CN109749915A - 一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法 - Google Patents
一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属微生物技术领域，提供一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法。为提升山西老陈醋的川芎嗪含量，在山西老陈醋的醋酸发酵阶段添加山西老陈醋土著优良高产乙偶姻莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730制的复配直投式发酵剂、乙偶姻及磷酸氢二铵等川芎嗪前体物质；在陈醋熏醅阶段再次添加磷酸氢二铵前体物质。得新淋醋川芎嗪565.85μg/mL，总酸5.78g/100mL，不挥发性酸1.79g/100mL，与对照相比提高了547.65%、53.72%、88.42%，提高了陈醋总酯及氨基氮含量，丰富了挥发性香气谱图及含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法。
背景技术
山西老陈醋是我国传统四大名醋之一，其中含有川芎嗪、多酚、氨基酸及维生素等多种营养成分和功能成分，长期食用可增进食欲、有助于巧的吸收、降低血糖浓度、降低血压等。川芎嗪，又名四甲基吡嗪，属于吡嗪类的生物碱，具有特殊的臭味，有吸湿性，易升华，易溶于石油醚、热水，溶于稀酸、氯仿，不溶于冷水；是中药川芎中的重要活性物质，能够扩张小动脉，改善微循环和脑血流；也是我国首先从常用中药川芎中提取出的生物碱，它是川芎治疗心脑血管疾病的有效成分之一，临床上已广泛应用于治疗缺血性心脑血管疾病及慢性心衰、肾衰等并且取得了良好的疗效。
乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川芎嗪的前体物质。目前，关于微生物发酵体系中川芎嗪生成机制的研究已经比较系统，发现并证明在固态发酵条件下是所产生氨基酸脱氢酶实现从氨基酸到氨的转化，氨和羟基丁酮通过缩合作用合成川芎嗪因此氨基酸脱氢酶是合成川芎嗪的关键酶。进而提出并验证了固态发酵中川芎嗪合成的新理论：基于酶化学联合反应的川芎嗪合成机制。通过试验证明：羟基丁酮和氨基酸不能合成川芎嗪，只有羟基丁酮和氨通过缩合作用才能合成川芎嗪。在固态发酵的条件下，添加氨根离子可以促进代谢产生羟基丁酮，分泌蛋白酶将蛋白质降解为氨基酸，然后由细菌曲中产生的氨基酸脱氢酶（如谷氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶）将氨基酸脱氢得到氨。
在白酒细菌制曲过程中，川芎嗪的合成分为两个阶段：第一阶段是在最适温度下，细菌代谢产生羟基丁酮和氨；第二阶段是在高温条件下羟基丁酮和氨进行缩合反应，合成川芎嗪。其中温度对第二阶段川芎嗪合成影响很大，高温利于反应的进行。而在老陈醋的制作过程中，酒精发酵阶段无川芎嗪产生，最早产生于醋酸发酵阶段，可能来源于氨基酸与还原糖之间美拉德反应；熏醅阶段川芎嗪含量大幅上升，可能是醋醅中残余淀粉、半纤维素、蛋白质、菌体等物质在弱酸条件下水解成还原糖和氨基酸。
国内学者对我国陈醋的功能性成分分析研究过程中发现，川芎嗪是其重要的保健功能因子及风味成分。贺铮怡等对镇江米醋中的川芎嗪进行了定性鉴定，用反相HPLC法对生产工艺中不同阶段的醋样进行了含量分析，结果显示川芎嗪的大量生成是在成品陈放过程，初步推断为美拉德反应的产物。李亚丹、孙宗保等进一步研究显示，川芎嗪在糖化和酒精发酵时期尚未形成，其合成起始于醋酸发酵阶段；煎醋和陈酿均有利于川芎嗪含量的增加，在煎煮过程中所添加的米色液中含有的一定量的杂环化合物会产生少量川芎嗪；随着陈放时间的延长，香醋中的还原糖和氨基酸发生美拉德反应不断降解产生氨基酮，经缩合反应产生了大量的川芎嗪。
本发明从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出高产川芎嗪前体物质-乙偶姻的芽孢菌、醋酸菌、乳酸菌，并将其制备成直投式发酵剂，多菌种协同发酵联合川芎嗪前体添加（乙偶姻、磷酸氢二铵）应用在传统食醋生产中，对于提高山西老陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，本发明的技术方案如下：
一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，具体步骤如下：
高产乙偶姻菌株的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的36株芽孢菌、35株醋酸菌、30株乳酸菌分别进行产乙偶姻能力的测定，最终筛选出高产乙偶姻的莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）15、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）7、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）2416，其含量分别为45.63g/L、16.05g/L、18.30g/L。并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月10日、2018年5月7日、2018年5月7日，保藏编号分别为CGMCC 16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
醋醅模拟培养基中多菌种协同发酵产乙偶姻：将上述所得的三株高产乙偶姻菌株单独和共培养于醋醅模拟培养基中（接种量为2%），最终发现莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）CGMCC 16910、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 15731、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）CGMCC 15730按1:1:1比例复合时，乙偶姻含量最高，为65.28 g/L。
复配直投式发酵剂制备：将活化后的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃，180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃，180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
将复配直投式发酵剂联合前体物质应用在陈醋发酵过程中的具体方法为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵温度为25‒33℃进行酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入120公斤麸皮和80公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量1%复配直投式发酵剂、高粱重量0.1%磷酸氢二铵、高粱重量0.1%乙偶姻等前体物质，控制发酵温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，在熏醅阶段添加高粱重量0.1%磷酸氢二铵后淋醋得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。
采用复配直投式发酵剂联合前体物质应用在山西老陈醋生产中，所得新淋醋中川芎嗪含量为565.85μg/mL，总酸含量为5.78g/100mL，不挥发性酸含量为1.79g/100mL，与对照相比分别提高了547.65%、53.72%、88.42%，有机酸含量和各挥发性香气成分含量均有所提高，最终陈醋的风味显著优于对照例。
所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
本发明从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出高产川芎嗪前体物质-乙偶姻的芽孢菌、醋酸菌、乳酸菌，并将其制备成直投式发酵剂，多菌种协同发酵联合川芎嗪前体添加（乙偶姻、磷酸氢二铵）应用在传统食醋生产中，对于提高山西老陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：高产乙偶姻菌株的筛选
分别采集山西老陈醋酒精发酵阶段的酒醪样品和醋酸发酵阶段的醋醅样品，进行稀释涂布，最终共分离出36株芽孢菌、35株醋酸菌、30株乳酸菌。采用Voges-Proskauer(V-P)反应和分光光度法对其产乙偶姻能力进行测定，其中莫海威芽孢杆菌15、植物乳杆菌7、巴氏醋杆菌2416产乙偶姻最高，其含量分别为45.63g/L、16.05g/L、18.30g/L。
上述的测定乙偶姻的Voges-Proskauer(V-P)反应原理为：乙偶姻在碱性条件下可被氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与带有胍基的肌酸反应，可产生粉红色复合物，该粉红色复合物在波长516nm处有最大吸收峰。
上述的测定乙偶姻的Voges-Proskauer(V-P)反应具体方法为：
（1）乙偶姻标准曲线制作：称取乙偶姻1g，溶于100 mL蒸馏水中，即得1.0 mg/mL乙偶姻溶液，吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4mL于10 mL试管中，编号，补加蒸馏水至3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara (含3%肌酸、0.5%蛋白胨的40%NaOH水溶液)试剂，振荡2 min，37℃条件下反应60 min后，充分振荡均匀后测定516 nm处的吸光值，并绘制标准曲线。
（2）菌株产乙偶姻能力的测定：将从山西老陈醋发酵过程分离得到的36株芽孢菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌按照2%的接种量接种于Voges-Proskauer(V-P)培养基，芽孢菌37℃，180 r/min培养24h；乳酸菌37℃静置培养24h；醋酸菌30℃，180 r/min培养24h，将发酵液8000 r/min离心10 min，取菌株发酵上清液3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara试剂，充分震荡均匀，于37℃条件下反应60 min后，摇匀，用比色法测定各反应液在516 nm处吸光值。
上述的Voges-Proskauer(V-P)培养基的制备方法为：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 5 g，加水至1000 mL，pH调至7.0，于121℃湿热灭菌20 min。
上述高产乙偶姻的莫海威芽孢杆菌15、植物乳杆菌7、巴氏醋杆菌2416，将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月10日、2018年5月7日、2018年5月7日，保藏编号分别为CGMCC 16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
实施例2：醋醅模拟培养基中多菌种协同发酵产乙偶姻
将上述所得的三株高产乙偶姻的菌株莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730单独和共培养于醋醅模拟培养基中（接种量为2%），培养24h后测其发酵液乙偶姻含量。最终发现按1:1:1比例复合时，乙偶姻含量最高（表1），为65.28g/L。上述的醋醅模拟培养基取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。
表1：莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌多菌种协同离位发酵产乙偶姻（醋醅模拟培养基）
实施例3：莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC15730复配直投式发酵剂的制备
（2）将活化后的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃，180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃，180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v），低温喷雾干燥至水分含量为≤5%时，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为复配直投式发酵剂。
上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，制成的复配直投式发酵剂，其活菌数分别为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
上述的MRS培养基的制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠2g，吐温80 1g，无水硫酸镁 0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，pH 6.2‒6.4，121℃，20min灭菌。
实施例4：利用复配直投式发酵剂联合前体物质强化山西老陈醋
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天（经测定温度变化为25‒33℃），拌入前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅）进行醋酸发酵10‒12天（经测定温度变化为24‒47℃），酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度、川芎嗪）（结果见表2），有机酸（结果见表3）及挥发性香气成分（结果见表4）。
实施例5：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1%的复配直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，30℃活化30min），进行醋酸发酵10‒12天。
实施例6：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1%的复配直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，30℃活化30min）和高粱重量0.1%磷酸氢二铵，进行醋酸发酵10‒12天。
实施例7：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1%的复配直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，30℃活化30min）、高粱重量0.1%磷酸氢二铵和高粱重量0.1%乙偶姻，进行醋酸发酵10‒12天。
实施例8：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1%的复配直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，30℃活化30min）、高粱重量0.1%磷酸氢二铵和高粱重量0.1%乙偶姻，进行醋酸发酵10‒12天，并在熏醅阶段加入高粱重量0.1%磷酸氢二铵。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、川芎嗪等理化含量以及有机酸含量，而实施例8显著优于实施例4（对照例）。实施例8得到的新淋醋的川芎嗪含量为565.85μg/mL，总酸含量为5.78g/100mL，不挥发性酸含量为1.79g/100mL，总酯含量为3.73g/100mL，与对照相比分别提高了547.65%、53.72%、88.42%、26.01%（表2）；有机酸总含量由29.8663g/L提高为46.1785g/L，其中乳酸含量为16.0545g/L，乙酸含量为27.5984g/L，比对照组分别提高了89.92%、42.57%（表3）；挥发性香气成分共检测出40种（酯类18种、醇类4种、酸类3种、酮类5种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为3.53g/100mL、醇类总含量为0.97g/100mL、酸类总含量为4.33g/100mL、醛类总含量为18.81g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.03g/100mL）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.33g/100mL）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.19g/100mL）、呈椰子香的癸酸乙酯（0.08
g/100mL）构成了陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香（表4）。
表2：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋理化指标的测定结果
表3：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果
表4：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果
上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的还原糖、总酯、川芎嗪参照GBT 19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。
上述HPLC法测定有机酸含量的具体测定方法为：取样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate 3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH2PO4，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。
上述GC-MS法测定挥发性香气成分的具体测定方法为：采用顶空固相微萃取对样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。
Claims (6)
1.一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：在山西老陈醋的醋酸发酵阶段，添加山西老陈醋土著优良高产乙偶姻的莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌制备的复配直投式发酵剂、乙偶姻及磷酸氢二铵等川芎嗪前体物质；另外在陈醋熏醅阶段，进行了磷酸氢二铵前体物质的再次添加；其中：所述莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期分别为：2018年12月10日，2018年5月7日，2018年5月7日；保藏编号分别为：CGMCC 16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
2.根据权利要求1所述一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：所述复配直投式发酵剂的制备方法为：
将活化后的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃，180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃，180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
3.根据权利要求2所述的一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：所述复配直投式发酵剂联合前体物质应用在山西老陈醋发酵过程中的具体方法为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵温度为25‒33℃进行酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入120公斤麸皮和80公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量1%复配直投式发酵剂、高粱重量0.1%磷酸氢二铵、高粱重量0.1%乙偶姻前体物质，控制发酵温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，在熏醅阶段添加高粱重量0.1%磷酸氢二铵后淋醋得新淋醋。
4.根据权利要求3所述的一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：所制备的新淋醋中川芎嗪含量为565.85μg/mL，总酸含量为5.78g/100mL，不挥发性酸含量为1.79g/100mL，与对照相比分别提高了547.65%、53.72%、88.42%。
5.根据权利要求3所述的一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。
6.根据权利要求2所述的一种多菌种协同发酵联合前体添加提高山西老陈醋川芎嗪含量的方法，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
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