CN113913311B - 西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株及其应用，该菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA‑MBY‑JT229的保藏编号为CGMCC No.2.6477，分离自西藏地区姜果实内部，利用葡萄糖和木糖生产γ‑氨基丁酸(γ‑aminobutyric acid,GABA)，在高温、添加适当浓度乙醇或乙酸下，该菌株分泌更多GABA到发酵培养基。经过显色法观察和超高效液相色谱‑四极杆质谱仪测定，精确度可靠可信，从而揭示该菌株生产GABA的能力，该菌株细胞内也检测到大量GABA的积累，表明该菌株是有潜力的GABA生产菌株，在食品和工业领域中具有较好的应用潜力和价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物资源与应用技术领域，具体涉及一株西藏姜果实来源的产GABA的威克汉姆酵母菌株(Wickerhamomyces rabaulensis)及其应用。
背景技术
GABA是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于植物、动物以及微生物体内。GABA在人体内是一种抑制性神经递质，主要是调节突触传递，放松神经从而起到助眠以及抗抑郁的作用，另外还具有抗高血压、抗糖尿病以及抗癌的作用(Ngo等，Molecules,2019,24:2678)，因此GABA被添加到很多助眠药物以及保健品中。GABA也可作为护肤品的主要成分作用于皮肤细胞，具有平复皱纹的作用(Han等，Mycobiology,2017,45:199- 203)。目前GABA的产生途径主要有微生物合成、植物提取以及化学合成等。化学合成和植物提取存在环境污染和产量低等局限性，因此微生物发酵法合成GABA引起了研究者的关注。
目前生产GABA的微生物包括乳酸菌和酵母菌等，其中酵母菌具有抗逆性强，没有噬菌体污染的风险，工业放大培养容易，可同时合成维生素和多糖等多种活性物质、生物安全性好等优点，因此利用酵母菌生产GABA受到研究者的关注。很多野生酵母和工业酵母细胞在适应生态环境进化和应用于工业生产中面对很多胁迫压力，细胞会对此做出应激反应，积累胁迫保护性物质以保护细胞不受伤害，而GABA为一种胁迫保护性物质，有报道在乙酸(Wang等，Omics,2013,17:150-159)、高渗透压(Ji等，J Gen Appl Microbiol,2017,64:84-89)和氧化胁迫(Coleman等，J Biol Chem,2001,276:244-250)等条件下假丝酵母和酿酒酵母胞内的GABA含量提高，但是乙醇对酵母菌生产GABA的影响目前还没有报道，而且对其他酵母是否也有类似的现象也不清楚。
威克汉姆酵母Wickerhamomyces rabaulensis原来命名为Pichia rabaulensis，模式种分离于蜗牛的分泌物(Wu ZW等，J Gen Appl Microbiol,2005,51:319-322)，目前对其生物技术应用研究非常有限，只有一篇研究报道，从腐木和蛀木昆虫中分离出一株Wickerhamomyces rabaulensis酵母，该酵母在甘蔗渣半纤维素水解物中可利用木糖生产乙醇(Cadete等，J Appl Microbiol,2017,123:1203-1213)，但是，目前国内外还没有将Wickerhamomyces rabaulensis酵母作为微生物细胞工厂生产GABA以及其他活性化合物的研究报道。
木糖是自然界中除了葡萄糖之外储量最丰富的单糖，例如木质纤维素类生物质水解可以产生很多木糖，可利用木糖的微生物就可以木质纤维素水解液为底物进行发酵，从而进行工业生产以节约成本，但因此能够天然利用木糖的酵母进行活性物质的生产，更加有利于充分利用木质纤维素资源进行生物炼制。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是，提供一株西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229。具体提供一株西藏姜果实来源可以利用葡萄糖、木糖并在高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导下产GABA的酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229，该菌株具有产GABA的能力，并且可以响应高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导，具有很大的应用潜力。
本发明的次要目的是，提供上述菌株在生产GABA中的应用。
本发明的第三个目的是，提供上述菌株利用木质纤维素类生物质生产GABA中的应用。
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
一株西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY- JT229，已于2021年4月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2.6477，分类名为Wickerhamomyces rabaulensis，经检测存活。
本发明JBA-MBY-JT229菌株的分离、纯化和筛选过程如下：用无菌水洗涤样品表面，用75％(v/v)乙醇浸泡样品30s，并用3.5％(v/v)次氯酸钠浸泡样品1min，对样品表面进行消毒处理，然后用生理盐水冲洗消毒过后的样品，将洗脱液涂布于YPD固体培养基平板作为阴性对照，若对照无微生物生长则认为样品表面的微生物被杀死；用无菌研钵捣碎样品获得含内生菌的样品匀浆，用生理盐水稀释后，涂布于YPD固体培养基平板上，置于 25℃恒温培养箱倒置培养1-2天，待平板上长出菌落，挑取菌落到新的YPD培养基平板上划线培养，得到单菌落后挑取单菌落再次划线，重复三次，最后挑取单菌落至YPD液体培养基，置于25℃摇床培养1-2天，用终浓度为30％(v/v)的甘油保存，得到酵母菌株JBA- MBY-JT229。
本发明所涉及的Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229的单菌落呈奶油色到淡黄色，边缘光滑，轻微反光，菌落隆起，易挑起，显微镜下的细胞呈现卵形、椭圆形，经过细胞形态特征观察，以及基于真菌基因组中26s rDNA D1/D2序列这一分子标记的测序并通过 NCBI数据库blast比对分析，鉴定其为Wickerhamomyces rabaulensis相关菌株，并命名为Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229。其分离自西藏姜果实样品，在25℃条件下可利用葡萄糖和木糖，以及在高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导下可以产生GABA。
作为本发明的一种优选实施例，该菌株具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
为达到上述次要目的，本发明的解决方案是：
一株上述的西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensisJBA- MBY-JT229在生产GABA中的应用。
作为本发明的一种优选实施例，西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229利用葡萄糖和木糖作为碳源生产GABA。
作为本发明的一种优选实施例，西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229在高温、乙醇或乙酸胁迫诱导下生产GABA。
作为本发明的一种优选实施例，高温为30-40℃，更优选为37℃，此温度下可积累大量的GABA。
作为本发明的一种优选实施例，乙醇的浓度为3-5％(v/v)，更优选为5％(v/v)，此浓度下可积累大量的GABA。
作为本发明的一种优选实施例，乙酸的浓度为3-5g/L，更优选为5g/L，此浓度下可积累大量的GABA。
为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：
一株上述的西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensisJBA- MBY-JT229在利用木质纤维素类生物质生产GABA中的应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明从西藏姜果实中分离筛选到一株产GABA的Wickerhamomycesrabaulensis 菌株，经过显色法观察和超高效液相色谱-四极杆质谱仪(Waters,USA)测定，精确度可靠可信，从而揭示其生产GABA的能力，该菌株细胞内检测到大量GABA的积累，表明该菌株生产的GABA用于食品和工业领域中的潜力和价值。
第二、本发明的Wickerhamomyces rabaulensis菌株经液体活化，并在37℃条件下以葡萄糖和木糖为碳源的发酵培养基，发酵1-2天时即可积累大量的GABA。
第三、本发明的Wickerhamomyces rabaulensis菌株在37℃高温、5％(v/v)乙醇或5g/L 乙酸胁迫诱导下生产GABA。
附图说明
图1为本发明的实施例1中菌株在400倍显微镜下的细胞形态示意图。
图2为本发明的实施例3中菌株以不同浓度的葡萄糖和木糖为碳源发酵24h的生长状况。
图3为本发明的实施例3中菌株以不同浓度的葡萄糖和木糖为碳源发酵24h生产GABA的产量。
图4为本发明的实施例4中菌株发酵液经高温、乙醇或乙酸诱导发酵24h的生长状况。
图5为本发明的实施例4中菌株发酵液经高温、乙醇或乙酸诱导发酵24h生产GABA产量。
图6为本发明的实施例5中菌株在不同条件下发酵24h胞内积累的GABA的含量。
该威克汉姆酵母菌株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229于2021年4月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2.6477。
具体实施方式
本发明提供了一株西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株及其应用。
本发明通过从西藏地区采集的姜果实样品中分离纯化并鉴定了一株威克汉姆酵母菌株 Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229，该菌株可以利用葡萄糖和木糖生产GABA，并在高温、乙醇或乙酸等多种环境条件下胞外GABA分泌提高，展现了其良好的开发应用潜力。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1、酵母菌株的筛选与生物学鉴定
1)酵母菌株的筛选
用无菌水洗涤样品表面，用75％(v/v)乙醇浸泡样品30s，并用3.5％(v/v)次氯酸钠浸泡样品1min，对样品表面进行消毒处理，然后用生理盐水冲洗消毒过后的样品，将洗脱液涂布于YPD固体培养基平板作为阴性对照，若对照无微生物生长则认为样品表面的微生物被杀死；用无菌研钵捣碎样品获得含内生菌的样品匀浆，用生理盐水稀释后，涂布于 YPD固体培养基平板上，置于25℃恒温培养箱倒置培养1-2天，待平板上长出菌落，挑取菌落到新的YPD培养基平板上划线培养，得到单菌落后挑取单菌落再次划线，重复三次，最后挑取单菌落至YPD液体培养基，置于25℃摇床培养1-2天，用终浓度为30％(v/v)的甘油保存，得到酵母菌株。
2)Wickerhamomyces rabaulensis菌株的鉴定
本实施例的培养基配方如下(灭菌条件均为115℃，20min)：
GABA生产菌株筛选固体培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，溴甲酚绿0.001g，乙醛酸0.02g，琥珀酸0.02g。
YPD液体培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g。高压灭菌。
YPD固体培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。高压灭菌。
YPD发酵培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20/40g。高压灭菌。
YPX发酵培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖20/40g。高压灭菌。
通过将该酵母菌株在YPD平板中培养大约2天后，在400x显微镜下观察其细胞状态；细胞呈卵形、椭圆形，无性繁殖方式为单边芽殖。菌株在YPD的400倍显微镜下的显微图片如图1所示。
将菌株进行基因组提取，并进行26s rDNA D1/D2序列测序的分类鉴定。通过真菌26s rDNA D1/D2引物(正向26s-F：5’-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’SEQ ID NO.2；反向26s-R：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’SEQ ID NO.3)进行以基因组为模板的PCR 扩增。以最终测得26s rDNA D1/D2序列进行blast(http://blas-t.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源比对，其与Wickerhamomyces rabaulensis NRRL Y-7945菌株最相似，最大相似度为99.15％，因此将该菌株鉴定为Wickerhamomyces rabaulensis。
其中，JBA-MBY-JT229 26s rDNA D1/D2序列(SEQ ID NO.1)如下：
CCCCGTGCCATTGCCTCGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATC TAGTACCTTCGGTGCTCGAGTTGTAATTTGAAGATGGTAACTTTGGAGTTGGCCCTTGTC TATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGACGAGGTGATCCA ACTCTATGTAAAGTGCTATCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGT GGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAG GGAAGGGTATTAGATCAGACTTGGCGTTTTATGATTATCTTCCCTTCTTGGGTTGTGCACT CGTATTTCGCTGGGCCAGCATCGATTCGGATGGCAGGATAATGGCAATTGAATGTGGCAT CCACCTCGGTGTATGTGTTATAGCTTTTGTTGATGCTGCCTATCTGGATCGAGGACTGCGT CTTTTGACTAGGATGTTGGCGTAATGATCTAATATCGCCCGTCTTGAACCACGGACCAAACCCCTTC。
本实施例菌株JBA-MBY-JT229的形态特征和培养：在YPD平板上25℃下培养2d后，单菌落呈奶油色到淡黄色，边缘光滑，轻微反光，菌落隆起，易挑起。显微特征：在YPD 平板培养2d后，细胞呈卵形、椭圆形，无性繁殖方式为单边芽殖。Wickerhamomyces rabaulensisJBA-MBY-JT229有较好的耐低温能力，能够利用多种碳源，包括葡萄糖和木糖。
实施例2、JBA-MBY-JT229发酵液中GABA产量的测定
本实施例测定了JBA-MBY-JT229的发酵液中GABA的含量。
具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的JBA-MBY-JT229菌株20μL接种到1mL的YPD液体培养基中，于25℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100mL的YPD种子培养基(即YPD液体培养基)中，置于25℃摇床中培养18h，按照初始OD600为0.1接种到YPD发酵培养基中，用透气封口膜封口，在25℃，200rpm下发酵24h后取样，在8000rpm条件下离心3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定GABA的含量，出峰时间约为1.010min。
实施例3、JBA-MBY-JT229利用葡萄糖和木糖作为碳源生产GABA
本实施例测定了JBA-MBY-JT229利用葡萄糖和木糖作为碳源生产GABA的能力。
具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的JBA-MBY-JT229菌株20μL接种到1mL的YPD液体培养基中，于25℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100mL的YPD种子培养基(即 YPD液体培养基)中，置于25℃摇床中培养18h，按照初始OD600为0.1接种到YPD(葡萄糖20g/L)和YPX(木糖20g/L和木糖40g/L)发酵培养基中(如图2所示)，用透气封口膜封口，在25℃，200rpm下发酵24h后取样，在8000rpm条件下离心3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定GABA的含量，用全波长酶标仪测定600nm下的光吸收值，测定的该菌株发酵液中OD600如图2所示，GABA 的含量如图3所示。
实施例4、JBA-MBY-JT229响应高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导生产GABA
本实施例测定了JBA-MBY-JT229在高温、添加乙醇或乙酸发酵条件下GABA的含量。
具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的JBA-MBY-JT229菌株20μL接种到1mL的YPD液体培养基中，于25℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100mL的YPD种子培养基(即 YPD液体培养基)中，置于25℃摇床中培养18h，按照初始OD600为0.1接种到YPD(葡萄糖20g/L)发酵培养基中(如图4所示)，分别按照乙醇3％(v/v)和乙醇5％(v/v)，乙酸3 g/L和乙酸5g/L的浓度添加至发酵液中，对照组不添加任何条件，用透气封口膜封口，在 25℃，200rpm下发酵24h后取样，高温条件放置于30℃和37℃，200rpm下发酵24h后取样，在8000rpm条件下离心3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定GABA的含量，用全波长酶标仪测定600nm下的光吸收值，测定的该菌株发酵液中OD600如图4所示，GABA的含量如图5所示。
实施例5、JBA-MBY-JT229在木糖发酵、高温或乙酸胁迫条件下胞内GABA的含量
本实施例测定了JBA-MBY-JT229的胞内GABA含量。
具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的JBA-MBY-JT229菌株20μL接种到1mL的YPD液体培养基中，于25℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100mL的YPD种子培养基(即 YPD液体培养基)中，置于25℃，200rpm条件下培养18h，按照初始OD600为0.1分别接种到YPD(葡萄糖20g/L)或YPX(木糖20g/L)发酵培养基中，乙酸胁迫的条件按照3 g/L的浓度添加乙酸，用透气封口膜封口，置于25℃摇床，高温组置于30℃摇床，对照组置于25℃摇床，不添加任何条件，在200rpm下发酵24h后取样50mL，于4℃，3000rpm条件下离心5min，收集菌体，随后用无菌去离子水洗涤两次，加入4mL、0.1mol/L盐酸溶液，悬浮细胞，然后按800μL/管分装至五个1.5mL离心管中。其中一管细胞液经过10000 rpm离心2min后去除上清，置于50℃烘箱中至细胞干重恒定，精密分析天平测定细胞干重，剩下四管各加直径为0.5mm的玻璃珠500μL，放置于-20℃预冷的金属模块中，用细胞破碎仪将细胞破碎，随后在4℃，12000rpm条件下离心5min收集所有上清液于5mL离心管中，两管上清液合并为一管，然后加入适量体积预冷的磺基水杨酸(16.7％,w/v)，至终浓度为4.5％(w/v)，振荡混匀，4℃静置1h，在4℃，15000rpm条件下离心30min收集上清液，用1mol/L的NaOH调pH为1.9，经0.22μm滤膜过膜后，用氨基酸分析仪检测GABA 的含量，结果如图6所示。
由图6可看出，本实施例鉴定的这株Wickerhamomyces rabaulensis JBA-MBY-JT229的胞内也蕴含着大量的GABA资源，最高产量为3074.99mg/g干重，并且在以木糖作为唯一碳源和添加乙酸的条件下，单位细胞积累的GABA都高于葡萄糖为唯一碳源，25℃条件下培养的对照组，这表明了其利用木质素水解液作为发酵原料生产GABA中的潜力和应用价值。
综上所述，本发明提供了一株从中国西藏地区采集的姜果实样品中分离得到的产GABA 酵母菌株，经过分子鉴定将其分类归属为Wickerhamomyces rabaulensis。该菌株在2021年4 月6日保藏于中国(北京)普通微生物菌种保藏中心，且将其原始命名为JBA-MBY-JT229，保藏编号为CGMCC No.2.6477。通过初筛，发现该菌株可以生产GABA，利用超高效液相色谱-四极杆质谱仪确定了该菌株生产GABA的能力。该菌株耐低温性强，可在 4℃下生长，在25℃下生长最好。该菌株可以利用葡萄糖和木糖生产GABA，并响应高温、乙醇和乙酸多种胁迫条件的诱导，最优选地在37℃高温条件下利用葡萄糖作为碳源，在摇瓶中最高产量达到148.14mg/L。此外，该菌株胞内积累了大量的GABA，最高产量为 3074.99mg/g干重，表明了其在作为微生物细胞工厂生产GABA中的潜力和应用价值。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过额外的创造性的劳动。因此，本发明不仅限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 伽蓝（集团）股份有限公司
<120> 西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株及其应用
<141> 2021-09-22
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 酵母菌(Curvibasidium rogersii)
<400> 1
ccccgtgcca ttgcctcgta cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt gaaatctagt 60
accttcggtg ctcgagttgt aatttgaaga tggtaacttt ggagttggcc cttgtctatg 120
ttccttggaa caggacgtca cagagggtga gaatcccgtc tgacgaggtg atccaactct 180
atgtaaagtg ctatcgaaga gtcgagttgt ttgggaatgc agctctaagt gggtggtaaa 240
ttccatctaa agctaaatat tggcgagaga ccgatagcga acaagtacag tgatggaaag 300
atgaaaagaa ctttgaaaag agagtgaaaa agtacgtgaa attgttgaaa gggaagggta 360
ttagatcaga cttggcgttt tatgattatc ttcccttctt gggttgtgca ctcgtatttc 420
gctgggccag catcgattcg gatggcagga taatggcaat tgaatgtggc atccacctcg 480
gtgtatgtgt tatagctttt gttgatgctg cctatctgga tcgaggactg cgtcttttga 540
ctaggatgtt ggcgtaatga tctaatatcg cccgtcttga accacggacc aaaccccttc 600
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 2
gcatatcggt aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
Claims (6)
1.一株西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株(W.rabaulensis)JBA-MBY-JT229，其特征在于：于2021年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.2.6477。
2.一株如权利要求1所述的西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株(W.rabaulensis)JBA-MBY-JT229在生产GABA中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株(W.rabaulensis)JBA-MBY-JT229利用葡萄糖和木糖作为碳源生产GABA。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述西藏姜果实来源的威克汉姆酵母菌株(W.rabaulensis)JBA-MBY-JT229在30-40℃、乙醇或乙酸胁迫诱导下生产GABA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述乙醇的浓度为3-5％(v/v)。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述乙酸的浓度为3-5g/L。
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