CN109266562B - 一株高产乙酸乙酯异常威克汉姆酵母及其培养方法与应用 - Google Patents

一株高产乙酸乙酯异常威克汉姆酵母及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高产乙酸乙酯的酵母菌株及其培养方法与应用，名为YF1503菌株，已于2017年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.14169；该菌株的26S rDNA D1/D2序列与异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2序列相似性较高，属于Wickerhamomyces anomalus；本发明的异常威克汉姆酵母YF1503具有较好的乙醇耐受性、乙酸乙酯耐受性和高产乙酸乙酯的特点，经检测，该菌株乙酸乙酯产量可达17.31 g/L，同时在高粱糖化液中具有很好的提酯增香效果。本发明的菌株可应用于对乙酸乙酯有需求的白酒、黄酒、酱油等酿造工业中。

Description

一株高产乙酸乙酯异常威克汉姆酵母及其培养方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及一株新分离高产乙酸乙酯的酵母菌株及其培养方法与应用。
背景技术
乙酸乙酯是白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中重要的风味物质，对于这些产品的品质具有重要的决定作用。乙酸乙酯是一种具有苹果香、菠萝香等水果香味的液体，它能赋予白酒、黄酒和酱油等产品清香浓郁的特色。乙酸乙酯是我国白酒中含量较多的香味物质之一，尤其是对清香型、凤香型和米香型等白酒的风格及成型具有重要作用；在清爽型黄酒中具有重要的风味贡献作用；乙酸乙酯也是酱油中的重要香气成分，对酱油的香气有举足轻重的影响。在这些传统发酵食品中，乙酸乙酯主要来源于微生物发酵产生，少量源于发酵过程中物质的化学反应和原料代入。随着人们对食品色、香、味和安全的重视，更多的倾向于天然酿造具有的自然特性，结合传统发酵食品中乙酸乙酯主要来源途径，可见，高产乙酸乙酯微生物的应用是提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品酿造过程中乙酸乙酯含量的关键解决途径，这对于白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品的品质具有重要影响。
在白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品酿造过程中，酵母是一种重要的菌株，同时也是重要的产乙酸乙酯微生物，尤其是产酯酵母，是传统发酵食品中酯类物质主要产生菌株。从白酒、黄酒和酱油等酿造体系中获得能高产乙酸乙酯的功能微生物，并将其强化应用到这些酿造食品发酵体系中，对于提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造中乙酸乙酯含量，提升其品质具有重要意义。
已有报道中，汉逊酵母（Hansenula）、球拟酵母（Torulopsis）与假丝酵母（Candida）等多用于白酒和黄酒生产中；蒙奇球拟酵母（Torulopsis mogii）、易变球拟酵母（Torulopsis utilis）和埃契氏球拟酵母（Torulopsis etchell-sii）等耐盐产酯酵母多用于生产酱油。在这些产酯酵母中大多属于异型汉逊酵母（Hansenula anaomala），具有较强的氧化特性和产酯能力。虽然，已有多种产酯酵母菌种应用于白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品生产中，但总体上还存在产酯水平低，耐受性差等问题，较难进一步提升这些传统酿造食品的质量。为此，一些厂家采用添加人工合成的乙酸乙酯的方法来提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中乙酸乙酯含量，以谋取更大的利润。随着国家对食品安全的高度重视和管控的严格性以及产品分级的评价体系的建立，不允许往白酒等发酵食品中添加化学合成的香精香料或以次充好。因此，只有选育适应性好、高耐受性、高产乙酸乙酯酵母是解决这一问题的关键。
发明内容
针对当前白酒酿造中重要风味物质乙酸乙酯含量低而导致的优质酒率低、产品品质不稳定的困境，本发明目的在于提供一种从白酒酒曲中新分离的高产乙酸乙酯的菌株，命名为YF1503，并提供YF1503产乙酸乙酯的培养基及培养方法与应用，为解决白酒酿造中存在的问题提供可选方案。
本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从老白干酒曲中筛选获得，为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），该菌株已于2017年5月16日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14169。
上述所述菌株YF1503菌落特征和生化特性如下：该菌株在WL培养基上菌落扁平，边缘呈白色、中间呈灰绿色，表面粗糙，中央微突起；显微结构为卵圆形，一端出芽，无菌丝体；发酵产香香味浓，能耐受0-12%（v/v）的乙醇，对乙酸乙酯的耐受性为0-22 g/L，最适生长pH为6，最适生长温度为28 oC。所述的异常威克汉姆酵母YF1503主要用于微生物发酵制备乙酸乙酯，产量可达到17.31 g/L。所述的异常威克汉姆YF1503在高粱糖化液培养基中能够产生除乙酸乙酯外，还能产生具有玫瑰香的苯乙醇和草药香和丁香的4-乙烯基愈疮木酚等29种挥发性风味物质。所述的异常威克汉姆YF1503可以作为提高白酒等发酵食品中乙酸乙酯含量的功能微生物菌株应用到生产中。
上述异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株的26S rDNAD1/D2序列与多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2序列有99%的相似性。
上述异常威克汉姆酵母菌株YF1503在制备乙酸乙酯中的应用。
上述应用，步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母菌株YF1503接入液体种子活化培养基中，在20-35 oC、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将步骤（1）获得的种子活化液以2-6%（v/v）的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35 oC、静置或160-240 r/min条件下培养48-96 h，即得。
根据本发明，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
根据本发明，所述步骤（2）中高粱糖化液培养基组分如下：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，1000 r/min离心7 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 oB，分装于三角瓶中，灭菌。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中高粱糖化液培养基优化组分如下：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，10000 r/min离心7 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 oB，pH为6，分装于三角瓶中，灭菌。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中高粱糖化液培养基中乙醇和乙酸添加量分别为6%（v/v）和0.01%（v/v），培养温度为20 oC，以210 r/min培养96 h。
上述异常威克汉姆酵母菌株YF1503在提酯增香中的应用。
上述应用，步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母菌株YF1503接入液体种子活化培养基中，在20-35 oC、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将步骤（1）获得的种子活化液以1-6%（v/v）的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35 oC、静置条件下培养48-96 h，即得。
根据本发明，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
根据优选的，所述步骤（2）中种子液接种量为1%，培养温度为30 oC，静置培养96h。
本发明的有益效果：
（1）本发明筛选出的菌株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503来源于白酒酿造环境中，具有乙酸乙酯产量高的特点，经检测，该菌株乙酸乙酯产量可达到17.31 g/L；
（2）本发明筛选出的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503具有提酯增香的特性，经检测，该菌株在高粱糖化液培养基中除了高产乙酸乙酯外，还产玫瑰香苯乙醇、草药香和丁香的4-乙烯基愈疮木酚等29种挥发性风味物质；
（3）本发明通过对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌乙酸乙酯的产量。
（4）本发明筛选出的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株乙酸乙酯和乙醇耐受性高，有利于该菌株生产乙酸乙酯及其在白酒酿造中的应用。
附图说明
图1是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株在WL培养基上的菌落形态照片；
图2是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株的细胞形态照片（放大1000倍）；
图3是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株系统进化发育树；
图4是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株乙酸乙酯耐受性测定结果；
图5是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株最适pH测定结果；
图6是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503菌株最适温度测定结果；
图7是乙酸乙酯标准品高效液相色谱图；
图8是乙酸乙酯标准品制作的标准曲线；
图9是发酵液中乙酸乙酯的高效液相色谱图；
图10是pH对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图11是乙酸添加量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图12是糖度对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图13是乙醇添加量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图14是温度对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图15是接种量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图16是摇床转速对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响；
图17是发酵时间对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503合成乙酸乙酯的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例所用培养基如下：
YPD培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水定容。
WL培养基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸镁0.125 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，pH值为6.5，蒸馏水定容。
实施例中所述异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503，2017年5月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14169。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例中所述乙酸乙酯标准品购自美国Sigma公司。
实施例1 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503的分离
将老白干大曲粉碎并混合均匀后，称取1 g，加入9 mL无菌水，充分振荡后浸泡15min，制成悬液。在无菌操作条件下，取0.1 mL悬液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4、10-5、10-6。取各梯度悬液0.1 mL于YPD平板上，每个稀释梯度做三个平行，由低浓度至高浓度依次涂布。将培养基平板置于30 oC的恒温培养箱中培养2 d，观察菌落生长情况。挑起平板上为球形、表面突起、乳白色、不透明的单菌落，多次划线接种于YPD平板上，直至在显微镜下观察菌体形态一致。将单菌落接种于50 mL高粱糖化液培养基中，30 oC、180 r/min条件下振荡培养48 h。高粱糖化液培养基配方为：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，10000 r/min离心7 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 oB，分装于三角瓶中，灭菌备用。使用前添加乙醇和乙酸，添加量分别为4%和0.04%（v/v）。筛选能够将乙醇和乙酸转化生成乙酸乙酯的菌株，并测定乙酸乙酯含量，最终获得一株转化能力较好、能积累较高浓度乙酸乙酯的菌株，即异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503。
实施例2 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503的保存
上述所获得的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503通过以下方法进行保存：
（1）斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72 h后，在4oC冰箱中保存。
（2）甘油管保存：取5 mL 20%甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20%甘油混合，将混合液分装于1.5 mL无菌PE管中，于-80 oC下保存。
实施例3 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503的鉴定
上述所涉及的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503的鉴定包括以下步骤：
步骤1：形态学特征
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：
WL培养基菌落形态和细胞观察：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于WL培养基上，于72 h后观察其形态特征（图1），由图可以看出，菌落扁平，边缘呈白色、中间呈灰绿色，表面粗糙；将其在光学显微镜下放大1000倍后观察，结果如图2，菌体呈现椭圆形，芽殖。
步骤2：生理生化鉴定
生理生化鉴定采用Biology96孔板方法，具体步骤如下：将实施例1中所获得的菌株划线于YPD平板上，于28 oC下培养24-36 h，用无菌水冲洗平板菌落，制备菌悬液，并调节浊度管中的菌悬液浊度，直至浊度仪显示45%+2。将菌悬液加入96孔板中（鉴定酵母专用YT板，碳源种类如表1），并于28 oC条件下培养数天。利用Microstation软件每隔24 h读取鉴定板的数据，直至SIM值大于0.5，为最终结果。
表1 菌株YF1503 Biolog碳源利用结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：“+”代表可以利用；“-”代表无法利用；“b”代表临界值
通过Microstation软件读取鉴定板的数据，实施例1中所纯化的菌株可利用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖、木糖、棉子糖、龙胆二糖和松二糖等62种碳源。
步骤3：分子生物学鉴定
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：
（1）菌体培养
上述涉及酵母是按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在YPD固体培养基中进行活化，在30 oC条件下培养48 h后接种于YPD液体培养基中，置于28 oC、160 r/min摇床中，培养48 h。
（2）PCR扩增
上述涉及的酵母菌株基因组DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒方法。
本发明为鉴定所用的扩增引物为酵母26S rDNA基因D1/D2区序列扩增引物，由以 下引物组成：
Figure 655767DEST_PATH_IMAGE002
正向引物，NL1：5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
反向引物，NL4：5´- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´。
上述所涉及酵母菌株鉴定的PCR条件包括以下：
Figure 988659DEST_PATH_IMAGE002
PCR反应体系：LA PCR Buffer 2.5 μL、正反引物各1 μL、dNTP 2 μL、LAtaq酶 0.2 μL、DNA 2 μL、ddH2O补至25 μL；
Figure 458824DEST_PATH_IMAGE003
PCR 扩增程序：94 oC预变性5 min，94 oC变性30 s，58 oC退火30 s，72 oC延伸1 min，共30次循 环，最后72 oC延伸10 min；
Figure 546865DEST_PATH_IMAGE004
PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。
（3）序列测定及系统发育树的构建
将（2）中的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株PCR扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），与其它多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2区序列有99%的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示，将该菌鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。
该菌株已于2017年5月16日送至中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14169。
实施例4 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503的生长特性
本发明所涉及异常威克汉姆酵母YF1503生长特性，其特征在于，步骤如下：
步骤1：乙醇耐受性
本发明所涉及的酵母菌株乙醇耐受性，其特征在于，将灭菌后的YPD琼脂培养基降温至40 oC左右，按8%、10%、12%、14%、16%、18%和20% (v/v)的浓度加入乙醇，接种已活化的待测菌株于上述固体培养基中，在30 oC下培养3 d后观察其生长状况，表征其酒精耐受性，结果如表2所示，由表可见该酵母能在12%的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株。
表2 异常威克汉姆酵母YF1503菌株乙醇耐受性结果
浓度 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20%
Y1511 + + + - - - -
步骤2：乙酸乙酯耐受性
本发明所涉及的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503乙酸乙酯耐受性，其特征在于，将活化后的菌株YF1503接种于乙酸乙酯浓度为0-30 g/L的YPD液体培养基中，于30 oC的条件下培养3 d，在560 nm下检测OD值，其结果如图4，可见该菌株具有较高的乙酸乙酯耐受性，在液体培养基上的乙酸乙酯耐受浓度为22 g/L。
步骤3：最适生长pH
本发明所涉及的酵母菌株生长pH，其特征在于，以YPD培养基为基础，配制pH为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5和7的液体培养基，接种已活化的待测菌株，于30 oC条件下静置培养3 d，测定OD560，结果如图5所示，由图可以看出本发明所涉及菌株最适生长pH为6。
步骤4：最适生长温度
本发明所涉及的酵母菌株生长温度，其特征在于，将已活化的待测菌株接种于YPD培养基中，分别置于20-36 oC条件下静置培养3 d，测定OD560，结果如图6所示，由图可以看出，本发明所涉及菌株的最适生长温度为28 oC。
实施例5 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503制备乙酸乙酯
本发明所涉及异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503制备乙酸乙酯步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母YF1503接入液体种子培养基中，在30 oC、180 r/min条件下，活化16 h，获得种子活化液；
（2）将（1）获得的种子活化液以2-10%（v/v）的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35 oC、静置或160-240 r/min条件下培养48-96 h，即得。
所述步骤（1）中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
所述步骤（2）中的高粱糖化液培养基组成为：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，10000 r/min离心7 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 oB，pH为6，分装于三角瓶中，灭菌。使用前添加乙醇和乙酸，添加量分别为4%和0.04%（v/v）。
产物和产物浓度的确定
采用高效液相色谱法确定和测定乙酸乙酯浓度，高效液相色谱（Agilent 1260infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：KH2PO4=1：1（v/v），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 oC，进样量10μL。
（1）乙酸乙酯标准曲线的绘制
准确称取0.8472 g乙酸乙酯，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，即得84.72mg/mL的标准贮备液。分别移取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL和600 μL的标准贮备液，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后得0.8472-5.0832mg/mL 6个浓度水平的乙酸乙酯标准溶液。
将上述不同浓度梯度的乙酸乙酯标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。乙酸乙酯标准品高效液相色谱图如图7，乙酸乙酯标准品出峰时间在4.9-5.0 min之间，每一浓度重复测定3次，求均值，绘制乙酸乙酯标准曲线，如图8所示，根据该曲线获得的方程式为y=360.06x+13.425（R2=0.9997）。
（2）样品的制备
取8 mL发酵液于10 mL离心管中，经8000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，用60%的乙醇稀释到适当浓度，经0.22 μm有机系滤膜过滤得到样品。
高效液相色谱（Agilent 1260 infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAXEclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：KH2PO4=1：1（v/v），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 oC，进样量10 μL，外标法测定乙酸乙酯。
样品的高效液相色谱图如图9所示，由图可看出乙酸乙酯出峰时间在4.9-5.0 min之间，与标准品出峰时间一致，样品中含有乙酸乙酯。
高效液相色谱测定样品的峰面积带入标准曲线方程y=360.06x+13.425（R2=0.9997）中，峰面积为y值，求出乙酸乙酯浓度x。
实施例6：发酵培养基初始pH优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例5的基础上将高粱糖化液培养基初始分别调为2、3、4、5、6和自然pH，并将活化种子液以2%的接种量接种于上述培养基中，于30 oC，180 r/min条件下培养3 d。用高效液相色谱法检测乙酸乙酯，通过图10可以看出，选择高粱糖化液培养基初始pH 6.0为优选条件，乙酸乙酯产量为6.38 g/L。
实施例7：乙酸添加量的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例6的基础上按照0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.1%（v/v）的量分别在高粱培养基中加入乙酸，并将活化种子液以2%的接种量接种于上述培养基中，于30 oC，180 r/min条件下培养3 d。用高效液相色谱法检测乙酸乙酯，通过图11可以看出，在0.01%以下的乙酸添加量时，酵母能正常生长且乙酸乙酯产量较高。根据结果，选择0.01%的乙酸加入量作为最优添加量，乙酸乙酯产量为8.44 g/L。
实施例8：糖度的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例7基础上，高粱糖化液培养基中糖度分别调整为6、8、10、12和14 oB的比例添加。以2%的接种量，在30 oC、180 r/min的条件下培养72 h。通过图12可以看出，高粱糖化液培养基糖度为8 oB作为异常维克汉姆酵母产乙酸乙酯最优糖度。
实施例9：乙醇添加量的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例8基础上，高粱糖化液培养基中乙醇添加量按照0%、2%、4%、6%、8%和10%（v/v）的比例添加。以2%的接种量，在30oC、180 r/min的条件下培养72 h。通过图13可以看出，当乙醇添加量达到6%时，酵母YF1503产乙酸乙酯含量最高，达到9.90 g/L。乙醇含量的过高或过低均会影响乙酸乙酯的产量，原因可能在于乙醇含量低时，不能更好的为酵母提供乙酸乙酯的前体；而乙醇含量过高则会对酵母细胞起到一定毒害作用，影响酵母的正常生长，故选择乙醇6%的添加量为宜。
实施例10：温度的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例9基础上，选择温度分别为18、20、22、25、28和30 oC，以2%的接种量培养3 d。结果如图14，温度为20 oC时，发酵液中乙酸乙酯含量为12.95 g/L。因此，YF1503合成乙酸乙酯的最适温度为20 oC。
实施例11：接种量的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例10基础上，采用2%、4%、6%、8%和10%的接种量培养3 d。结果如图15，接种量为2%或4%时为异常威克汉姆酵母产乙酸乙酯优选接种量，发酵液中乙酸乙酯含量为12.97 g/L。因此，YF1503合成乙酸乙酯的最适温度为20 oC。
实施例12：转速的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例11基础上，在静置和不同转速（120、150、180、210和240 r/min）条件下培养，以4%的接种量，在20 oC条件下培养3 d。由图16可以看出，菌株YF1503在210 r/min条件下合成的乙酸乙酯含量为16.01 g/L。故选择210 r/min为最优转速。
实施例13：时间的优选
采用实施例5的方法培养酵母YF1503，不同之处在于，在实施例12基础上，以4%的接种量，在20 oC条件下培养，从发酵12 h起，每隔12 h取样进行乙酸乙酯的含量测定，由图17可以看出，酵母YF1503当培养时间为96 h时，发酵液中乙酸乙酯含量最高为17.31 g/L，之后，乙酸乙酯含量随时间的增加而减少。因此，酵母YF1503最优培养时间为96 h。
实施例14 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503提酯增香应用
本发明所涉及异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YF1503提酯增香步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母YF1503接入液体种子培养基中，在20-35oC、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将（1）获得的种子活化液以1-6%（v/v）的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35 oC、静置条件下培养48-96 h，即得。
所述步骤（1）中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
所述步骤（2）中的高粱糖化液培养基组成为：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，10000 r/min离心7 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 oB，pH为6，分装于三角瓶中，灭菌。
所述步骤（2）中优选条件为：接种量为1%，30 oC静置培养3天。
产物和产物浓度的确定
采用顶空固相微萃取-气质联用法（SPME-GC-MS）检测该酵母所产挥发性香气成分。取步骤（2）中发酵液5 mL于小瓶中，添加氯化钠3 g，2-辛醇1 μL（0.67 g/L），60 oC平衡30 min，吸附30 min，250 oC解析3 min。测定具体参数如下：萃取头为50/30 µm DVB/CAR/PDMS；GC-MS为Thermo Trace1300气相色谱，ISQLT质谱；色谱柱TG-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 µm；不分流进样；进样口温度250 oC；传输线温度280 oC，离子源（EI）温度250 oC；载气（高纯氦）流速1 mL/min；全扫描35-400；炉箱升温程序如表3，风味物质确定采用NIST11.LIB数据库检索确定，定量分析采用与内标化合物2-辛醇峰面积比较计算。
表3 升温程序
升温速率 <sup>o</sup>C /min 温度 <sup>o</sup>C 保持时间 min
40 3
2 100 5
2 150 2
10 280 5
在上述所述培养条件和产物分析方法下，所述异常维克汉姆酵母YF1503除了高产乙酸乙酯外，还产醛类、酯类、醛酮类、酸类、苯环类和烷烃类等化合物29种，其中具有玫瑰花香的苯乙醇、草药香和丁香的4-乙烯基愈疮木酚（表4）。
表4 异常维克汉姆酵母YF1503产香挥发性风味物质
Figure DEST_PATH_IMAGE005

Claims (21)

1.一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株YF1503，该菌株已于2017年5月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.14169。
2.如权利要求1所述的异常威克汉姆酵母菌株YF1503，其特征在于：该菌株形状为椭圆形，芽殖，菌落颜色为乳白色，能够利用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖、木糖、棉子糖、龙胆二糖和松二糖作为碳源，在12％的乙醇浓度和22g/L的乙酸乙酯浓度下能够生长，最适生长pH和温度分别为6和28℃；所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503的26SrDNA D1/D2序列与多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2序列有99％的相似性。
3.如权利要求1或2所述的异常威克汉姆酵母菌株YF1503在制备乙酸乙酯中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503在发酵食品酿造过程中制备乙酸乙酯。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发酵食品选自白酒、黄酒和酱油。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503从高粱产生乙酸乙酯。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母菌株YF1503接入液体种子活化培养基中，在20-35℃、160-180r/min条件下，活化14-18h，获得种子活化液；
(2)将步骤(1)获得的种子活化液以2-6％(v/v)的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35℃、静置或160-240r/min条件下培养48-96h，即得。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，pH自然，蒸馏水定容。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中高粱糖化液培养基配方如下：称取250g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90℃液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h；糖化后，10000r/min离心7min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8°B，分装于三角瓶中，灭菌备用。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中高粱糖化液培养基中添加乙醇和乙酸分别为6％和0.01％，培养温度为20℃，以210r/min培养96h，能够得到成熟的乙酸乙酯转化液。
11.如权利要求1或2所述的异常威克汉姆酵母菌株YF1503在提酯增香中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503在发酵食品酿造过程中提酯增香。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于：所述发酵食品选自白酒、黄酒和酱油。
14.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503从高粱中提酯增香。
15.如权利要求11所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母菌株YF1503接入液体种子活化培养基中，在20-35℃、160-180r/min条件下，活化14-18h，获得种子活化液；
(2)将步骤(1)获得的种子活化液以1-6％(v/v)的接种量接种于高粱糖化液培养基，在20-35℃、静置条件下培养48-96h，即得。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，pH自然，蒸馏水定容；活化条件为：30℃、180r/min条件下，活化16h，获得种子活化液。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中培养条件为：种子液接种量为1％，30℃、静置培养96h。
18.如权利要求11-17中任一项所述的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌株YF1503能够产生除水果香的乙酸乙酯外，还能产生挥发性风味物质玫瑰香的苯乙醇、草药香和丁香的4-乙烯基愈疮木酚。
19.发酵食品，其使用如权利要求1或2所述的异常威克汉姆酵母菌株YF1503发酵制得。
20.如权利要求19所述的发酵食品，其选自白酒、黄酒和酱油。
21.如权利要求19或20所述的发酵食品，其从高粱发酵制得。
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