CN108603153A - 制备乙醇减少的发酵饮料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备具有降低的乙醇含量的葡萄酒和其它饮料的一般方法，其中所述葡萄酒或饮料可以是甜的、干的或半干的饮料。该方法包括不同发酵阶段，其中使用葡萄酒酵母：异常毕赤酵母和酵母属菌种。本发明教导了一种方法，其中使用酵母组，并且所述组能够通过对芳族化合物和最终产品的少量干预来控制生产感官上可接受的葡萄酒中的关键变量，从而引起乙醇产生的多种产量，从而产生具有与市场上可获得的那些相似特征的葡萄酒，其具有传统葡萄酒的抗氧化特性和品质，并具有较低的酒精含量。

Description

制备乙醇减少的发酵饮料的方法

应用领域

本发明涉及食品技术领域，特别是葡萄酒和发酵饮料工业领域。

特别地，提供了一种制备发酵饮料的方法，其中所述方法包括使用酵母组，以生产乙醇减少的甜、干或半干饮料。在本发明的一种优选实施方式中，提供了生产酒精减少的葡萄酒的一种方法和一种工艺。

背景技术

由于人们选择健康生活的趋势，以及酒精管制法等其他原因，主要是因为目前市场上的葡萄酒的酒精含量很高，接近14°和16°(乙醇v/v)之间，一直引起着消费者的不情愿。智利是全球第八大葡萄酒生产国和第五大葡萄酒出口国，其产品遍布150个国家，瓶装年收入超过14.2亿美元，散装年收入超过3.27亿美元(OIV，2013年)。

近年来，大量私人和政府资源被投入到生产低酒精百分比的葡萄酒上。尽管如此，这些项目绝大多数都是针对在一旦它已被制成和被装瓶的不久前，通过应用一些技术来使葡萄酒脱醇。这些技术虽然有效，但成本高，改变了葡萄酒的感官特性，从而改变了葡萄酒的品质，没有达到消费者的期望，因此相关市场仍面临有限的增长。

另一方面，迄今为止已经描述了许多用于葡萄酒酿造的微生物；每种微生物都有其独特的特性，为葡萄酒提供不同的感官特性，每类或甚至每种酵母都有其独特之处。最常用于酿酒的野生酵母包括微生物：假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属/孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、梅奇酵母科(Metschnikowiaceae)、毕赤酵母属(Pichia)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)。然而，目前在该发酵工艺中使用的大多数培养酵母属于酵母属(Saccharomyces)菌种，特别是属于酿酒酵母(S.cervesiae)。

与酵母属酵母不同，非酵母属酵母向环境中分泌更高浓度的酶(主要是酯酶、糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶)，这些酶逐渐降解粗葡萄汁(must)的某些成分，从而改进了一些技术工艺，诸如葡萄渣的颜色提取、葡萄酒的澄清和葡萄酒的酒体，从而有利于其感官特征，例如其芳香品质。一些非酵母属酵母似乎对酒精饮料的香气和口感有有趣的影响；此外，它们在葡萄酒中产生少量不需要的化合物，诸如乙醛、丙酮、乙酸和乙酸乙酯。

技术现状

世界葡萄酒的消费量在历史上一直都有变化；然而，在消费量不断增加之后，由于为获得不同类型的葡萄酒提供了农业和工业改进的创新，产量已经有可能增加。因此，几十年来有可能维持稳定的市场。具有低含量的酒精的葡萄酒的生产一直是以多样技术发展为标志的主题，从1980年开始，研究生产具有低酒精含量(为1至2％的乙醇)的葡萄酒的不同方法。

迄今为止差别很大的两个技术方面有着明显的标志：发酵后酒精的消除和发酵过程中产生的酒精量的减少。因此，1985年，第一种脱醇方法之一出台，其由在非常低的压力下提高成品葡萄酒的温度构成，以使存在的乙醇蒸发(US19850746075)。另一方面，介绍了一种发明，其通过先前的葡萄糖含量的酶促氧化步骤，将葡萄糖转化成葡萄糖酸，从而减少了粗葡萄汁中可发酵糖的量，并间接产生较少的酒精(US19860826923)。这些处于技术开发早期阶段的方法可以有效降低葡萄酒的酒精含量；然而，它们影响其香气和不同的感官特征，这在确定的葡萄酒中是非常重要的。随后，在智利及其葡萄酒市场巩固的背景下，提交了一项专利申请，该专利申请涉及一种借助先进技术的脱醇方法，该先进技术利用高压来赋予溶液的渗透势，并将溶剂转移到半透膜(RO)分离的另一个空间。然而，由于没有发明人的参与，该申请被宣布为放弃(CL专利申请No.1301-1991)。有证据表明，随后的发明包括目前作为葡萄酒脱醇工艺呈现的反渗透工艺(CN203754697)。

随后，提出了新的方法，在最后阶段进行不完全发酵并添加不同量的粗葡萄汁(本领域技术人员称为粗葡萄汁(must))，从而使存在的糖不被代谢并转化成乙醇分子(US6203826、CN101717707)。这项技术的局限性在于，所得产品由“甜”葡萄酒组成，并且明显缺乏酒精发酵中产生的挥发性化合物和次生代谢产物；因此，这种葡萄酒不具备国际竞争的资格。

在2010年之后的十年中，一些先前开发的工艺被重新启动和改进，从而产生了在2013年提交的发明(CN20131249432)，其中使用了先前讨论过的相同的酶——葡萄糖氧化酶(US19860826923)，但是它通过发酵工艺中的惰性气氛控制和温度通气来改进工艺，从而产生完全发酵的葡萄酒，但是它们具有高含量的葡萄糖酸，这在品尝者的味觉上提供了令人不快的口感。脱醇方法的高效发展，以至于人们可以找到通过串联蒸馏和低压下的适度高温处理实现0％酒精的葡萄酒的发明(CN203653519)；然而，葡萄酒技术上的观点认为，这种发酵必须在其组成中包含最低量的乙醇，以完备各种必需的风味和特征。

另一方面，该行业开始关注酵母菌株，利用这些酵母菌株可以在完全发酵过程中获得较低的乙醇产生产量。这就是发明CN103627646所呈现的一种真菌菌株，与其葡萄酒同行相比如何能够产生更少的乙醇。

附图说明

图1是从亚历山大麝香葡萄(Muscat of Alexandria grape)的粗葡萄汁中获得的发酵动力学的图解说明。(●)，葡萄糖消耗。(■)，反应器内生物质增加。

图2表示在三种不同发酵工艺结束时获得的酒精含量(以乙醇％v/v表示)的比较。阴性对照对应于在持续通气下的亚历山大麝香葡萄大部分。阳性对照对应于为不通气情况下的麝香葡萄。该测试对应于通过本文所述的方法从上述工艺中使用的相同粗葡萄汁开始进行的发酵。

图3显示了使用浓缩粗红葡萄汁发酵的动力学。(■)，还原糖。()，细胞生物质。(□)，整个过程的pH值。(Δ)，发酵液中包含的乙醇浓度。

图4表示在三种不同发酵工艺结束时获得的酒精含量(以乙醇％v/v表示)的比较。阴性对照对应于持续通气情况下的浓缩葡萄大部分。阳性对照对应于为不通气情况下的浓缩粗葡萄汁。该测试对应于通过本文所述的方法从上述工艺中使用的相同粗葡萄汁开始进行的发酵。

发明内容

本发明代表制备具有降低的乙醇含量的葡萄酒和其它饮料的一般方法，其中所述葡萄酒或饮料可以是甜的、干的或半干的饮料。该方法包括不同发酵阶段，其中使用葡萄酒酵母：异常毕赤酵母(Pichia anomala)和酵母属菌种(Saccharomyces sp.)。

本发明教导了一种方法，其中使用酵母组，并且所述组能够通过对芳族化合物和最终产品的少量干预来控制生产感官上可接受的葡萄酒中的关键变量，从而引起乙醇产生的多种产量，从而产生具有与市场上可获得的那些具有相似特征的葡萄酒，其具有传统葡萄酒的抗氧化特性和品质，并具有较低的酒精含量。

具体实施方式

众所周知，根据上述背景，葡萄酒行业目前面临的主要问题之一是消费者偏好的变化，消费者越来越重视低酒精或不含酒精的饮料的摄入。

考虑到健康益处必须与口感的满意度严格相关的重要性，提出了本发明，其考虑了产品销售成功的两个关键因素。这项创新是基于两个不同阶段进行的发酵的实施。第一阶段由一个微氧过程构成，它促进异常毕赤酵母生物质的生长，通过具有最小酒精生产的氧化途径代谢葡萄糖。在发酵的第二阶段，通过除去毕赤酵母(Pichia)发酵菌并接种酵母属菌种(Saccharomyces sp.)来替代酵母菌株，为葡萄酒提供特色余味的微生物。如前所述，非酵母属酵母向环境分泌更高浓度的酶，这改善了发酵饮料的感官特征，因此在本发明的开发过程中，非酵母属菌种被用作负责该方法初级阶段的微生物。因此，本文所建议的方法使用异常毕赤酵母(Pichia anomala)，这是一种具有强烈受氧限制而不是受乙醇生产培养基中存在的葡萄糖浓度影响的行为的微生物，它强烈降低了醇脱氢酶(EC.1.1.1.1)在有氧条件下的表达。

然而，尽管异常毕赤酵母(P.anomala)已经被用于葡萄酒酿造工艺，并取得了良好的效果，但从葡萄酒专家的观点来看，这些大多是缺乏特色葡萄酒余味的红葡萄酒。

由于这是一种适用于所有类型葡萄酒的方法，包括白葡萄酒、玫瑰葡萄酒和红葡萄酒，因此在生产工艺中使用适合这一目标的酵母非常重要。为此，为了实现发酵的最后阶段，一株酵母属菌种已被选为最适合此目的，以便在该方法的最后阶段涉及用酵母属菌种(Saccharomyces sp.)发酵的时候，能够产生强烈花香特征而增加葡萄酒芳香的复杂性的微生物。

优势

与现有工艺不同，本发明提供一种不需要脱醇的发酵饮料，其允许以较低成本获得低酒精的饮料，保持其感官特性，而不降低其品质。

作用机理

本发明包括发酵的不同阶段，以便能够通过控制外部变量来处理所涉及微生物的代谢。

葡萄糖可以通过两种不同的途径在酵母中代谢：氧化途径或发酵途径。本发明的方法的目的是促进氧化呼吸途径，从而促进代谢，这导致生物质的产生、细胞生长的增加，产生最少的乙醇并产生葡萄酒的其它目标化合物。为了进行上述工艺，需要在发酵阶段I中施加氧气；因此，在有氧条件下培养的异常毕赤酵母(Pichia anomala)(其是克拉布特里(Crabtree)阴性酵母)优选通过丙酮酸脱氢酶将葡萄糖代谢成乙酰辅酶A。随后，这种分子进入Krebs循环，完全氧化，随后产生导致其复制的过程所需的能量(Van Dijken等人1993；Gancedo&Serrano 1989)。这是因为在这些条件下，该分子显示丙酮酸脱羧酶(EC.4.1.1.1)的最低转录水平，因此导致从乙醛形成乙醇的代谢途径受到限制(Postma等人，1989)。

影响选择该菌株进行好氧发酵的另一个重要特征是，在这些生长条件下，异常毕赤酵母(P.anomala)产生高产量的生物质，此外，它能够在少量合成乙醇的情况下，产生用于葡萄酒感官特性的其它重要化合物，例如甘油和乙酸酯。

制备乙醇减少的葡萄酒的方法的最后阶段之一在于由酵母属(Saccharomycessp.)酵母进行厌氧发酵。这一阶段在葡萄酒技术上非常重要，因为这种微生物提供高浓度的甘油，而不增加乙酸，并增加某些次级香味的产生，从而改善葡萄酒的酒体和风味。

方法

1.粗葡萄汁的加工

在通过去除茎秆和压碎水果来获得粗葡萄汁之后——如果它对应于生产白葡萄酒、玫瑰葡萄酒或红葡萄酒的葡萄汁，那么它应该在-5℃至4℃之间的温度下储存在容器中，例如金属容器、不锈钢、塑料或木材，直到使用为止。

如果粗葡萄汁不是在无菌条件下，则应进行必要的处理，以便通过化学工艺(诸如添加抗真菌剂和抗细菌剂)或物理工艺(例如微滤、离心或滗析)来降低悬浮液中可能包括的天然酵母的负荷。

2.异常毕赤酵母(Pichia anomala)菌株的活化

如果异常毕赤酵母(Pichia anomala)直接来自适合其生长的培养基，如液体或固体YM培养基(酵母提取物-麦芽提取物培养基)、YPD(酵母提取物蛋白胨右旋糖培养基)或补充甘油1-10％的其它酵母培养基，则必须通过任何滗析方法收集，例如离心、再悬浮和根据需要用无菌蒸馏水洗涤多次。最后一次洗涤获得的团块必须在3mM至7mM的藻酸钠溶液中在20-30℃和pH 4-7的范围内温和润湿。然后其必须静置约10至25分钟，直至其使用。

3.发酵——阶段I

第一阶段由好氧发酵构成。因此，安装了由外部空气供应源和扩散器组成的通气系统。在整个过程中，溶解氧必须保持在0.1-1vvm之间的浓度。为此，随着培养物变得更稠，必须调节进入发酵容器的空气流量。

向粗葡萄汁接种异常毕赤酵母(Pichia anomala)。粗葡萄汁中酵母浓度应大于0.1g/l且小于0.4g/L，优选每升水0.25克干酵母。在粗葡萄汁中轻轻加入所需的体积，通过一些机械方法尝试充分均匀化。整个过程中，发酵应在12℃至19℃的温度范围内进行。应该通过物理方法，诸如折光测定法或通过化学和分光光度法，诸如DNS(3,5-二硝基水杨酸的方法)定期记录粗葡萄汁中糖浓度(推荐在6、16或24小时之间)。当酵母达到25-40g/l之间的残余糖，优选30g/L时，必须停止通气。

4.酵母属(Saccharomyces sp.)菌株的活化

如果酵母属菌种直接来自适合其生长培养基，如液体或固体YM培养基、YPD或用于酵母培养的其它培养基，则它必须通过任何滗析方法收集，诸如离心，再悬浮，并根据需要用无菌无溶质溶液洗涤多次。最后一次洗涤获得的团块必须在无菌、脱矿质和蒸馏的水中，在30℃至40℃的温度范围内温和润湿，然后静置约10至20分钟，直至其使用。

5.发酵——阶段II

粗葡萄汁应放置足够长的时间，以便滗析其中所含的微生物，建议的时间段范围为约18至24小时。替代地，可以根据制造商指示的比例加入加速滗析过程的试剂，诸如皂土。形成的沉淀物应通过抽吸、过滤或任何适当的物理方法除去，以消除存在的微生物(异常毕赤酵母(P.anomala))和源自粗葡萄汁的残留物。如果所述过程不够，则应进行微滤。一完成，就停止通气，并向其接种酵母属菌种(Saccharomyces sp.)。粗葡萄汁中酵母浓度应大于0.2g/l且小于0.7g/L，优选每升水0.25克干酵母。在粗葡萄汁中轻轻加入所需的体积，通过一些机械方法尝试充分均匀化。

6.酒渣分离(devatting)和压榨

就葡萄酒而言，在葡萄渣存在下(主要是各种玫瑰葡萄酒和红葡萄酒)进行发酵需要酒渣分离阶段，其中通过处理或机械操作(建议使用压榨机来减少外源微生物的存在)将葡萄渣从有用的发酵液的沉积物中移除。

7.滗析

葡萄酒应进行微滤，以移除发酵液中的所有微生物。在执行者必须根据其条件和产品的体积选择最合适过滤器的情况下，建议使用膜过滤器。使用实施例

实施例1

通过从亚历山大麝香葡萄去除茎秆和随后的葡萄破碎而加工出的粗葡萄汁被存放在由不锈钢制成的发酵容器中，该容器预先通过湿热灭菌。

根据要获得的酵母浓度，在接种异常毕赤酵母(Pichia anomala)数小时前，有必要在液体培养基YM(3g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、大豆、5g/L大豆蛋白胨、10g/L葡萄糖)中开始其培养，以生产生物质。就在使用之前，必须以5000RPM离心收集培养物，重新悬浮在无菌蒸馏水中，并洗涤三次。随后其用4.5mM的藻酸溶液轻轻润湿，因为它是液体培养物，不需要适当的活化，而是需要在藻酸盐存在下孵育。其在28℃下静置20分钟。

发酵的第一阶段由培养基的通气构成，其在整个过程中增加以保持恒定的溶解氧浓度为10mg/L。在发酵开始时和72小时后，必须每10小时控制一次过程，以便量化消耗的糖和产生的生物质的浓度(图1)。当酵母达到45g/l残余糖时，停止通气。

一旦糖达到峰值，停止通气，发酵液滗析20小时。与此同时，像异常毕赤酵母(P.anomala)一样，活化酵母属(Saccharomyces sp.)菌株，但是在38℃的温度下。一旦经过上述规定的时间，就必须通过打开发酵容器的底阀来移除发酵容器底部的泥状底部物。对其接种酵母，该工艺在厌氧环境下再用50小时完成。

由于发酵是在没有葡萄渣存在的情况下进行的，因此酒渣分离由在12分钟内以5000RPM离心构成，然后使用0.22μm过滤器对其进行微滤。

发酵结束时产生的乙醇浓度比阳性对照低得多，达到53％的降低(图2)。

实施例2

发酵是从红葡萄浓缩粗葡萄汁进行的。异常毕赤酵母(Pichia anomala)在YM-甘油培养基(3g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、5g/L大豆蛋白胨、10g/L葡萄糖、5％甘油)中生长96小时，以产生生物质。就在使用之前，必须以5000RPM离心收集培养物，重新悬浮在无菌蒸馏水中，并洗涤三次。随后，用4.5mM藻酸溶液轻轻润湿。其在28℃下静置20分钟。

发酵的第一阶段由培养基的通气构成，其在整个过程中增加以保持恒定的溶解氧浓度为10mg/L。在发酵开始时和72小时后，必须每10小时控制一次过程，以便量化消耗的糖和产生的生物质的浓度(图3)。当酵母达到32g/l残余糖时，停止通气。

一旦糖达到峰值，停止通气，发酵液滗析20小时。与此同时，同异常毕赤酵母(P.anomala)一样，活化酵母属(Saccharomyces sp.)菌株，但是在38℃的温度，补充1％的甘油。一旦经过上述规定的时间，就必须通过打开发酵容器的底阀来移除发酵容器底部的泥状底部物。对其接种酵母，该工艺在厌氧环境下再用50小时完成。

酒渣分离由在12分钟内以5000RPM离心构成，然后使用0.22μm过滤器对其进行微滤。

如在实施例1，发酵结束时产生的乙醇浓度比阳性对照低得多，其在此情况下达到40％的降低(图4)。

Claims (20)

1.一种制备酒精减少的酒精饮料的方法，其特征在于：

a)向粗葡萄汁中接种非酵母属酵母；

b)进行生物质生长的第一氧化阶段；

c)移除阶段(b)的所述酵母菌株，以及

d)通过接种酵母属酵母进行第二发酵阶段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，非酵母属酵母接种物浓度的范围从0.1g/L至0.4g/L。3。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种物必须预先用藻酸溶液活化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(b)中描述的所述阶段对应于微氧化的培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在(b)中描述的所述微氧化中，溶解氧在整个工艺中保持在约0.1至1vvm的浓度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(b)中描述的所述阶段使用酵母菌株，其中，糖分解代谢引起减少的酒精产生。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在(b)中描述的所述阶段对应于异常毕赤酵母菌株的发酵。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(b)中描述的所述阶段在从12℃至19℃的温度下进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段(c)中所述酵母的所述移除通过滗析进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(d)中描述的所述阶段中，酵母属酵母接种物浓度的范围从0.1g/L至0.4g/L。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在(d)中描述的所述阶段对应于厌氧培养。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养必须保持在低于4mg/L的溶解氧下。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在(d)中描述的所述阶段对应于酵母属菌株的发酵。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，(d)中描述的所述阶段在从10℃至17℃的温度下进行。

15.根据权利要求1至14所述的方法，其特征在于，任选地，如果所述粗葡萄汁包含葡萄渣，进行酒渣分离和压榨阶段以移除葡萄皮。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述酒渣分离和压榨阶段由压榨机通过机械作用进行。

17.根据权利要求1至16所述的方法，其特征在于，对得到的产品进行微滤以移除包含在所述发酵液中的所有微生物。

18.一种制备酒精减少的酒精饮料的方法，其特征在于，所述方法使用酵母组在两个不同阶段进行：在第一氧化阶段中，使用非酵母属酵母，而在随后的第二发酵状态使用酵母属酵母。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，使用酵母组，所述酵母组能够引起乙醇产生的不同产量并且提供独特的感官特征。

20.一种制备乙醇减少的葡萄酒的方法，其特征在于，所述方法包括以下阶段：

a)向所述粗葡萄汁中接种非酵母属酵母；

b)进行生物质生长的第一氧化阶段；

c)移除步骤(b)的所述酵母菌株，以及

d)通过接种酵母属酵母进行第二发酵阶段。