、Bacillus licheniformis MT-6和Bacillus licheniformis MT-15两步法合成TTMP的主要途径，以及不同培养条件对上述微生物发酵体系中相关代谢流量分布的影响，通过动力学分析，进而提出了合成乙偶姻和TTMP的分阶段发酵控制策略。

本发明的微生物两步法发酵生产TTMP工艺在7.5L发酵罐上完成，通过自动流加装置以及不同的转速条件实现相应的发酵控制，在微生物分批发酵过程中，在线监测溶氧、pH，离线监测发酵过程中菌体干重、残糖、有机酸(乳酸和乙酸)、乙偶姻和TTMP的含量。

在已知上述代谢产物的基础上，运用发酵动力学分析的手段，对不同条件下上述微生物发酵各代谢物的流量分布进行分析，探索菌体生长和乙偶姻、TTMP发酵特征，进而提出相应的发酵控制策略，并对该控制策略进行验证和分析。

本发明基于发酵过程分析以及相关验证试验，证明发酵体系中TTMP的生成是微生物代谢产生的前体乙偶姻和氨非酶促催化反应的产物，将发酵体系中TTMP的生成过程分为两个阶段：一是前体乙偶姻的积累阶段，二是TTMP的非酶促合成阶段；基于两个阶段对培养环境要求的差异，建立微生物两步法制备TTMP的工艺，并对该控制策略进行验证和分析。

本发明的有益效果：本发明提出了一种高效制备TTMP的方法，首先，通过应用发酵控制策略，促进细胞的快速增殖与前体乙偶姻的大量积累，在此基础上，选择适宜的反应条件，促进发酵体系中乙偶姻和氨反应生成TTMP；应用上述方法，最终发酵体系中TTMP的浓度可达16-20g/L。该工艺具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富和生产成本低等特点，具有诱人的工业应用前景。

附图说明

图1胞外酶促催化反应的验证；A，胞外粗酶液添加量对TTMP生成的影响；B胞外粗酶浓缩液对TTMP生成的影响

图2B.subtilis XZ1124发酵体系中TTMP合成途径示意图

图3微生物两步法制备TTMP工艺的示意图

图4B.licheniformis BL-L1在弱酸胁迫条件下的发酵过程曲线

图5应用搅拌转速控制策略的B.licheniformis MT-15发酵过程曲线

图6应用葡萄糖补加策略的B.subtilis XZ1124发酵过程曲线

图7乙偶姻和氨反应生成TTMP的过程曲线

具体实施方式

实施例1：乙偶姻和氨反应生成TTMP的验证

(1)胞外酶促催化反应的验证：为验证发酵体系中前体乙偶姻和氨反应生成TTMP的过程是否存在胞外酶促催化反应，设计模型体系，该模型体系中含有一定浓度的乙偶姻和30g/L的DAP，调节模型体系的pH为7.0。

将枯草杆菌XZ1124接种于YG培养基中进行摇瓶培养。取培养48h的发酵液，8000rpm离心15min，上清液过0.22μm的水膜，所得的澄清液作为胞外粗酶液。向上述模型体系中加入一定体积的粗酶液，剧烈震荡后作为反应的开始，以加入相同体积去离子水的反应为空白。

假设胞外粗酶液中存在相关酶催化乙偶姻和氨反应生成TTMP，提高模型体系中胞外粗酶液添加量则能够促进乙偶姻和氨反应生成TTMP；同时，将胞外粗酶液用10KD超滤膜过滤，分别制得2X、3X和4X的浓缩液，将该系列浓缩液和原液(1X)以及滤液(filtrate)分别作为胞外粗酶液加入到乙偶姻/DAP模型体系中，考察不同胞外粗酶添加量和浓缩液对TTMP的生成的影响，结果如图1所示。

由图1(A)可知，增大模型体系中胞外粗酶液的添加量，反应结束时TTMP的增加量相应提高，表明胞外粗酶液中存在促进TTMP合成的因素。为验证该因素是否与大分子量的酶蛋白的催化相关，将胞外粗酶液用10KD的超滤膜浓缩，得到不同浓缩倍数的胞外粗酶浓缩液。已知的氧化还原酶分子量均超过10KD，经Bradford法检测，各浓缩液中蛋白含量基本呈相应的倍数关系。然而，根据图1(B)的结果，模型体系中加入胞外粗酶浓缩液后并未有相应的TTMP增长量，且TTMP增量与滤液作为粗酶液时的TTMP增量相当。上述研究结果表明，胞外粗酶液中含有促进乙偶姻和氨反应生成TTMP的因素，但该促进因素并非由酶液中的酶蛋白催化导致，因此，胞外粗酶液中不存在相关的酶参与乙偶姻和氨反应生成TTMP的过程。

(2)胞内酶促催化反应的验证：假设枯草杆菌XZ1124细胞内存在相关酶催化乙偶姻和氨反应生成TTMP，把整细胞看作生物催化剂，将不同培养时间的发酵液10000rpm离心20min，上清液用0.22μm膜过滤，去除残余细胞，得到的滤液继续放置于枯草杆菌XZ1124培养环境进行反应(控制总时间为6天)，考察无细胞体系中TTMP的生成情况。

表1无细胞体系中乙偶姻和氨反应生成TTMP的情况

a B.subtilis XZ1124接种于YG培养基中，37℃、200rpm培养一定时间后，10000rpm离心20min，收集上清液并用0.22μm滤膜过滤

b对照在YG培养基、37℃、200rpm发酵培养6天

由表1可知，将不同培养时间的发酵液过滤除菌后继续于摇床反应，反应结束时TTMP的浓度均有不同程度的提高，表明细胞的存在不是乙偶姻反应生成TTMP的前提条件。不同收集时间的滤液继续于培养环境中反应至6天时，乙偶姻生成TTMP的得率基本一致；同时，将枯草杆菌XZ1124培养4天(乙偶姻的生成曲线已越过峰值进入消耗期)的发酵液过滤除菌所得的上清液于培养条件下继续反应2天，其TTMP的终浓度与对照样品相近，上述结果表明发酵液中细胞的存在与否对体系中TTMP的生成没有影响，进一步验证了枯草杆菌XZ1124细胞内不存在相应的酶催化乙偶姻和氨生成TTMP的反应。

基于上述的实验结果，枯草杆菌XZ1124细胞内和细胞外均不存在催化乙偶姻和氨反应生成TTMP的酶，因此，得到以下结论：发酵体系中的TTMP是由乙偶姻和氨经非酶促催化反应产生的，乙偶姻和氨反应生成TTMP的过程是非酶促合成的过程。

实施例2：微生物发酵体系中TTMP合成途径的确定

杆菌属(Bacillus sp.)代谢生成乙偶姻的过程一般认为由两分子丙酮酸缩合形成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在α-乙酰乳酸脱羧酶的作用下脱羧形成乙偶姻，乙偶姻在丁二醇脱氢酶的作用下还原生成2，3-丁二醇，二者可以相互转化。

将枯草杆菌XZ1124接种于YG培养基，在摇床上以37℃、200r/min的培养72h，取发酵液用乙醚萃取，将萃取相用GC-MS定性分析，将各色谱峰的图谱与NIST05a.L Database(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图进行比对，并与标准物的保留时间进行对比验证，共鉴定出如下主要代谢物：乙偶姻、TTMP、2，3-丁二酮(2，3-butanedione)、2，3-丁二醇(2，3-butanediol)(两个异构体)；发酵液用无水乙醇沉淀蛋白质后进样HPLC分析，将得到的图谱与有机酸混标色谱图对比，检测到发酵液中主要存在乳酸(lactate)和乙酸(acetate)。根据上述试验结果，可以初步推测枯草杆菌XZ1124在YG培养基中的代谢途径，如附图2所示。

实施例3：应用pH控制发酵提高微生物发酵积累前体乙偶姻的能力

步骤1：斜面培养物活化：将B.licheniformis BL-L1菌株接种于肉汤琼脂培养基，37℃条件下，静置培养24-48h，备用；

步骤2：液体种子培养物的制备：将步骤1培养的菌株，在无菌条件下用接种环挑1-2环于装有50mL液体种子培养基的250mL摇瓶中，置摇床上以旋转转速为200r/min、37℃培养18-20h，即制得液体种子培养物。

步骤3：将液体种子培养物以24％的体积比的接种量，接种于装有5L YG培养基的7L发酵罐中，设置发酵罐搅拌转速为500rpm、温度为35-40℃、通气量1vvm，发酵时间为48h，发酵过程中流加酸碱控制发酵液pH值为5.5-6.0，发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中的各物质含量；发酵48h，发酵液中前体乙偶姻的积累量为30-35g/L，发酵过程曲线见图4。

实施例4：应用两阶段搅拌转速控制策略提高微生物发酵积累前体乙偶姻的能力

将B.licheniformis MT-15菌株的液体种子培养物以体积百分比为以4％的体积比的接种量，接种于装有5L YG培养基的7L发酵罐中，设置发酵罐搅拌转速为300-700r/min、温度为37℃、通气量1vvm，发酵过程中流加酸碱控制发酵液pH值为6.0，发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中各物质的含量。不同搅拌转速条件下B.licheniformis MT-15发酵动力学参数如表2所示，当搅拌转速为700rpm时，菌体生长速率Q_x和前体乙偶姻生成速率Q_HB最佳，分别为0.89g/L/h和1.23g/L/h。

表2不同搅拌转速条件下的发酵动力学参数比较

乙偶姻作为产物TTMP的前体，其积累时间和积累量对TTMP的生成速率有着直接的影响。通过比较乙偶姻的比生成速率(q_HB)曲线，高转速条件下(700rpm)的乙偶姻积累时间较早，培养12h时q_HB达到峰值，为0.121h^-1；中等转速条件下(500rpm)，q_HB在培养20h达到峰值，为0.140h^-1；低转速条件下(300rpm)，q_HB在培养前60h处于较低的水平，其达到峰值时间滞后。

根据发酵罐培养时搅拌转速对TTMP发酵的动力学分析，提出搅拌转速偶联温度控制发酵策略：0-12h，搅拌转速为650rpm；12-48h，搅拌转速为500rpm。将上述控制策略应用于7.5L全自动发酵罐，结果如图5所示。发酵48h时，发酵液中前体乙偶姻的积累量为32-36g/L。

实施例5：应用葡萄糖补加策略提高微生物发酵积累前体乙偶姻的能力

将B.subtilis XZ1124菌株的液体种子培养物以体积百分比为以4％的体积比的接种量，接种于装有5L YG培养基(葡萄糖浓度为60-120g/L)的7L发酵罐中，设置发酵罐初始搅拌转速为500r/min、温度为37℃、通气量1vvm，发酵过程中流加酸碱控制发酵液pH值为6.0发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中各物质的含量。根据对B.subtilis XZ1124发酵过程中各参数的跟踪检测和动力学分析，随着初始糖浓度的增加，细胞对葡萄糖的利用速率有所降低，且耗糖速率峰值时间延后；当初糖浓度为60和80g/L时，培养初期(0-14h)的糖耗速率基本相同。细胞生长受初糖浓度的影响较明显，虽然增大初糖浓度可提高细胞量，但在培养初期细胞在80g/L初糖浓度条件下的生长速率较高，同时，前体乙偶姻的积累速率亦高于其它初糖浓度时所对应值。

枯草杆菌XZ1124发酵体系中前体物质乙偶姻的生产强度随初糖浓度的增大而提高，但其峰值时间延后；同时发现，细胞生长速率亦随初糖浓度的增大而提高，峰值时间相应延后。前体乙偶姻的积累量和菌体生长趋势相似，表明乙偶姻作为细胞初级代谢产物其生成速率与细胞的生长速率直接相关。

根据上述对不同糖浓度条件下枯草杆菌XZ1124发酵动力学的分析结果可见，初糖浓度为80g/L时，细胞增殖速率和糖耗速率均较高，且前体乙偶姻的生成速率在培养36h时达到峰值。因此，确定了如下的葡萄糖补加策略：初始葡萄糖浓度为80g/L，培养36h时，补加50-80g/L葡萄糖。将该补加策略应用于枯草杆菌XZ1124的摇瓶发酵过程，结果如附图6所示。发酵结束时，发酵液中前体乙偶姻的积累量为38-44g/L。

实施例6：乙偶姻和氨反应生成TTMP

将上述实施例3所得的B.licheniformis BL-L1培养液10000r/min离心10min，取上清液测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55-90℃水浴摇床(150rpm)反应20h，反应结束时TTMP的浓度达10-14g/L。

将上述实施例4所得的B.licheniformis MT-15培养液10000r/min离心10min，取上清液测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55-90℃水浴摇床(150rpm)反应20h，反应结束时TTMP的浓度达12-15g/L。

将B.licheniformis MT-6按照上述实施例3控制pH为5.5进行发酵48h，将培养液10000r/min离心10min，取上清液测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55-90℃水浴摇床(150rpm)反应20h，反应结束时TTMP的浓度达11-14g/L。

将上述实施例5所得的B.subtilis XZ1124培养液10000r/min离心10min，取上清液测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55-90℃水浴摇床(150rpm)反应20h，反应结束时TTMP的浓度达16-20g/L，如图7所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种生产四甲基吡嗪的方法，以枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）XZ1124CCTCC NO：M208157为出发菌株，其特征是首先微生物发酵积累前体乙偶姻，取发酵上清液测定乙偶姻的含量，向上清液中加入2倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，于55-90°C水浴摇床反应；所述微生物发酵积累前体乙偶姻的过程中，应用pH5.5-6.0弱酸胁迫的条件，促进前体乙偶姻的积累；所述微生物发酵积累前体乙偶姻的过程中，采用葡萄糖补加策略，初始葡萄糖浓度为60-80g/L，培养24-36h，补加50-100g/L葡萄糖，继续发酵至乙偶姻达到峰值；所述微生物发酵积累前体乙偶姻的过程中，采用两阶段搅拌转速控制策略，0-12h，控制搅拌转速为700rpm；12h后，控制搅拌转速为500rpm，继续发酵至乙偶姻达到峰值。

2.如权利要求1所述的的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是微生物发酵积累前体乙偶姻的优选培养基为：以g/L计，以蒸馏水定容至1L，选用葡萄糖100，酵母膏30，磷酸氢二铵30。