CN109652347A - 一种建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法 - Google Patents

一种建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属微生物技术领域，提供一种建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法。将山西老陈醋土著高产醇酿酒酵母，高产酯蒿草假丝酵母，高产乙偶姻、产酯能力佳的莫海威芽孢杆菌，高产不挥发性酸植物乳杆菌，高产酸和乙偶姻、耐受性强的巴氏醋杆菌进行互作试验。将酿酒酵母、蒿草假丝酵母、莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌制成酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂，莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌制成醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂强化用于山西老陈醋生产，得新淋醋中总酸6.23g/100mL，不挥发性酸2.68g/100mL，总酯5.88g/100mL，川芎嗪335.65μg/mL，丰富有机酸和挥发性香气的谱图及含量。

Description

一种建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多 阶段强化的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法。
背景技术
山西老陈醋醋香浓郁，酯香醇厚，富含氨基酸、维生素、矿物质、有机酸和多酚、黄酮、川芎嗪、类黑精等多种营养及功能活性物质，是山西的特色产品，也是我国民族瑰宝。目前，山西老陈醋仍是以高粱为原料，麸皮和谷糠为辅料，大曲为发酵剂，经过酒精发酵、醋酸发酵、熏淋、陈酿等传统自然固态发酵工艺制成。其中，大曲的质量是影响陈醋酿造的最关键因素，但由于目前受制曲工艺、制曲条件和贮存环境的影响，容易出现曲活力不强、不稳定、用曲量大、成本高、原料利用率低、发酵周期长、成品醋风味欠佳等问题。
针对以上问题，一些山西老陈醋企业人为添加安琪酵母和糖化酶等用以提高生产效率，降低大曲用量，降低成本，但添加方式过于简单，缺乏科学依据，没有考虑原有大曲、陈醋发酵过程中微生物群落的多样性、复杂性；强化酵母的适应性及与土著菌群的互作代谢特性等，因此强化效果不明显，甚至由于人为破坏了原有传统发酵工艺土著菌群的多样性和平衡性，导致发酵风味变差等问题。
近年来，也有一些学者对山西老陈醋的优良酿造菌种进行了筛选，并应用在陈醋的发酵生产中。山西大学的赵良启等也将高产乙醇和乙酸乙酯的酵母和经诱变产生的高产糖化酶菌株LiCl IV7-3l联合应用在陈醋生产中，最终使原料淀粉利用率提高了27%，酒精产量提高34%，乙酸乙酯的含量提高了1倍。公布号CN106753994A公布了一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法。菌株分离自传统山西老陈醋大曲，具有独特性，表现出极强的耐高温、耐酸、耐乙醇、耐高渗性能；生产的白酒中异戊醇含量显著地降低了，酯类中除丁酸乙酯和乙酸异丁酯外，其他酯类含量均有不同程度的提高，因而呈现出不同的感官品质。
但是纵观上述研究，存在以下不足：缺乏菌种互作研究，只有充分考虑了菌种间在不同环境下的互作机制，才能最大程度地发挥菌株的优势和功能；强化方式简单，大都是单菌种或双菌种单阶段，一次性添加强化。
发明内容
本发明提供了一种菌种互作的山西老陈醋复合菌剂及其多阶段强化陈醋生产的方法。建立在山西老陈醋传统固态酿造过程中分离筛选出优良菌株共5株，综合优势、优良菌种互作试验结果，创新开发出山西老陈醋复合菌剂，并进行多阶段强化应用在传统固态食醋的生产中。
本发明由如下技术方案实现的：建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，所述菌种互作的山西老陈醋复合菌剂的菌种为：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、蒿草假丝酵母（Candida humilis）、莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）均分离自山西老陈醋发酵过程，所述菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月25日和2018年12月10日，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 16913、CGMCC16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
所述的酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730分离的具体方法为：
（1）菌株的分离鉴定：从山西老陈醋酿造过程中分离出菌株，建立菌种资源库，并对菌进行鉴定，包括霉菌75株、酵母菌75株、芽孢菌411株、乳酸菌51株、醋酸菌66株；细菌16SrDNA V4区DNA片段扩增所用的引物为：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’，真菌ITS1区所用的引物为：ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2R：5’-GCTGCGT TCTTCATCGATGC-3’；
（2）优良菌株的筛选、保藏：经初筛后，对其中10株霉菌、42株酵母菌、36株芽孢菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌进行高产特性、耐受特性复筛，筛选出高产醇的酿酒酵母（产醇7.0%）、高产酯蒿草假丝酵母（产酯10.70 g/100mL）、高产乙偶姻、产酯能力佳的莫海威芽孢杆菌（乙偶姻45.63g/L）、高不挥发性酸的植物乳杆菌（不挥发酸0.61g/100mL）、高产酸和乙偶姻、耐受性强的巴氏醋杆菌（产酸75.2g/L）。所述菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月25日和2018年12月10日，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 16913、CGMCC 16910、CGMCC15731、CGMCC 15730。
山西老陈醋优良土著酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间的互作方法为：将培养好的酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913分别与培养好的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按1:1:1（1:1:1:1）的比例接入高粱汁培养基；将培养好的巴氏醋杆菌CGMCC 15730分别与培养好的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按1:1（1:1:1）的比例接入醋醅模拟培养基，30℃静置培养6d后测其菌株生物量，考察之间有无抑制作用。实验结果表明酿酒酵母、蒿草假丝酵母、莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌之间在生物量上无明显抑制作用，互作时提高了有机酸的含量，并且丰富了挥发性香气的谱图。
在山西老陈醋优良土著酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731进行菌种互作实验证明它们之间没有明显抑制的基础上，将酿酒酵母、蒿草假丝酵母、莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌以1:1:1:1的比例制备成酒精阶段的复配直投式发酵剂；在山西老陈醋优良土著莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730进行菌种互作实验证明它们之间没有明显抑制的基础上，将莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌以1:1:1的比例制备成醋酸阶段的复配直投式发酵剂。
所述复配直投式发酵剂的具体制备方法为：
（1）酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂：将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913按照3%的接种量分别接入到PDA液体培养基，30℃静置培养24h；将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731干粉按质量比1:1:1:1混合即为酒精发酵阶段复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
（2）醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂：将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃下180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
利用所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，具体步骤为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，再加入高粱重量1.0%的酒精发酵阶段复配直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量1.0%的醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋。
所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酸含量为6.23g/100mL，不挥发性酸含量达2.68g/100mL，总酯含量为5.88g/100mL，川芎嗪含量为335.65μg/mL，分别比对照组提高了66.22%、182.10%、98.64%、284.17%，并且还丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量。
附图说明
图1为酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC16910和植物乳杆菌CGMCC 15731在高粱汁培养基中纯培养和共培养后各菌株的生物量；图中：A为酿酒酵母CGMCC 15729的生物量；B为蒿草假丝酵母CGMCC 16913的生物量；C
为莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910；D为植物乳杆菌CGMCC 15731的生物量；
图2为酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC16910和植物乳杆菌CGMCC 15731在高粱汁培养基纯培养和共培养后的有机酸含量热图；
图3为酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC16910和植物乳杆菌CGMCC 15731在高粱汁培养基纯培养和共培养后的挥发性香气含量热图；
图4为巴氏醋杆菌CGMCC 15730、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910和植物乳杆菌CGMCC15731在醋醅培养基中纯培养和共培养后各菌株的生物量；图中：A为巴氏醋杆菌CGMCC15730的生物量；B为莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910；C为植物乳杆菌CGMCC 15731的生物量；
图5为巴氏醋杆菌CGMCC 15730、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910和植物乳杆菌CGMCC15731在醋醅模拟培养基纯培养和共培养后的有机酸含量热图；
图6为巴氏醋杆菌CGMCC 15730、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910和植物乳杆菌CGMCC15731在醋醅模拟培养基纯培养和共培养后的挥发性香气含量热图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：菌的分离、鉴定与优良菌株的筛选
（1）菌的分离：对山西老陈醋酿造过程中酒醪和醋醅样品进行梯度稀释，并将其涂布于MRS培养基、醋酸菌基础培养基、孟加拉红培养基，分别将其放置在30℃、37℃的恒温培养箱中培养48h。选择合适的稀释度（30‒300个）挑取典型的菌株的单个菌落，分别于培养基上三区划线纯化，观察单个菌落的表面形态及显微形态，若单个菌落的形态一致，则认为此菌落为纯种，转接斜面保藏。从山西老陈醋酿造过程中共分离出菌株3000余株，建立菌种资源库。
（2）菌株的鉴定：对其中600多株菌进行鉴定，包括霉菌75株、酵母菌75株、芽孢菌411株、乳酸菌51株、醋酸菌66株。上述采用SDS-CTAB法提取基因组，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增所用的引物为：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’，真菌ITS1区所用的引物为：ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2R：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
（3）优良菌株的筛选：对鉴定的600多株菌进行筛选，经初筛后，对其中10株霉菌、42株酵母菌、36株芽孢菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌进行优良特性（高产特性、耐受特性）复筛。最终筛选出高产醇的酿酒酵母（产醇7.0%）、高产酯的蒿草假丝酵母（产酯10.70 g/100mL）、高产乙偶姻、产酯能力佳的莫海威芽孢杆菌（乙偶姻45.63g/L）、高不挥发性酸的植物乳杆菌（不挥发酸0.61g/100mL）、高产酸和乙偶姻、耐受性强的巴氏醋杆菌（产酸75.2g/L）。所述菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月25日和2018年12月10日，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 16913、CGMCC 16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
上述所述的孟加拉红培养基配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，高压121℃灭菌20min。
上述所述的MRS培养基配方为：牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，吐温80 1.0mL，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖20.0g，柠檬酸二铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠 2.0 g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05 g，琼脂20.0 g，pH6.2~6.4，高压121℃灭菌20 min。
上述所述的醋酸菌培养基配方为：10.0酵母浸膏，10.0 g葡萄糖，20.0 g琼脂，加至水1000mL，高压121℃灭菌20 min后加入10.0g无菌碳酸钙和40.0mL无水乙醇。
菌株产醇性能的具体测定方法为：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。通过观察液体培养基产气泡的情况，培养5天后，待糖度不再变化，取100mL样液于蒸馏瓶中，加入50mL蒸馏水，再加入数粒玻璃珠，蒸馏出100mL液体于量筒中，用擦干的酒精计读出示数，再查温度与浓度换算表，换算到20℃下的酒精度。
上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000U）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤得滤液于121℃灭菌20min备用。
菌株产酯性能的具体测定方法为：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。吸取10mL发酵5d后的试样溶液量取90mL蒸馏水定容；吸取20mL样品稀释液置于200mL烧杯中，加入60mL蒸馏水，用0.05mol/L的NaOH标液滴定，以pH8.2为终点；将上述样液倒入250mL的锥形瓶中，再准确加入以0.1mol/L氢氧化钠标准溶液20mL，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流0.5 h，取下，冷却至室温。然后，用盐酸标准溶液进行反滴定，以pH8.2为终点，记录消耗盐酸标准溶液的体积，从而计算出总酯含量。
菌株产乙偶姻能力的测定：将活化后的芽孢菌和醋酸菌按照2%的接种量接种于Voges-Proskauer(V-P)培养基，37℃，180 r/min培养24h后，将发酵液8000 r/min离心10min，取菌株发酵上清液3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara试剂，充分震荡均匀，于37℃条件下反应60 min后，摇匀，用比色法测定各反应液在516 nm处吸光值。
上述Voges-Proskauer(V-P)培养基的制备方法为：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO45 g，加水至1000 mL，pH调至7.0，于121℃湿热灭菌20 min。
菌株产酯的具体测定方法为：将活化后的芽孢菌按3%的接种量分别接入高粱汁培养基，37℃，180 r/min培养6天后取样10g，加90mL蒸馏水浸泡0.5h‒1h，间断搅拌，之后4000r/min离心10 min取上清备用。并采用氢氧化钠皂化法测定其产酯量。所述的采用氢氧化钠皂化法测定其产酯量具体方法为：取上述备用样品10mL加入30mL蒸馏水于锥形瓶中，用0.05mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH为8.2时，再准确加入0.1mol/L氢氧化钠标准溶液20mL，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流0.5h，取下，冷却至室温，用盐酸标准溶液进行反滴定，以pH 8.2为终点，记录消耗盐酸标准溶液的体积。
菌株产总酸的具体测定方法为：将活化菌株按照2%的接种量接种于醋酸菌液体培养基，30℃，180 r/min培养2天后，取菌株发酵液3mL，加入27mL蒸馏水稀释10倍，用0.05 %的NaOH溶液滴定至pH为8.2，记录下消耗的NaOH溶液体积。
菌株耐受性能的具体测定方法为：将活化的菌株按2%接种量分别接种到不同酒精浓度（2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）、不同pH梯度（3、4、5、6、7）的醋酸菌液体培养基中，分别于（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）180 r/min培养24h后，测OD 600nm 菌体浓度，比较菌株的耐受性。
实施例2：山西老陈醋优良土著酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间的互作
（1）酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731之间的互作：将培养好的酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913分别与培养好的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按1:1:1（1:1:1:1）的比例接入高粱汁培养基，30℃静置培养6d后测其菌株生物量，考察之间有无抑制作用。实验结果表明酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910和植物乳杆菌CGMCC 15731之间在生物量上无明显抑制作用（图1），互作时提高了有机酸的含量，并且丰富了挥发性香气的谱图（图2、图3）。
上述的互作实验具体实验方法为：将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731分别按3%的接菌量接入MRS培养基，并用空培养基调莫海威芽孢杆菌浓度为1×106cfu/mL，调植物乳杆菌CGMCC 15731浓度为1×108cfu/mL备用；将酿酒酵母CGMCC15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913分别按3%的接菌量接入PDA培养基，并用相应空培养基调其浓度均为1×106cfu/mL备用；将调整好浓度的菌液按照1:1:1（1:1:1:1）的比例接入高粱汁培养基，于30℃静置培养6d。每48h取样并进行梯度稀释涂布，莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731采用MRS平板对其进行生物量测定；酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913采用PDA平板对其进行生物量测定。
（2）莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731和巴氏醋杆菌CGMCC15730之间的互作：将培养好的巴氏醋杆菌CGMCC 15730分别与培养好的莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按1:1（1:1:1）的比例接入醋醅模拟培养基，30℃静置培养6d后测其菌株生物量，考察之间有无抑制作用。实验结果表明莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731和巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间在生物量上无明显抑制作用（图4），互作时提高了有机酸的含量，并且丰富了挥发性香气的谱图（图5、图6）。
上述的互作实验具体实验方法为：将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731分别按3%的接菌量接入MRS培养基，并用空培养基调莫海威芽孢杆菌浓度为1×106cfu/mL，调植物乳杆菌CGMCC 15731浓度为1×108cfu/mL备用；将巴氏醋杆菌CGMCC15730按3%的接菌量接入醋酸菌基础培养基，并用相应空培养基调其浓度均为1×106cfu/mL备用；将调整好浓度的菌液按照1:1（1:1:1）的比例接入醋醅模拟培养基，于30℃静置培养6d。每48h取样并进行梯度稀释涂布，莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC15731采用MRS平板对其进行生物量测定；巴氏醋杆菌CGMCC 15730采用醋酸菌基础培养基平板对其进行生物量测定。
上述HPLC法测定有机酸含量的方法如下：取上述培养6天的样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate 3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH2PO4，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。
上述GC-MS法测定挥发性香气成分的方法如下：采用顶空固相微萃取对上述培养6天的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。
上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000U）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤得滤液于121℃灭菌20min备用。上述醋醅模拟固体培养基的制备方法为：取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。
实施例3：复配直投式发酵剂制备
（1）酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂：将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913按照3%的接种量分别接入到PDA液体培养基，30℃静置培养24h；将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731干粉按质量比1:1:1:1混合即为酒精发酵阶段复配直投式发酵剂。
（2）醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂：将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃下180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂。
上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的复配直投式发酵剂，活菌数均为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
实施例4：复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋酿造过程
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度）（结果见表1），有机酸（结果见表2）及挥发性香气成分（结果见表3）。
实施例5：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量1.0%的酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂（酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天。
上述酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂处理方法为：1g直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，30℃活化30min后备用。
实施例6：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1.0%的醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂（莫海威芽孢杆菌CGMCC16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730），进行醋酸发酵10‒12天。
实施例7：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量1.0%的酒精发酵阶段复配直投式发酵剂（酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天；在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量1.0%的醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂（莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730），进行醋酸发酵10‒12天。
采用菌种互作的山西老陈醋复合菌剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、不挥发酸等理化含量以及有机酸和挥发性香气含量，而实施例7显著优于实施例4（对照例）。实施例7得到的新淋醋中总酸含量为6.23g/100mL，不挥发性酸含量达2.68g/100mL，总酯含量为5.88g/100mL，川芎嗪含量为335.65μg/mL，分别比对照组提高了66.22%、182.10%、98.64%、284.17%（表1）；有机酸总含量由29.8663g/L提高为48.6406 g/L，其中乳酸含量为17.2635g/L，乙酸含量为28.9564g/L，比对照组提高了104.23%、49.58（表2）；挥发性香气成分共检测出39种（酯类18种、醇类3种、酸类3种、酮类5种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为5.45g/100mL、醇类总含量为0.86g/100mL、酸类总含量为5.37g/100mL、醛类总含量为20.60g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.44g/100mL）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.42g/100mL）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.29g/100mL）、呈椰子香的癸酸乙酯（0.12g/100mL）、具有柔和甜润玫瑰香的苯乙醇（0.50g/100mL），他们构成了山西老陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香（表3）。
表1：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中理化指标的测定结果
表2：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果
表3：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果
上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的还原糖、总酯、川芎嗪参照GBT 19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

Claims (8)

1.建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：所述菌种互作的陈醋复合菌剂的菌种为：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、蒿草假丝酵母（Candida humilis）、莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）均分离自山西老陈醋发酵过程，所述菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月25日和2018年12月10日，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 16913、CGMCC 16910、CGMCC 15731、CGMCC 15730。
2.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：所述酿酒酵母、蒿草假丝酵母、莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌分离的具体方法为：
（1）菌株的分离鉴定：从山西老陈醋酿造过程中分离出菌株，建立菌种资源库，并对菌进行鉴定，包括霉菌75株、酵母菌75株、芽孢菌411株、乳酸菌51株、醋酸菌66株；细菌16SrDNA V4区DNA片段扩增所用的引物为：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’ 和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’，真菌ITS1区所用的引物为：ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2R：5’-GCTGCGT TCTTCATCGATGC-3’；
优良菌株的筛选：经初筛后，对其中10株霉菌、42株酵母菌、36株芽孢菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌进行高产特性、耐受特性复筛。
3.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：在山西老陈醋优良土著酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731进行菌种互作实验的基础上，将酿酒酵母、蒿草假丝酵母、莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌以1:1:1:1的比例制备成酒精阶段的复配直投式发酵剂；在山西老陈醋优良土著莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730进行菌种互作实验的基础上，将莫海威芽孢杆菌、植物乳杆菌、巴氏醋杆菌以1:1:1的比例制备成醋酸阶段的复配直投式发酵剂。
4.根据权利要求3所述的复配直投式发酵剂，其特征在于：复配直投式发酵剂的具体制备方法为：
（1）酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂：将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913按照3%的接种量分别接入到PDA液体培养基，30℃静置培养24h；将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC16913、莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731干粉按质量比1:1:1:1混合即为酒精发酵阶段复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年；
（2）醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂：将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，莫海威芽孢杆菌在37℃下180r/min培养24h，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃下180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910、植物乳杆菌CGMCC 15731、巴氏醋杆菌CGMCC 15730干粉按质量比1:1:1混合即为醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
5.利用权利要求4所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：具体步骤为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，再加入高粱重量1.0%的酒精发酵阶段复配直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量1.0%的醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋。
6.根据权利要求5所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：得到的新淋醋中总酸含量为6.23g/100mL，不挥发性酸含量达2.68g/100mL，总酯含量为5.88g/100mL，川芎嗪含量为335.65μg/mL，分别比对照组提高了66.22%、182.10%、98.64%、284.17%，并且还丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量。
7.根据权利要求5所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。
8. 根据权利要求4所述的建立在菌种互作基础上的山西老陈醋复合菌剂开发及多阶段强化的方法，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
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