CN103952334A

CN103952334A - 一种微生物发酵生产l-赤藓酮糖的菌株hd385和方法

Info

Publication number: CN103952334A
Application number: CN201410112899.6A
Authority: CN
Inventors: 朱龙华; 刘宇鹏; 李柱坚; 潘龙; 靳魁奇; 朱晓宏
Original assignee: SHENZHEN BODA BIOPHARM Co Ltd; Henan University
Current assignee: SHENZHEN BODA BIOPHARM Co Ltd; Henan University
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2034-03-25
Also published as: CN103952334B

Abstract

本发明属于涉及一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）Gluconobacterkondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.8391。本发明还给出了利用该菌株发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖，最高达到186.5g/L，可实现工业化生产。

Description

一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385和方法

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及到一种好氧微生物发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖用的菌株HD385和利用该菌株发酵生产赤藓糖醇的方法。

背景技术

L-赤藓酮糖是一种天然的丁酮糖，是赤藓糖的酮糖形式。其分子式是C₄H₈O_4，分子量为120.10，英文名称：L-erythrulose，是一种黄色高粘稠液体，有甜味。

L-赤藓酮糖可以与皮肤外部或老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应，使皮肤变成棕色而作为自然仿晒试剂，同时它也是多种抗感染药物的前体化合物。其主要用途是用于化妆品行业，一般用作美黑剂。与二羟基丙酮相比较，其美黑效果更佳持久、自然；如果和二羟基丙酮配合使用，使颜色加深，分布更为均匀。

L-赤藓酮糖的工业化生产主要是利用含有赤藓糖醇脱氢酶微生物以赤藓糖醇为底物发酵生产。报道最多的能产L-赤藓酮糖的微生物为葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）和醋杆菌属（Acetobacter）。目前已报道的能产L-赤藓酮糖的微生物资源如下：Gluconobacter oxydans ATCC621、Gluconobacter oxydans DSM7145、Gluconobacter frateurii CHM43、Gluconobactermelanogenus LMG1387、Acetobacter suboxydans、Acetobacter xylinum等。国内外关于产L-赤藓酮糖的微生物资源及微生物生产报道较少，且很多菌株的转化率都较低，例如利用Gluconobacter oxydans ATCC621生产L-赤藓酮糖时对底物的转化率仅为45~50%。因此，自主创新地筛选出能够耐受高浓度赤藓糖醇的微生物菌株，并且研究出一种能够生产高浓度L-赤藓酮糖的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一种对高浓度赤藓糖醇有一定耐受性的菌株HD385，该菌株可用于微生物发酵生产L-赤藓酮糖。

本发明还给出了利用该菌株HD385发酵生产L-赤藓酮糖的方法，该方法以赤藓糖醇为原料，赤藓糖醇转化率较高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）Gluconobacter kondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8391；保藏日期为2013年10月24日；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按1～10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于28～30℃发酵培养48～72 h；所述液体发酵培养基组成为：赤藓糖醇50～250 g/L，氮源6～20 g/L，碳酸钙0.1～15 g/L，KH₂PO₄0.1～8 g/L，余量为水，培养基pH 4～7。

或者，也可以将菌株HD385先按1～10%的接种量接种到一级种子培养基中，于28～30℃好氧培养6～24 h；然后将培养好的一级种子按1～10%的接种量接入二级种子培养基中，8～10 h后将培养好的二级种子按1～10%的接种量再接入液体发酵培养基；其中，所述一级种子培养基的组成为：赤藓糖醇10～50g/L，酵母粉5～15g/L，KH₂PO₄0.1～0.5g/L，余量为水，pH自然；所述二级种子培养基的组成为：赤藓糖醇10～50g/L，酵母粉5～15g/L，CaCO₃0.1～0.5g/L，余量为水，pH 4.0～7.0。

具体的，所述赤藓糖醇优选为食品级赤藓糖醇、医药级赤藓糖醇等。所述氮源优选为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐等。

可通过本领域的常规方法来调节培养基的pH值，如添加盐酸、氢氧化钠等无机酸碱。其中，所述液体发酵培养基、一级种子培养基和二级种子培养基的灭菌条件为：107～121℃，15 min。

在本发明中，建立了一个筛选高产L-赤藓酮糖的模型。由于具有赤藓糖醇脱氢酶的微生物能利用赤藓糖醇做为碳源生长，并产生L-赤藓酮糖，因此设计出以赤藓糖醇为唯一碳源的选择性平板，筛选出能够利用赤藓糖醇的菌株。在平板上挑出较大的菌落至摇瓶，液体发酵筛选。本发明的特点是从腐烂的蔬菜中分离得到能有效产生L-赤藓酮糖的Gluconobacter kondoniiHD385，其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖（40－186 g/L），最高达到186 g/L，可实现工业化生产。

本发明方法的突出优点是利用廉价的赤藓糖醇为原料来发酵生产高附加值产品L-赤藓酮糖，该方法可持续生产，且对环境友好。

附图说明

图1为Gluconobacter kondoniiHD385的平板菌落照片；

图2为Gluconobacter kondoniiHD385的扫描电镜照片（×5000）；

图3为 Gluconobacter kondoniiHD385的16S rDNA全序列测序结果；

图4为基于BLAST结果构建的进化树。

具体实施方式

（一） Gluconobacter kondoniiHD385的筛选：

1、初筛：

从腐烂的蔬菜中取样，粉碎后，取10 g加入90 mL无菌生理盐水，振荡1 h，取上清液，稀释成一系列浓度梯度。取10^-5、10^-6、10^-7三个梯度0.2 mL涂布于平板培养基（平板培养基组成为：赤藓糖醇150 g/L，酵母粉15 g/L，琼脂粉15 g/L，KH₂PO₄ 1g/L，余量为水，pH自然），28℃培养3~4 d，获得单菌落。选取菌落均匀的平板，从其上挑取10－20个较大菌落分别接种至发酵培养基（每株菌株做一个摇瓶，发酵培养基组成为：赤藓糖醇100 g/L，酵母粉10 g/L，CaCO₃ 3 g/L，余量为水，pH自然），28℃发酵培养48 h。

然后取1.5mL发酵液12000转/分离心5 min，取上清液，稀释后用HPLC法测定L-赤藓酮糖含量。HPLC条件如下：色谱柱 Aminex HPX-87C柱（7.8 mm×300 mm，9 μm）；流动相：去离子水；检测器：RI检测器，UV检测器（检测波长277 nm）；柱温60℃；流速0.4 ml/min；进样量20 μl。

选取产L-赤藓酮糖较高的百余株菌株，于4℃条件下保存其相应斜面（斜面培养基组成为：赤藓糖醇30 g/L，酵母粉15 g/L，琼脂粉15 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，余量为水，pH自然，赤藓糖醇为食品级）。

、复筛：

将初筛保留的菌株转接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中（每株菌株做三个摇瓶平行样，发酵培养基组成与初筛中的发酵培养基相同），200转/分，28℃好氧培养48 h。取1.5 mL发酵液12000转/分，离心5 min，取上清液，稀释后用HPLC法测定L-赤藓酮糖含量。

多数菌株L-赤藓酮糖含量较低，仅有3-8-5号菌株（实验室该菌株编号为HD385）产L-赤藓酮糖显著，为64.9 g/L。表1中给出了产L-赤藓酮糖效果较好的数十余株菌株。

表1 部分试验菌株的产L-赤藓酮糖情况

（二） Gluconobacter kondoniiHD385的鉴定：

筛选得到的能有效积累L-赤藓酮糖且效果显著的微生物菌株HD385：该菌的细胞呈短杆状，不运动，无芽孢。革兰氏阴性，菌落在赤藓糖醇平板上28℃条件下培养3～4 d后菌落较小、湿润、圆形、隆起、边缘波形、不透明、正反面颜色一致呈淡黄色，直径可达1~3 mm（见图1和图2）。

按《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》、《葡萄糖酸杆菌属分类及其主要应用的研究进展》（冯静等，微生物学杂志，2010, 30（2）:86-90）和《Gluconobacter sphaericus (Ameyama 1975) comb. nov, a brown pigment-producing acetic acid bacterium in the Alphaproteobacteria》（Taweesak Malimas et al., J Gen Appl Microbiol, 2008,54:211-220）进行生理生化特性鉴定（结果见表2）。

根据革兰氏染色、接触酶、氧化酶、还原硝酸盐、液化明胶、产吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸盐到CO₂和H₂O、多醇类生酮、水解淀粉、D-木糖产酸、D-葡萄糖产酸等Gluconobacter属的特征生理生化反应结果鉴定该菌株属于Gluconobacter属。根据形成5-酮基葡萄糖酸、形成二羟基丙酮、D-阿拉伯糖醇生长、赤藓糖醇生长等种间生理生化特性鉴定该菌株属于Gluconobacter kondonii，拟命名为Gluconobacter kondonii HD385。

同时，委托大连宝生物工程有限公司对HD385菌株进行16S rDNA全序列测序（共1398bp，结果见图3）。在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列（见表3），用MEGA 4.0软件构建进化树分析（见图4）。基于16S rDNA序列分析和构建进化树分析得出HD385与Gluconobacter kondonii、Gluconobacter albidus亲缘关系较近，菌株HD385可以确定为Gluconobacter属。

由上述鉴定结果可知，菌株HD385属醋酸菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 8391。

表2 生理生化特性鉴定结果对照表

表3 16S rDNA序列同源性（或相似性）比较

（三）利用菌株HD385发酵生产L-赤藓酮糖：

实施例1

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385先按10%的接种量接种到一级种子培养基中（所述一级种子培养基的组成为：赤藓糖醇30 g/L，酵母粉15 g/L，KH₂PO₄0.3 g/L，余量为水，pH自然），于28℃好氧培养24 h；然后将培养好的一级种子按5%的接种量接入二级种子培养基中（所述二级种子培养基的组成为：赤藓糖醇30 g/L，酵母粉15 g/L，CaCO₃0.3 g/L，余量为水，pH 6.0），8 h后将培养好的二级种子按5%的接种量分别接入含不同赤藓糖醇浓度的液体发酵培养基中（250 mL三角瓶，装液量50 mL）。转速200转/分，28℃条件下发酵48 h，测定L-赤藓酮糖含量，实验结果见表4。

其中，所述液体发酵培养基组成为：赤藓糖醇50~250 g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄1 g/L，CaCO₃ 3g/L，余量为水，pH 6.0，赤藓糖醇为食品级。种子灭菌温度为115℃，15 min。发酵培养基的灭菌温度115℃，20 min，CaCO₃160℃干热灭菌1 h。

表4 不同赤藓糖醇浓度下菌株HD385的L-赤藓酮糖产量

实施例2

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按4%的接种量直接接入液体发酵培养基（所述液体发酵培养基组成为：食品级赤藓糖醇100g/L，蛋白胨8g/L， KH₂PO₄3 g/L，碳酸钙3g/L，余量为水，培养基pH 7），在好氧条件下于30℃发酵培养72 h；测得发酵液中L-赤藓酮糖含量为79.4 g/L。

实施例3

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按8%的接种量直接接入液体发酵培养基（所述液体发酵培养基组成为：医药级赤藓糖醇100 g/L，玉米浆20 g/L，KH₂PO₄5 g/L，碳酸钙8 g/L，余量为水，培养基pH 5.5），在好氧条件下于30℃发酵培养72 h；测得发酵液中L-赤藓酮糖含量为81.0 g/L。

实施例4

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按2%的接种量直接接入液体发酵培养基（所述液体发酵培养基组成为：食品级赤藓糖醇100 g/L，尿素6 g/L，KH₂PO₄8 g/L，碳酸钙10 g/L，余量为水，培养基pH 4），在好氧条件下于28℃发酵培养48 h；测得发酵液中L-赤藓酮糖含量为12.2 g/L。

实施例5

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按10%的接种量直接接入液体发酵培养基（所述液体发酵培养基组成为：食品级赤藓糖醇100 g/L，牛肉膏15 g/L，KH₂PO₄3 g/L，碳酸钙15 g/L，余量为水，培养基pH 7），在好氧条件下于28℃发酵培养48 h；测得发酵液中L-赤藓酮糖含量为74.1 g/L。

实施例6

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将培养好的二级种子按5%的接种量接入装液量为3L的7 L发酵罐（发酵培养基配方为：食品级赤藓糖醇150 g/L，酵母粉15 g/L，KH₂PO₄5 g/L，CaCO₃3 g/L，余量为水，pH 6.0）中，转速400 转/分，通气量2.0 vvm。28℃条件下发酵48 h，测得发酵液中L-赤藓酮糖含量为130.6 g/L。一、二级种子培养基组成与实施例1相同。

实施例7

利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为：将菌株HD385按4%的接种量接种到一级种子培养基中，200转/分，28℃条件下好氧培养24h。然后按5%的接种量将培养好的一级种子接入装有二级种子培养基的250 mL三角瓶中（装液量为50 mL），8 h后按5%的接种量将培养好的二级种子接入装液量为30 L的机械搅拌发酵罐中进行补料分批发酵。发酵罐转速200 转/分，通气量1.0 vvm，28℃条件下发酵48 h，HPLC法测定发酵液中L-赤藓酮糖和残余赤藓糖醇含量。一、二级种子培养基组成与实施例1相同。

初始发酵培养基配方：赤藓糖醇50 g/L，酵母粉15 g/L，KH₂PO₄3 g/L，CaCO₃ 3g/L，余量为水，pH调至6.0。补料液赤藓糖醇浓度300 g/L，115℃灭菌20 min备用。当发酵液中初始赤藓糖醇浓度下降到10 g/L以下时，开始流加补入补料液将发酵液中赤藓糖醇浓度控制在5～15 g/L，所用赤藓糖醇为食品级。

分别在发酵第0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h测定发酵液中L-赤藓酮糖和残余赤藓糖醇含量，实验结果见表5。

发酵48 h，下罐时L-赤藓酮糖含量186.5 g/L，总计投入赤藓糖醇（初始培养基中赤藓糖醇加上补料赤藓糖醇）折算后为193 g/L，残余赤藓糖醇0.4 g/L，L-赤藓酮糖转化率（L-赤藓酮糖/投入赤藓糖醇，w/w）为96.6 %。

表5 菌株HD385于30 L罐补料分批发酵的L-赤藓酮糖产量

。

Claims

1.一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）Gluconobacter kondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8391。

2.利用权利要求1所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：将菌株HD385按1～10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于28～30℃发酵培养48～72 h；所述液体发酵培养基组成为：赤藓糖醇50～250 g/L，氮源6～20 g/L，碳酸钙0.1～15 g/L，KH₂PO₄0.1～8 g/L，余量为水，培养基pH 4～7。

3.根据权利要求2所述发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，将菌株HD385先按1～10%的接种量接种到一级种子培养基中，于28～30℃好氧培养6～24 h；然后将培养好的一级种子按1～10%的接种量接入二级种子培养基中，8～10 h后将培养好的二级种子按1～10%的接种量再接入液体发酵培养基；其中，所述一级种子培养基的组成为：赤藓糖醇10～50 g/L，酵母粉5～15 g/L，KH₂PO₄0.1～0.5 g/L，余量为水，pH自然；所述二级种子培养基的组成为：赤藓糖醇10～50 g/L，酵母粉5～15 g/L，CaCO₃0.1～0.5 g/L，余量为水，pH 4.0～7.0。

4.根据权利要求2或3所述发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，所述赤藓糖醇为食品级赤藓糖醇或医药级赤藓糖醇。

5.根据权利要求2或3所述发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐。