CN109370929A

CN109370929A - 一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用

Info

Publication number: CN109370929A
Application number: CN201811476663.5A
Authority: CN
Inventors: 范光森; 李秀婷; 杨然; 滕超; 刘朋肖; 吴秋华; 富志磊
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: CN109370929B

Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.14827。所述酒品种包括白酒、黄酒、葡萄酒和啤酒。所述应用中，采用有氧液体发酵方式。本发明中的应用，在有氧环境中，优化的发酵条件下，可以生产高达124.7 g/L的乙醇；并能够产生30多种挥发性物质和风味物质，高产醇类和脂类，如β‑苯乙醇、香茅醇，乙酸乙酯、乙酸苯乙酯。最优条件下乙醇产量为124.7 g/L，β‑苯乙醇产量为7.80 g/L，乙酸乙酯产量为0.34 g/L，乙酸苯乙酯产量为0.79 g/L。应用于酒类生产时能改善酒类的口感与口味，具有突出的产香特性，为酒类酿造方式的改变提供物质基础。

Description

一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用

技术领域

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用。

背景技术

白酒是我国国酒，其虽非是人民生活必需品，但却在我国人民日常生活中扮演着重要的角色。乙醇是白酒的主体成分，乙醇体积分数不仅是评价白酒品质的重要质量指标，关系到酒的香气、口味和风格，而且也会影响到白酒的产量。影响到白酒生产过程中乙醇含量的因素有很多，包括原料、酿造工艺、微生物菌群、蒸馏等，在这些众多的因素中，微生物的生命活动无疑是最为关键的因素。酵母素来是酒精饮料中负责生产乙醇的重要菌群，尤其是酿酒酵母，是白酒整个发酵过程中的优势菌株，担负着乙醇发酵的重要作用，对于白酒发酵速率、风味及品质具有重要的贡献。

当前，我国白酒生产仍沿袭传统酿造工艺手段，过程中存在诸多弊端，通过对传统发酵研究的深入和现代化技术的不断发展，势必推动我国白酒酿造的革新，在传承的基础上，逐步走向白酒酿造的现代化式生产，由现今粗放型的酿造向智能化酿造转型。在这一过程中，酿造方式大胆的尝试成为必然，如不锈钢槽车地面恒温发酵系统代替传统地缸发酵，发酵桶、发酵池代替传统发酵设备陶缸或窖池。在这种由地下转为地上的酿造方式转变中，酿造所用微生物特性也必须随之改变。其中较为突出的变化便是酿酒过程中氧气含量的不同，由较为严格的厌氧环境转变为微氧或有氧环境。并且，随着技术的进步以及达到缩短酿造周期的目的，我国白酒酿造定然也会走向液体发酵的方式。无论是现在已有酿造方式的改变还是未来成熟的液体酿造方式，通气式发酵对于工业化生产的安全性及扩大生产的便捷性方面都优于厌氧发酵方式。为适应白酒酿造未来的变革，选育获得在有氧条件下高产乙醇和挥发性物质的酵母，并对其进行功能研究，有目的地将其应用于白酒实际生产中，对改善我国白酒生产工艺，促进中国白酒的发展具有重大的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用，该酿酒酵母能够在有氧条件下高产乙醇和挥发性物质。

本发明的另一目的是提供一种酿酒酵母菌的液体发酵液，原料易得、产乙醇量高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在酿酒中的应用，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.14827。

所述酒品种包括白酒、黄酒、葡萄酒和啤酒。

所述酿酒酵母，最高耐受质量分数为15%的NaCl，最高耐受14%体积分数的乙醇和最高耐受80%质量分数的葡萄糖。

所述应用中，采用有氧液体发酵方式。

优选的，发酵液由以下成分组成：葡萄糖300-400 g/L，酵母浸粉41.6 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁1 g/L，初始pH 5-5.8。发酵条件为：接种量1-10%，装液量1/10-2/5；发酵温度30-36 ℃，搅拌速度90-150 r/min，培养时间32 h。在此培养基中可以高产乙醇。

更优选的，发酵液由以下成分组成：葡萄糖350 g/L，酵母浸粉41.6 g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁1 g/L，初始pH 5.8。发酵条件为：接种量1%，装液量1/5；发酵温度30 ℃，搅拌速度90-120 r/min。

优选的，所述发酵液为高粱浸出液培养基。所述高粱基础培养基为高粱粉水煮滤液经α-淀粉酶和糖化酶降解后的糖液，糖度为10 Brix。具体的，制备方法如下：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90 ℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1 h，冷却，加入糖化酶于60 ℃下糖化2 h。糖化后，离心取上清，采用4层纱布进行过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至10 Brix，分装并灭菌。发酵条件为接种量1%，接种于高粱浸出液培养基中，发酵温度30 ℃，发酵时间32 h，搅拌速度120 r/min。在此培养基中可以高产挥发性物质。

所述应用中，优化条件下，产乙醇量为100 g/L以上；最优条件下乙醇产量为124.7g/L。最优条件下，β-苯乙醇产量为7.80 g/L，乙酸乙酯产量为0.34 g/L，乙酸苯乙酯产量为0.79 g/L。

本发明的有益效果为：

本发明中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在酿酒中的应用，在有氧环境中，优化的液体发酵条件下，可以生产高达124.7 g/L的乙醇；并能够产生30多种挥发性物质和风味物质，高产醇类和脂类，如β-苯乙醇、香茅醇，乙酸乙酯、乙酸苯乙酯，应用于酒类生产时能改善酒类的口感与口味，具有突出的产香特性，为酒类酿造方式的改变提供物质基础。

菌种保藏信息

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14827。

附图说明

图1是酵母YF1914的形态，其中，a为在YPD培养基上菌落形态特征，b为显微镜下细胞形态特征（10×100）；

图2是基于26S rDNA D1/D2序列及Neighbor-Joining法构建的酵母YF1914的系统发育树；

图3是葡萄糖浓度对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图4是氮源种类对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图5是酵母浸粉浓度对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图6是pH对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图7是温度对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图8是接种量对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图9是转速对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响；

图10是装液量对酵母YF1914发酵合成乙醇的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 酿酒酵母的分离纯化与鉴定

1.1 乙醇产生菌株分离与初筛

参照许岱等的方法（一株高产β-苯乙醇酵母菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化[J]. 食品工业科技. 2017(05): 151-158），采用YPD培养基（g/L：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，琼脂粉20，115 ℃灭菌20 min）进行白酒大曲中酵母菌的筛选和分离。通过梯度稀释结合平板涂布方法先后从2017年10月河北一酒厂的大曲中分离出60株菌株，经菌落形态观察，初步确定这些菌株为酵母菌。

将上述酵母菌分别接种于YPD液体培养基（未添加琼脂）中，于30 ℃，转速为120r/min的摇床中活化培养24 h，按1%接种量分别接种到乙醇发酵培养基（g/L：葡萄糖200，酵母浸粉10，蛋白胨20，硫酸铵1，磷酸二氢钾1，硫酸镁1，蒸馏水定容，115 ℃灭菌20 min）中，于30 ℃，转速为90 r/min培养48 h。发酵液于10000 r/min 离心10 min，获得的上清液采用高效液相色谱法检测乙醇含量，试验结果见表1。

表1 不同酵母发酵液中乙醇含量比较结果

有24株酵母能够在轻微摇动条件下，即有氧环境下发酵产乙醇，并且乙醇产量基本都在10.0 g/L以上，其中酵母YF1914和YF1703发酵液中乙醇含量超过50.0 g/L，尤其是YF1914为这些酵母中乙醇产量最高菌株，其乙醇产量达到60.1 g/L，为此将其确定为目标菌株。

1.2 酵母YF1914的鉴定

1.2.1 酵母YF1914形态特征菌株YF1914接种至YPD培养基上，30 ℃下培养2 d后进行观察；挑取YPD平板上单菌落少量菌体，涂布并固定在载玻片上，进行美蓝染色液染色，制作临时装片，置于荧光倒置显微镜载物台上，采用油镜（10×100倍）观察，记录细胞形态特征、出芽情况。菌株YF1914在YPD鉴定平板上的生长特征如图1（a）所示，菌落呈白色，表面光滑，突起，边缘规则，内部湿润易挑起；显微镜下细胞形态特征如图1（b）所示，细胞为卵圆形或纺锤型，一端出芽，无菌丝体，属典型酵母特征。根据菌株的菌落形态和细胞形态初步确定菌株YF1914为酵母菌。

1.2.2 酵母YF1914生理生化菌株生理生化分析参照《酵母菌的特征与鉴定手册》，包括糖发酵、碳源同化、氮源同化、淀粉水解试验、甲基红试验、石蕊牛奶试验，对酵母YF1914生理生化特征见表2。

表2 酵母YF1914生理生化特征

注：“+”阳性；“-”阴性。

结果显示，酵母YF1914能利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖发酵产酸产气，利用蔗糖发酵只产气不产酸，利用纤维二糖发酵只产酸不产气，而不能利用乳糖、可溶性淀粉、木糖和阿拉伯糖产酸或产气。该酵母能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、柠檬酸、乙醇、海藻糖等碳源生长，而不能利用山梨醇、甘露醇、山梨糖、鼠李糖进行生长。氮源同化试验表明，该酵母能利用尿素、硫酸铵、硝酸钾和L-苯丙氨酸作为唯一氮源进行生长，而不能利用亚硝酸钾作为氮源进行生长。除了吲哚试验和尿素试验为阳性反应外，淀粉水解试验、甲基红试验、VP试验、硫化氢试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验和石蕊试验等都为阴性反应。根据《酵母菌的特征与鉴定手册》，该酵母菌与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生理特性相似度最高，初步认为该菌属属于酿酒酵母。

1.2.3 酵母YF1914分子生物学鉴定采用真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取1.2.2初筛获得的高产乙醇酵母基因组DNA，参考许岱等的PCR扩增条件，采用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）扩增26S rDNA D1/D2区序列。将验证后的PCR扩增产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。测序结果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLAST同源性比对，使用MEGA 6.0生物学软件进行多序列比对分析，利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，如图2所示。结果表明，该菌与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的26S rDNA序列同源性最高，相似度达到99%。利用MEGA 6.0软件中的Neighbor-Joining方法对该菌株及与其序列相似度较高的菌株构建系统发育树（图2）。由图2可以看出该酵母与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）KP070744.1的亲缘关系最近。综合以上试验结果，菌株YF1914被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。对此菌株于2017年10月20日进行了保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14827。

1.3 酵母YF1914生物学特性

酵母菌株生物学特性研究包括葡萄糖耐受性（10%-90%，w/v）、NaCl耐受性（0%-30%，w/v）、乙醇耐受性（0%-20%，v/v）、乙酸耐受性（0%-2%，v/v）、生长温度范围（20 ℃-50 ℃）和pH范围（1-12）。结果如表3所示。

表3 酵母YF1914生物学特性

结果显示，酵母YF1914具有一定的耐盐性，随着NaCl质量分数的增加，酵母生长速率受到的抑制程度加强，当NaCl质量分数为15%时，酵母YF1914生长十分缓慢，培养24 h，OD₅₆₀为0.35，当NaCl质量分数为20%时，其生长停滞（表3）。酵母YF1914乙醇耐受性最高为14%，按照酵母乙醇耐受性划分标准，其属于乙醇高耐受性酵母。因此，该菌株在白酒酿造中具有较好的应用潜力。在白酒酿造过程中，温度和pH存在较大的变化范围，如果酵母能够很好的适应宽广的温度和pH范围，那么势必将会在白酒酿造中发挥更大的作用。结果表明，该菌能够适应宽广的温度和pH，其在20-50 ℃和pH 1-10之间都能够生长，最适生长温度为25-35 ℃，最适生长pH为5-6。酵母YF1914能够很好的适应白酒酿造过程中温度和pH的变化，表明该菌株在白酒酿造中具有较好的应用价值。另外该酵母还具有较好的葡萄糖和乙酸耐受能力，分别为质量分数80%和体积分数0.5%。酵母YF1914这些生物学特性为其更好的在白酒酿造中发挥功能打下基础。

实施例2 酿酒酵母发酵产乙醇

酵母菌YF1914接种于YPD液体培养基中（50 mL装于250 mL三角瓶），30 ℃，120 r/min培养24 h，然后接入乙醇发酵培养基中培养。依次考察葡萄糖浓度（100、150、200、250、300、350和400 g/L）、氮源种类（蛋白胨+酵母膏、胰蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、硫酸铵、硫酸二氢铵）、氮源浓度（30、40、50、60、70和80 g/L）、温度（24、26、28、30、32、34和36 ℃）、初始pH（2、3、4、5、6和7）、接种量（0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%和10%，w/v）、转速（0、30、60、90、120、150 r/min）和发酵时间（0、8、16、24、32、40、48和56 h）。酵母生物量采用分光光度计于560 nm处测定吸光值计算，发酵液pH利用pH计测定，发酵液于10000 r/min离心10min，获得的上清液采用高效液相色谱法检测乙醇含量。葡萄糖含量、氮源种类、氮源浓度、温度、初始pH、接种量、转速、发酵时间对酵母菌YF1914发酵产乙醇的影响如图3-10所示。

由图3可以看出，随着葡萄糖初始浓度的增加，乙醇浓度先增加后降低，当葡萄糖初始浓度为350 g/L时，乙醇浓度最大。由图4可以看出，在促进酵母发酵产乙醇方面，有机氮源明显优于无机氮源，并且在相同有效氮浓度下（3.4 g/L），以酵母浸粉为唯一氮源时，乙醇产量最高。由图5可以看出，酵母浸粉浓度对酵母发酵产乙醇具有一定的影响，随着浓度的增加，乙醇产量先增加后降低，之后有轻微的波动。当酵母浸粉浓度为原乙醇发酵培养基有效氮浓度时，即3.4 g/L时（酵母浸粉浓度为41.6 g/L），乙醇产量最高。由图6可以看出，随着初始pH的升高，酵母发酵产乙醇能力不断增加，当初始pH为5-7时，酵母发酵产乙醇最高。由图7可以看出，在30-36^oC之间培养时，酵母YF1914发酵产乙醇较高，这与该酵母具有较宽广的最适温度有关，酵母YF1914这一特点正适应了白酒酿造过程中温度变化范围大的特征。由图8可以看出，接种量对酵母YF1914产乙醇的影响发现，随着接种量的增加，酵母YF1914发酵乙醇浓度不断增加，即使在较高接种量条件下，其发酵产乙醇未受到影响。没有因为接种量高，导致营养物质或氧气不足而乙醇产量低。有利于提高接种量，防止杂菌污染。由图9可以看出，随着转速的提高，酵母YF1914发酵产乙醇浓度不断增加，当转速达到90-150 r/min时，乙醇浓度差异不大，为酵母YF1914产乙醇较优的条件。酵母YF1914这一特点适合在有氧环境下高产乙醇，这为将来白酒酿造方式的变革提供了有利素材。图10表明，装液量在100 mL/250 mL以下时，酵母YF1914发酵产乙醇效果较好，即使装液量低至25 mL/250 mL时，其乙醇产量仍处于较高水平。

实施例3 酿酒酵母发酵产香

酵母菌YF1914在YPD液体培养基（固体YPD培养基中不添加琼脂）中活化，以1%的接种量接种于高粱浸出液培养基（称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90 ℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1 h，冷却，加入糖化酶于60 ℃下糖化2 h。糖化后，离心取上清，采用4层纱布进行过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至10 Brix，分装于三角瓶中，115 ℃灭菌20 min）中，在30 ℃下，120 r/min培养32 h。发酵液于4 ℃，10000 r/min 离心10min，取上清液采用顶空固相微萃取-气质联用法（SPME-GC-MS）检测该酵母所产挥发性香气成分与含量，结果如表4所示。

表4 酵母YF1914发酵产香培养液中挥发性成分检测

由表4可以看出，酵母YF1914能够产生35种风味物质，其中醇类13种，酯类11种，醛类2种，酮类1种，烷烃类3种，烯类1种，酚类2种，呋喃类1种和酸类1种，这对于丰富白酒风味具有重要的意义。酵母YF1914所产异丁醇和异戊醇都是高级醇，在合理的浓度范围内是白酒中醇甜和助香剂的主要物质，也是形成香味物质的前驱物质。2,3-丁二醇是酵母发酵糖类物质产生的，具有增加酒的甜味作用，是当前白酒甜感的重要风味来源。酵母YF1914所产的芳樟醇是一种萜烯类化合物，不仅具有一定的药理作用，而且还赋予白酒浓青带甜的木青香，该风味物质多在玫瑰香型葡萄酒中发现，在白酒中鲜有报道。3-甲硫基丙醇存在于多种酒饮料中，具有洋葱、甜的肉及肉汤的气味，并且被定为芝麻香型白酒的特征风味物质，对白酒品质具有重要的影响。该酵母能够发酵产3-甲硫基丙醇，对提高白酒焙烤香具有重要的作用。(R)-(+)-β-香茅醇和香叶醇是单萜醇类物质，是啤酒酒花香气的重要成分，对啤酒香气质量产生直接影响，在白酒中也较少有报道，而该酵母发酵能够产生这两种风味物质，不仅提高白酒香气，在啤酒酿造中也具有应用潜力。酵母YF1914具有突出的β-苯乙醇生产能力，而β-苯乙醇能够赋予白酒淡雅玫瑰香味。该酵母还能产生具有保健功效的成分反式-橙花叔醇、红没药醇、对羟基苯乙醇、金合欢烯等。具有清新的果香与酒香的乙酸乙酯是清香型、老白干香型和米香型等香型白酒的特征风味物质，而乙酸苯乙酯则具有舒适的花香，2-甲基丁酸-2-苯乙酯具有一定的茶香味这些酯类化合物能够提高白酒的香味。另外，该酵母还能够产生具有油脂香的3-羟基-2-丁酮。由表4可知，该酵母具有突出的产酯增香能力。

Claims

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在酿酒中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.14827。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酒品种包括白酒、黄酒、葡萄酒和啤酒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用有氧液体发酵方式。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵液由以下成分组成：葡萄糖300-400g/L，酵母浸粉41.6 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁1 g/L，初始pH 5-5.8。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵条件为：接种量1-10%，装液量1/10-2/5；发酵温度30-36 ℃，培养时间32 h；搅拌速度90-150 r/min。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液为高粱浸出液培养基。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高粱基础培养基为高粱粉水煮滤液经α-淀粉酶和糖化酶降解后的糖液，糖度为10 Brix。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵条件为接种量1%，发酵温度30 ℃，发酵时间32 h，搅拌速度120 r/min。