CN112899117A - 红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法 - Google Patents
红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属食醋生产技术领域，提供一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ‑氨基丁酸红枣薏米醋的方法。发芽薏米、薏米糠、酶解红枣汁、L‑谷氨酸钠混合，高产GABA的红曲霉、酵母菌和乳酸菌混菌酒精发酵；结束后补加糖、红枣汁、L‑谷氨酸钠，乳酸菌、芽孢菌和巴氏醋杆菌进行有氧醋酸乳酸发酵；结束后再加乳酸菌进行厌氧二次乳酸发酵。本发明经原料优选，菌种优化配比，多次发酵富集，陈酿，调配，杀菌，灌装制成高γ‑氨基丁酸红枣薏米醋。终产品中不挥发性酸≥2.0g/100mL，黄酮≥120 mg/100mL，GABA≥280.0 mg/100mL，Monacolin K≥120 mg/100mL，有抗氧化、降胆固醇和降血压的功效。
Description
技术领域
本发明属于食醋生产技术领域，具体涉及一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法。
背景技术
红枣是深受人们喜爱且不可多得的药食同源性食品，其维生素含量非常高，有“天然维生素丸”的美誉，具有滋阴补阳，补血之功效；红枣中含有的三萜类化合物及环磷酸腺苷，有抑制癌细胞生长和繁殖的功能；富含的黄酮类化合物‒芦丁，具有维持毛细血管正常抵抗力、降低通透性、减少脆性的作用，可防止毛细血管发脆引起的出血症，用于高血压、血小板减少症和败血症等疾病；含有的多糖是重要的生理活性物质，具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，对提高抗体免疫力具有重要作用。
红枣是山西的特色农产品，由于红枣具有易腐烂变质、耐贮性差的特点，目前红枣的加工主要是以干制为主。而干枣与鲜枣相比，营养成分会有很大损失，且传统的枣制品花色品种少、口味单一，远不能满足广大消费者需求，如何把山西红枣的种植资源优势转变为市场经济优势，是亟待解决的问题。果醋酿造对原料要求较粗放，质量差的，甚至果品加工厂的下脚料均可，红枣醋对于枣的深加工产业的发展，提高经济附加值等具有重要的意义。
陕西师范大学和塔里木大学在最新的研究报道中称γ-氨基丁酸（GABA）可能是红枣、酸枣具有降血脂、改善睡眠保健作用的重要功能成分。
γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，具有降血压、降血糖、抗抑郁、抗焦虑、改善脑机能、利肾健肝、控制哮喘、延缓衰老等一系列保健和生理功能。动植物体中天然存在的 GABA 含量较低导致生产成本较高，因此需要开发 GABA 的高效生产方法。目前 GABA 制备方法以植物源富集法和微生物发酵合成法为主。植物源富集法主要是对谷物类种子如糙米、小麦、荞麦等进行发芽胁迫法富集GABA。发酵法主要是微生物直接发酵基质中的 L–谷氨酸或其盐类通过谷氨酸脱羧酶对底物进行脱羧从而合成GABA，目前合成GABA的微生物类群主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌和芽孢菌。
公开号为CN107541407 A的发明专利“一种富含γ-氨基丁酸的红曲酒酿造方法”中，将大米糖化液、酵母、红曲粉混合进行前发酵，再加入产GABA的耐久肠球菌进行后发酵获得成熟红曲酒醪；经过滤、勾兑、杀菌获得红曲酒。GABA的含量为1.00～1.50g/L丰富了红曲酒的口感和营养，提高了养生保健价值。
公开号为CN105586242 A的发明专利“一种富含γ-氨基丁酸全谷物小米醋的制备”中，以发芽谷物为原料，经液化、糖化，加入大曲、红曲和巴氏醋杆菌进行前期发酵（30～50天）、中期发酵（30～50天）和后期发酵（30～50天），杀菌、灌装而成，经试验证明具有体外清楚超氧阴离子和羟基自由基的抗氧化活性。
公开号为CN109182076 A的发明专利“一种富含乳酸和γ-氨基丁酸的食醋酿造方法”中，在封醅陈酿阶段添加糖，同时接种乳酸菌和产香酵母，封醅陈酿后淋醋煎煮，获得富含富含乳酸和GABA的香醋。
综上所述，以上发明只是简单采用发芽谷物为原料或者是采用红曲、乳酸菌等可能具有发酵富集GABA特性的菌种制备富含γ-氨基丁酸的酒、醋制品。而关于从原料到终产品发酵过程中的GABA富集效果并没有进行跟踪测定；更加缺乏关于菌种优选，组合比例、组合方式等富集GABA的发酵研究试验；造成发酵时间长、富集效率低等问题。另外，发酵原料单一，主要是糙米和小米，造成产品风味单调、缺少层次感。
发明内容
本发明提供了一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法。以发芽薏米、薏米糠、酶解红枣汁、L-谷氨酸钠按照一定比例混合，采用高产GABA的红曲霉、酵母菌和乳酸菌进行混菌酒精发酵；酒精发酵结束后，补加糖、红枣汁、L-谷氨酸钠，高产GABA的乳酸菌、芽孢菌和巴氏醋杆菌进行有氧醋酸乳酸发酵；有氧醋酸乳酸发酵结束后，再添加高产GABA的乳酸菌，进行厌氧二次乳酸发酵。本发明经原料底物优选，菌种优选、配比，多次发酵富集，陈酿，调配，杀菌，灌装制备成高γ-氨基丁酸红枣薏米醋。产品体态清亮，绵酸甜香，风味独特，富含r-氨基丁酸、黄酮和Monacolin K类活性物质，是一种具有抗氧化、降胆固醇、降血压的理想功能保健醋产品。
本发明由如下技术方案实现的：一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，以发芽薏米蒸饭：薏米糠：酶解红枣汁：L-谷氨酸钠：糖化酒精发酵剂：水的质量比为100～120：30～40：100～120：2.5～3.0：20～25：350～450进行混合糖化酒精发酵；酒精发酵结束后，按酒精发酵醪液的体积，补加质量体积比为2%～3%的糖、质量体积比为20%～30%的酶解红枣汁、质量体积比为2.5%～3.0%的L-谷氨酸钠、质量体积比为5%～10%的醋酸乳酸发酵剂进行有氧醋酸乳酸发酵；有氧醋酸乳酸发酵结束后，按醋酸乳酸发酵液的体积，接入质量体积比为4%～8%的高产GABA植物乳杆菌发酵剂，进行厌氧二次乳酸发酵；发酵结束后，纱布过滤，得到的滤液100℃煮制2～3min，常温后熟10～20天后，经硅藻土过滤澄清得红枣薏米原醋；将原醋与糖按比例调配，使终糖度调整为3～4oBrix，超高温瞬时灭菌、灌装制得高γ-氨基丁酸红枣薏米醋成品。
发芽薏米的制备方法为：糙薏米原料挑选、清洗后，用蒸馏水冲洗并沥干，4℃冷激处理12h，30℃～32℃，相对湿度为86%的催芽室中发芽，芽长0.8-1.2mm时，50℃烘干至恒重，即为发芽薏米；
薏米饭的制备方法为：发芽薏米清洗后用水浸泡 8～10h，沥干后倒入卧式蒸饭机蒸煮成熟的薏米饭，80℃蒸1～2h，以熟透无生芯为标准；所述酶解红枣汁的具体制备方法为：红枣清水冲洗去表面的泥沙和杂质，加入8倍重量的水，煮制1～1.2 h，破碎打浆，以红枣浆为计算基准，加入质量体积比为0.2～0.4%的果胶酶于45℃酶解2～3h，即得酶解红枣汁。
糖化、酒精发酵过程中控制品温为30℃～32℃，当发酵8～10天，醪液中酒精度在10-15% v/v时，发酵醪降温至25℃，维持3天结束糖化、酒精发酵。
醋酸乳酸发酵过程为170r/min，30℃恒温发酵，当发酵进行6～8天，发酵至总酸为5～6g/100mL不再上升时，得醋酸乳酸发酵液。
二次乳酸发酵过程为37℃～40℃，静置厌氧二次乳酸发酵1～2天，发酵结束。
所述的糖化酒精发酵剂为：紫色红曲CICC 40268种子液：酿酒酵母CGMCC 15729种子液：植物乳杆菌CGMCC 15731种子液以2:1:0.25的体积比混合制成得复合发酵剂。
所述的紫色红曲霉（Monascus purpureus）CICC 40268，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，具有产γ-氨基丁酸、Monacolin K的优良发酵特性。所述的紫色红曲CICC40268种子液制备方法为：将紫色红曲CICC 40268点接于PDA固体斜面，30℃培养5 d，将活化好的斜面菌种，用无菌生理盐水冲洗得到孢子，孢子转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用滤纸过滤除去菌丝，制备成106cfu/mL的红曲霉孢子悬液装液量为30mL，按5% V/V的接种量接种于种子扩大培养基后， 30℃，180r/min培养5天，活菌量≥1.0×108 cfu/mL，且菌丝球均匀，形态饱满，活力强，即为种子液；种子扩大培养基为：粉碎薏米60g/L，薏米糠60g/L，麦芽糖50g/L，氯化铵3g/L，硫酸镁2g/L，pH=6；
所述的酿酒酵母CGMCC 15729，为本实验室从山西老陈醋酒醪中分离出的具有高产醇、高产酯和高产γ-氨基丁酸的优良菌株。所述的酿酒酵母CGMCC 15729种子液制备方法为：将试管斜面活化的酿酒酵母CGMCC 15729按3%的接种量接入到麦芽汁培养基中，30℃静置培养24h，菌体浓度达106cfu/mL，得酿酒酵母CGMCC 15729种子液。
所述的植物乳杆菌CGMCC 15731，为本实验室从山西老陈醋醋醅中分离出的具有耐受性强、产乳酸高、发酵风味佳和高产γ-氨基丁酸的优良菌株。所述的植物乳杆菌CGMCC15731种子液的制备方法为：将活化的植物乳杆菌CGMCC 15731按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度达到108cfu/mL，即乳酸菌种子液。
所述的醋酸乳酸发酵剂为植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液以1：0.5：1的体积比混合制成得复合发酵剂。
所述的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910，为本实验室从山西老陈醋醋醅中分离出的高产多酚、酯、乙偶姻和高产γ-氨基丁酸的优良菌株。所述的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液的制备方法为：将活化的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃180 r/min培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度达到108cfu/mL，即莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液。
所述的巴氏醋杆菌CGMCC 15730，为本实验室从山西老陈醋醋醅中分离出的具有耐受性强、产酸高和高产γ-氨基丁酸的优良菌株。所述的巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液的制备方法为：将活化的巴氏醋杆菌CGMCC 15730按3%的接种量接入到醋酸菌培养基中，30℃，170 r/min培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度达到108cfu/mL，即巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液。所述的醋酸菌培养基配方组成：葡萄糖2g，酵母膏1g，无水碳酸钙1g，水100mL，121℃，20min灭菌，冷却后加入2mL无水乙醇。
所述调配中原醋与木糖醇、蜂蜜、低聚果糖、白砂糖中的一种或几种混合调配，使终糖度调整为3～4oBrix。所述的超高温瞬时灭菌条件为115～130℃，5～15S，无菌灌装，即得成品高γ-氨基丁酸红枣薏米醋。
本发明所制备产品中：总固形物≥12.0g/100mL，总酸≥5.0g/100mL，不挥发性酸≥2.0g/100mL，黄酮≥120 mg/100mL，GABA≥280.0 mg/100mL，Monacolin K≥120 mg/100mL。产品风味独特，酯香突出，香气富有层次，酸感醇厚。经体外试验证明ACE抑制率、羟基自由基和DPPH清除率均可达90%以上；经动物体内试验进一步证明其具有抗氧化、降胆固醇和降血压的功效。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
（1）本发明优选发芽薏米和红枣作为发酵底物。薏米中含有丰富的氨基酸、薏苡素、薏苡酯、三萜化合物；与其他谷类相比，其所含蛋白质相当于籼米、粳米、糯米的3倍，所含的脂肪相当面粉、莜麦面的2～3倍；所含钙、磷、铁也分别比大米糯米多数倍，是我国传统药食两用食材，其营养丰富被誉为“世界禾本科植物之王”。具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血钙、降血压及抑制胰蛋白酶、诱发排卵等药理活性。薏米的应用增加了本发明产品的营养保健功能。
薏米经适宜的温度、时间浸泡发芽处理后，谷氨酸脱羧酶（GAD）、蛋白酶等内源酶被激活，促进蛋白质分解增加谷氨酸的含量，谷氨酸进一步在GAD的催化下生成GABA，使GABA得到富集。
据研究报道称GABA可能是红枣、酸枣具有降血脂、改善睡眠保健作用的重要功能成分。
本发明将发芽薏米、红枣汁进行混合共发酵，干果和谷物发酵底物中的营养因子得到了互相补充，更加有利于菌体细胞的增殖，使发酵更充分，更加有利于原料中多酚、黄酮、GABA的发酵富集提取；并且克服了以往单独采用粮食或果品进行液态发酵风味过于单调的问题。
（2）本发明优选的原料底物中除了发芽薏米和红枣，还添加了薏米糠和L-谷氨酸钠。薏米糠为薏米加工的副产物，占薏米总重的 5%，薏米糠现仅作饲料开发、附加值低。目前，有关于采用稻米糠，麦麸和米糠发酵富集GABA的研究报道，但鲜有关于发酵薏米糠产GABA的报道。本发明采用薏米糠作为生产高GABA食醋的重要原料，对薏米加工产品的附加值提高及产业链延伸具有重要意义。原料底物中L-谷氨酸钠的分次加入，进一步提高了产品中GABA的富集量。
（3）本发明采用的酵母菌、乳酸菌、芽孢菌均为本实验室从山西老陈醋酒醪、醋醅中分离出的土著优良菌株，其具有高产酶、产醇、产酯、产酸和发酵风味佳等优良发酵特性，相比于大多数发明专利采用的商业菌株，本发明中的发酵菌种与原料的适应性更佳，发酵效率和发酵品质更优。
其中，紫色红曲霉CICC 40268的加入，赋予产品诱人色泽，香气及另一重要功能因子Monacolin K；而植物乳杆菌CGMCC 15731的加入，使产品中主要不挥发性酸–乳酸的含量得到显著提升；而莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910为一株高产食醋中特征功能成分川芎嗪的重要前体物质–乙偶姻的菌株，增加了产品的风味和功能。
更重要的是，除了上述提到的优良发酵特性，以上菌株均为实验室优选出的GABA高产菌株， 各优良菌株经优化配比制成的复合发酵菌剂，具有协同发酵作用，比单一菌株富集GABA的效果更好。
（4）传统食醋酿造包括酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段，本发明则在酒精发酵阶段后，采用复合乳酸菌、芽孢菌、醋酸菌进行有氧醋酸乳酸发酵；有氧醋酸乳酸发酵结束后，再添加乳酸菌，进行厌氧二次乳酸发酵。使得产品中的乳酸、柠檬酸等有机酸的含量得到二次提升，缓冲了醋酸形成的刺激性风味，使产品酸味更加柔和，并且提升了乳酸乙酯等风味物质的生成，丰富了产品的口感。
（5）本发明所制备产品中富含不挥发性酸、黄酮、GABA、Monacolin K功能成分，经动物试验证明其具有抗氧化、降胆固醇和降血压的功效。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：发芽薏米的制备
糙薏米原料经挑选、清洗后，用蒸馏水冲洗并沥干，于4℃冷激处理12h后，放入温度为30℃～32℃，相对湿度为86%的催芽室中发芽，芽长1mm左右时，50℃烘干至恒重，即为发芽薏米。
试验测定结果表明，经发芽处理后，薏米原料中GABA的含量由原来的15～20mg/100g提高到50～60mg/100g，提高了近3倍。研究报道称逆境胁迫条件下如低温、缺氧、高盐、超声波等，会刺激植物体内的H+和Ca2+增加，从而激活GAD促进GABA积累。
实施例2：一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋
（1）原料处理：将发芽薏米用水浸泡 10h，沥干后倒入卧式蒸饭机蒸煮成熟的薏米饭，80℃蒸1.5h，以熟透无生芯为标准；红枣清水冲洗去表面的泥沙和杂质，加入8倍重量的水，煮制1～1.2 h，破碎打浆，加入0.2～0.4%（w/v）的果胶酶于45℃酶解2～3h，即得红枣酶解汁。
（2）糖化、酒精发酵：以发芽薏米蒸饭：薏米糠：红枣汁：L-谷氨酸钠：糖化酒精发酵剂：水质量比为100： 30： 100：2.5：20：400进行混合糖化酒精发酵，发酵温度为30℃～32℃，当发酵8～9天，醪液中酒精度在13% （v/v）左右时，发酵醪降温至25℃，维持3天结束。
糖化酒精发酵剂制备方法：紫色红曲CICC 40268种子液：酿酒酵母CGMCC 15729种子液：植物乳杆菌CGMCC 15731种子液以2:1:0.25的体积比混合制成得复合发酵剂。
紫色红曲CICC 40268种子液制备方法：将紫色红曲CICC 40268点接于PDA固体斜面，30℃培养5 d，将活化好的斜面菌种，用无菌生理盐水冲洗得到孢子，孢子转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用滤纸过滤除去菌丝，制备成106cfu/mL的红曲霉孢子悬液装液量为30mL，按5% V/V的接种量接种于种子扩大培养基后， 30℃，180r/min培养5天，菌体浓度为108 cfu/mL，且菌丝球均匀，形态饱满，活力强，即为种子液；种子扩大培养基为：粉碎薏米60g/L，薏米糠60g/L，麦芽糖50g/L，氯化铵3g/L，硫酸镁2g/L，pH=6。
酿酒酵母CGMCC 15729种子液制备方法为：将试管斜面活化的酿酒酵母CGMCC15729按3%的接种量接入到麦芽汁培养基中，30℃静置培养24h，菌体浓度为106cfu/mL，得酿酒酵母CGMCC 15729种子液。
植物乳杆菌CGMCC 15731种子液的制备方法为：将活化的植物乳杆菌CGMCC 15731按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度为108cfu/mL，即乳酸菌种子液。
（3）醋酸乳酸发酵：酒精发酵结束后，按酒精发酵醪液的体积，补加2%（w/v）的糖、30%（w/v）的红枣汁、2.5%（w/v）的L-谷氨酸钠和10%的醋酸乳酸发酵剂进行有氧醋酸乳酸发酵，发酵温度为30℃，170r/min，发酵进行6～8天，发酵至总酸为5～6g/100mL，得醋酸乳酸发酵液。
醋酸乳酸发酵剂制备方法：植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液以1：0.5：1的体积比混合制成得复合发酵剂。
莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液的制备方法为：将活化的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃180 r/min培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度为108cfu/mL，即莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液。
巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液的制备方法为：将活化的巴氏醋杆菌CGMCC 15730按3%的接种量接入到醋酸菌培养基中，30℃，170 r/min培养24h，菌体浓度达108cfu/mL，8000r/min，离心10min得菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤菌体两次后重悬菌体，使浓度为108cfu/mL，即巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液。所述的醋酸菌培养基配方组成：葡萄糖2g，酵母膏1g，无水碳酸钙1g，水100mL，121℃，20min灭菌，冷却后加入2mL无水乙醇。
（4）二次乳酸发酵：有氧醋酸乳酸发酵结束后，按醋酸乳酸发酵液的体积，接入5%（w/v）的高产GABA植物乳杆菌发酵剂（植物乳杆菌CGMCC 15731种子液），进行静置厌氧二次乳酸发酵，发酵温度为40℃，发酵时间为2天。
（5）后熟、调配、灌装
二次乳酸发酵结束后，纱布过滤，得到的滤液100℃煮制2～3min，常温后熟20天后，经硅藻土过滤澄清得红枣薏米原醋。在原醋中添加2%（w/v）木糖醇、2%（w/v）的低聚果糖、2%（w/v）的蜂蜜，115～130℃，5S，无菌灌装，即得成品高γ-氨基丁酸红枣薏米醋。
对比例1：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋制备（除保留紫色红曲CICC 40268外，其余所有用到的发酵菌株均为通常商业菌株。）
将实施例2中所述的酿酒酵母CGMCC 15729菌种替换为商业安琪生香活性酵母（生香ADY，适用于白酒生产）；所述的植物乳杆菌CGMCC 1573菌种替换为植物乳杆菌CICC20022(适用于乳酸食品生产)；所述的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910菌种替换为枯草芽孢杆菌CICC 10028（用于淀粉液化）；所述的巴氏醋杆菌CGMCC 15730菌种替换为巴氏醋杆菌CICC 20001（适用于酿造食醋）。
种子液制备方法同实施例2。
其余制备方法、操作步骤同实施例2。
对比例2：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的制备（醋酸乳酸发酵剂菌种只有巴氏醋杆菌CGMCC 15730，不添加乳酸菌和芽孢菌）。
实施例2中所述的醋酸乳酸菌发酵剂为：为植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液以1：0.5：1的体积比混合制成得复合发酵剂；对比例2中的醋酸乳酸菌发酵剂为：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液（菌体浓度为108 cfu/mL）；即只添加巴氏醋杆菌CGMCC 15730进行单纯醋酸发酵。
种子液制备方法同实施例2。
其余制备方法、操作步骤同实施例2。
对比例3：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的制备（醋酸乳酸发酵剂菌种为巴氏醋杆菌CGMCC 15730和植物乳杆菌CGMCC 15731的复合菌剂，不添加芽孢菌）。
实施例2中所述的醋酸乳酸菌发酵剂为：为植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液以1：0.5：1的体积比混合制成得复合发酵剂；对比例2中的醋酸乳酸菌发酵剂为：植物乳杆菌CGMCC 15731种子液（菌体浓度为108 cfu/mL）：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液（菌体浓度为108 cfu/mL）以1：1的体积比混合制成得复合发酵剂；即不添加芽孢杆菌CGMCC 16910。
种子液制备方法同实施例2。
其余制备方法、操作步骤同实施例2。
对比例4：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的制备（不进行乳酸二次发酵）
醋酸乳酸发酵结束后，不进行乳酸二次发酵，直接进入后熟操作。
其余制备方法、操作步骤同实施例2。
表1 高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的理化及体外生物活性测定
通过实施例2与对比例相比较，表明按照实施例2中方案制备的高γ-氨基丁酸红枣薏米醋中不挥发性酸、黄酮、GABA和Monacolin K的含量显著高于对照例1、2、3和4。并且，羟基自由基清除率、DPPH清除率和ACE抑制率也显著高于对比例1、2、3和4。
与对比例1中采用商业菌株发酵相比，本发明的优选例–实施例2中采用的酵母菌、乳酸菌、芽孢菌、醋酸菌均为本实验室从山西老陈醋酒醪、醋醅中分离出的土著优良菌株，其具有高产酶、产醇、产酯、产酸、不挥发性酸和高产GABA及发酵风味佳等优良特性；并且本发明采用的菌株来源于食醋发酵环境，其与原料的适应性更佳，发酵效率和发酵品质更优。
与对比例2中只添加巴氏醋杆菌CGMCC 15730进行单纯醋酸发酵相比，本发明的优选例–实施例2中则采用体积比为植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液为1：0.5：1的复合发酵剂进行协同醋酸乳酸发酵。其中植物乳杆菌CGMCC 15731为高产GABA和不挥发性酸的优良菌株；而莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910除了具有高产GABA、多酚、黄酮的优良特性外，还是一株高产食醋中特征功能成分川芎嗪的重要前体物质–乙偶姻的菌株，进一步提升了产品的功能和丰富了产品的风味。另外，这3株优良菌株经优化配比进行复合协同发酵，比单一菌株富集GABA的效果更好。
不添加莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910 （对比例3）的发酵产品中的黄酮和GABA的含量显著降低。芽孢菌作为食醋酿造过程中的重要菌群，对食醋风味和功能成分的形成起到重要作用。芽孢菌代谢产生多种酶类，分解原料提供微生物的碳源和氮源；芽孢菌在醋酸发酵阶段代谢产生的乳酸、苹果酸、酒石酸、丙酮酸等不挥发性有机酸，一方面能缓冲乙酸带来的强烈刺激性酸味，另一方面可以与醇类物质酯化生成酯类物质，丰富食醋味感与口感；并且芽孢菌通过特定代谢途径参与多酚、黄酮、乙偶姻和GABA等功能活性物质的生成。
与对比例4醋酸乳酸发酵结束后，不进行乳酸二次发酵，直接进入后熟操作相比，本发明的优选例–实施例2在有氧醋酸乳酸发酵结束后，再添加植物乳杆菌CGMCC 15731，进行厌氧二次乳酸发酵，使得产品中的乳酸、柠檬酸等不挥发性酸的含量得到二次提升，缓冲了醋酸形成的刺激性风味，使产品酸味更加柔和，并且提升了乳酸乙酯等风味物质的生成，丰富了产品的口感和增强了产品的生理功能。
实施例3：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋降胆固醇、护肝、抗氧化功能
SD雄性大鼠，适应实验环境1周后，将大鼠随机分为正常组、高脂模型组和高γ-氨基丁酸红枣薏米醋，每组10只。正常组给予基础饲料；高脂模型组和高γ-氨基丁酸红枣薏米醋给予高脂饲料。高γ-氨基丁酸红枣薏米醋每天灌胃高γ-氨基丁酸红枣薏米醋（制备方法见实施例2），灌胃剂量为5mL/kg体重；高脂模型组与正常组则灌胃等量生理盐水。自由摄取食物和水，动物房温度（22±2）℃，湿度（56±5）%。饲养40天后，大鼠经水合氯醛麻醉，心脏刺穿采血处死，按照试剂盒说明书测定大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C和TG的含量及肝脏SOD、GSH-Px和MDA氧化应激指标。
基础饲料： 蛋白质32%，脂肪5%，纤维素2%，Ca 1.8%，P 1.2%，无氮提取物58 % ，购于北京康桥饲料公司。
高脂饲料：基础饲料83.5%，胆固醇1%，猪油10%，牛胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%。
表2 高γ-氨基丁酸红枣薏米醋对饲喂高脂饲料大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C和TG的影响
注：均值 (SD，标准偏差) (n = 10)；与模型组相比，**表示P<0.01，呈显著性差异
由表2可知，本发明产品红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋，可以显著降低饲喂高脂饲料大鼠血清TC、LDL-C和TG的浓度，证明本产品具有降胆固醇、降血脂功效。HDL-C的含量在三组之间并没有显著的差异，但灌胃高GABA红枣薏米醋的大鼠血清中的HDL-C浓度高于对照组和模型组。HDL-C是血浆中胆固醇运回肝脏的主要方式之一，血清中HDL-C含量与胆固醇运回肝脏中的能力成正比，含量越高能力越强，机体心血管就越健康。
表3高γ-氨基丁酸红枣薏米醋对饲喂高脂饲料大鼠血清ALT，AST活性及肝脏SOD、GSH和MDA的影响
注：均值 (SD，标准偏差) (n = 10)；与模型组相比，**表示P<0.01，呈显著性差异
由表3可知，本发明产品红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋，可以显著降饲喂高脂饲料大鼠血清中ALT和AST的活性，降低肝细胞损伤程度，具有良好的护肝效果。模型组与正常对照组相比，高脂模型组的大鼠肝脏中SOD、GSH水平显著降低，MDA的含量显著升高，而灌胃高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的大鼠肝脏抗氧化指标均有显著改善。有文献报道称肝脏损伤与氧化应激有明显的关联机制，肝脏的脂肪病变产生活性氧，当机体内抗氧化系统，如抗氧化酶–SOD、GSH等来不能及时清除这些氧自由基时，就会氧化应激反应，而脂质的过量沉积为脂质过氧化损伤提供了反应基质，生成的大量过氧化物–MDA等聚集，进一步刺激了肝脏细胞产生大量炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素等，可能会加重肝脏炎症的反应并导致肝细胞死亡、肝纤维化。
本发明产品中富含GABA、黄酮和乳酸等有机酸活性成分。GABA和黄酮是公认的具有降血脂和抗氧化的活性成分。有机酸如乳酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸等也具有预防、缓减脂肪肝病变的功效。脂肪肝引起的代谢紊乱涉及TCA循环、乙醛和二羧酸代谢、丁酸代谢、酮体代谢、甘氨酸、丝氨酸代谢等几个主要代谢通路，因此有机酸的补充具有预防、辅助治疗脂肪肝的功效。
实施例4：高γ-氨基丁酸红枣薏米醋调节大鼠血压功能
自发性高血压雄性SHR大鼠，体重200±10克。将大鼠随机分为3组，每组10只，分为模型对照组组、卡托普利阳性组和高γ-氨基丁酸红枣薏米醋组。卡托普利阳性组每天灌胃5.0mg/kg体重的卡托普利，高γ-氨基丁酸红枣薏米醋组每天灌胃5mL/kg体重的高γ-氨基丁酸红枣薏米醋，模型对照组每天灌胃等量生理盐水。12 h 昼夜间断照明，室温控制在26℃，相对湿度为 50-70%，自由进食饮水。
在实验30天和50天测量各组大鼠尾动脉血压，测定 3 次取平均值，并计算平均压。为防止短期降压效果的干扰，血压测量时间与灌胃时间间隔为 8 h。
表4 高γ-氨基丁酸红枣薏米醋对高血压大鼠血压的影响
注：均值 (SD，标准偏差) (n = 10)；与模型组相比，**表示P<0.01，呈显著性差异
由表4可知，本发明产品红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋具有明显的降血压功效。
Claims (8)
1.一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：以发芽薏米蒸饭：薏米糠：酶解红枣汁：L-谷氨酸钠：糖化酒精发酵剂：水的质量比为100～120：30～40：100～120：2.5～3.0：20～25：350～450进行混合糖化酒精发酵；酒精发酵结束后，按酒精发酵醪液的体积，补加质量体积比为2%～3%的糖、质量体积比为20%～30%的酶解红枣汁、质量体积比为2.5%～3.0%的L-谷氨酸钠、质量体积比为5%～10%的醋酸乳酸发酵剂进行有氧醋酸乳酸发酵；有氧醋酸乳酸发酵结束后，按醋酸乳酸发酵液的体积，接入质量体积比为4%～8%的高产GABA植物乳杆菌发酵剂，进行厌氧二次乳酸发酵；发酵结束后，纱布过滤，得到的滤液100℃煮制2～3min，常温后熟10～20天后，经硅藻土过滤澄清得红枣薏米原醋；将原醋与糖按比例调配，使终糖度调整为3～4oBrix，超高温瞬时灭菌、灌装制得高γ-氨基丁酸红枣薏米醋成品。
2.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：发芽薏米的制备方法为：糙薏米原料挑选、清洗后，用蒸馏水冲洗并沥干，4℃冷激处理12h，30℃～32℃，相对湿度为86%的催芽室中发芽，芽长0.8-1.2mm时，50℃烘干至恒重，即为发芽薏米；
薏米饭的制备方法为：发芽薏米清洗后用水浸泡 8～10h，沥干后倒入卧式蒸饭机蒸煮成熟的薏米饭，80℃蒸1～2h，以熟透无生芯为标准；
所述酶解红枣汁的具体制备方法为：红枣清水冲洗去表面的泥沙和杂质，加入8倍重量的水，煮制1～1.2 h，破碎打浆，以红枣浆为计算基准，加入质量体积比为0.2～0.4%的果胶酶于45℃酶解2～3h，即得酶解红枣汁。
3.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：糖化、酒精发酵过程中控制品温为30℃～32℃，当发酵8～10天，醪液中酒精度在10-15% v/v时，发酵醪降温至25℃，维持3天结束糖化、酒精发酵。
4.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：醋酸乳酸发酵过程为170r/min，30℃恒温发酵，当发酵进行6～8天，发酵至总酸为5～6g/100mL不再上升时，得醋酸乳酸发酵液。
5.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：二次乳酸发酵过程为37℃～40℃，静置厌氧二次乳酸发酵1～2天，发酵结束。
6.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：所述的糖化酒精发酵剂为：紫色红曲CICC 40268种子液：酿酒酵母CGMCC 15729种子液：植物乳杆菌CGMCC 15731种子液以2:1:0.25的体积比混合制成得复合发酵剂。
7.根据权利要求1所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋，其特征在于：所述的醋酸乳酸发酵剂为植物乳杆菌CGMCC 15731种子液：莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910种子液：巴氏醋杆菌CGMCC 15730种子液以1：0.5：1的体积比混合制成得复合发酵剂。
8.根据权利要求4所述的一种红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法，其特征在于：所述调配中糖为木糖醇、蜂蜜、低聚果糖、白砂糖中的一种或几种，原醋与糖混合调配，使终糖度调整为3～4oBrix；所述的超高温瞬时灭菌条件为115～130℃，5～15S。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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