CN103789219A - 用于白酒酿造的酿酒酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，保藏编号为CGMCC No6979。该菌株最佳发酵培养基是高粱汁培养基。发酵参数条件为温度30℃，培养时间70h，接种量3％和pH6.5，其酒精含量达到7.4％vol；产乙酸乙酯的最佳工艺参数为：温度25.5℃，培养时间60h，接种量5％和pH5.7，其乙酸乙酯含量达到16.95mg/100mL。该菌株既产酒精又产酯，既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求，兼具了酒精酵母和产酯酵母的双重特性，成为老白干酿造过程不可缺少的特征性功能菌，对于老白干酒的典型风格特点的形成具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域。
背景技术
中国白酒香味物质种类繁多，包括醇、醛、酮、酸、酉旨、缩醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚类、内酷类等化合物达数百种之多(庄名扬，酿酒，2007，34(2)：109一113)。中国白酒风味物质的形成，是微生物代谢的产物，同时也是原料中基本组分及非基本组分，在各类生物酶的直接或间接催化下的生物合成、非酶促化学反应和热降解反应等多种因素共同作用结果。
白酒的风味与酿造微生物及酿造工艺也有直接关系。酿造基酒质量的高低对产品的最终质量的好坏起决定性的作用。白酒酿造中的生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属，是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种(熊子书，酿酒科技，2002，5：19一21)。浓香型白酒以己酸乙酷为主的复合香，是由梭状芽抱杆菌，俗称己酸菌的作用，产于泥质发酵老窖或人工培养泥窖中，发酵周期长；清香型白酒以醋酸乙酯为主体香，在小曲、鼓曲或液态法白酒中添加生香酵母，在发酵过程中生成醋酸及其乙酯。酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种类有密切关系。
白酒发酵要求酿酒菌剂具有产酯率高、产酒精率高并耐高温。质量相同的原料使用不同的酿酒菌剂，形成不同的酒精产量和酯含量。好的酿酒菌剂使同样的原料酒精产量高、富含酯类，并使白酒纯香。但传统大曲虽然产酯率高，产酒率却较低，特别是大曲构成成份复杂，使白酒质量不稳定；而单个酵母菌或酿酒菌剂组合物不耐高温，虽发酵产酒率高但产酯率低，白酒品质较差。
酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种类有密切关系。乙酸乙酯的产生量高低被普遍认为是依赖于酯的合成和酯的水解之间的平衡。在最新审定通过的中国兼香型白酒国家标准中，总酯含量(以乙酸乙酯计)是划分白酒等级的重要指标，优级酒总酷酯含量比一级酒高1倍(熊小毛等，2009)。如何提高白酒中总酯含量，提高白酒等级是白酒企业和研究者面对的技术难题。
发明内容
本发明提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，该菌株已经于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No6979
CGMCC No6979菌株的细胞卵圆形，在麦芽固体培养基培养24h后，形成乳白色菌落，表面湿润、有光泽，圆形，边缘整齐，隆起，不透明。
CGMCC No6979既产酒精又产酯，既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求，兼具了酒精酵母和产酯酵母的双重特性，成为老白干酿造过程不可缺少的特征性功能菌。其代谢特性对于老白干酒的典型风格特点的形成具有重要意义。
酿酒酵母CGMCC No6979的最佳发酵培养基是高粱汁培养基，该菌株酒精的最佳发酵工艺参数为：温度30℃，培养时间73h，接种量3％和pH6.5，发酵液的酒精度为7.6％vol。其产乙酸乙酯的最佳工艺参数为：温度25.5℃，培养时间60h，接种量5％和pH5.7，其乙酸乙酯含量达到16.95mg/100mL。
CGMCC No6979菌株从衡水老白干大曲中培养、经过分离得到，具体步骤为：
(1)麦芽粉培养基制备：
麦芽粉20g，蛋白胨1g，萄萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH调至6.0，121℃灭菌20min。
固体培养基加2％琼脂.
(2)菌株分离及形态观察：
将粉碎的大曲1g溶于9mL0.9％的灭菌生理盐水的试管中，振荡30分钟，吸出1mL，注入9mL0.9％的灭菌生理盐水的试管中，依次操作五次，稀释倍数达107，从107试管中吸取0.2mL，注入装有固体麦芽粉培养基的培养皿内进行涂布，30℃培养2d后，观察菌落形态，从中挑出乳白色，表面湿润、有光泽，圆形，边缘整齐，隆起，不透明菌落，挑取单菌落，在显微镜下观察细胞形态，选取酵母大小均一、酵母细胞健壮的单个菌落在装有固体麦芽粉培养基的培养皿内划线培养，从中挑取单个菌落接入试管斜面，30℃下培养2d，将试管斜面菌种放入冰箱0-4℃保存备用。
(3)26S rRNA基因序列测定：
挑取一环试管斜面菌种于10μL灭菌水中，99℃、10min变性，离心取上清液做模板，使用试剂盒TaKaRa Fungi Identification PCRIit(Code No.D317)，进行PCR扩增目的片段，取5ul进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段，以Seq Forward为引物进行DNA测序。测序结果在GeneBank中利用Blast程序进行比对。
采用特异性引物扩增后，获得的26SrDNA序列在GeneBank的比对结果显示，HJY-002与酿酒酵母(GU565213.1)的26S rRNA基因的相似性达到100％。结合菌体形态特征的鉴定结果，将菌株HJY-002确定为酿酒酵母。
附图说明：
图1为HJY-002在显微镜下的菌体细胞形态
图2为HJY-002在培养皿内的菌落形态
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明用于白酒酿造的酿酒酵母。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
酿酒酵母HJY-002在液态条件下产酒精产酯实验：
培养基制备：
(1)麦芽粉培养基
麦芽粉20g，蛋白胨1g，萄萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH调至6.0，121℃灭菌20min。固体培养基加2％琼脂.
(2)大米麦芽培养基
取粉碎后的麦芽和大米按质量比1∶4混合后，加入3倍量的水，加液化酶液化后，再加糖化酶糖化，过滤备用，糖度控制在12Brix，121℃灭菌30min。
(3)纯麦芽培养基
取粉碎后的麦芽加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，过滤备用，糖度控制在12Brix，121℃灭菌30min。
(4)高粱汁培养基
取粉碎后的高粱加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，过滤备用，糖度控制在12Brix，121℃灭菌30min。
(5)玉米汁培养基
按GB/T20886-2007的制备方法进行。
测定方法
1酒精度的测定
取成熟发酵液200mL加入到蒸馏瓶中，加入100mL蒸馏水，调pH在6.5左右，混匀后蒸馏，准确取出100mL蒸馏液，用酒精计测定酒精含量，同时测定温度，转换成20℃时的酒精度。
2香气成分分析
采用岛津GC-14C气相色谱仪对蒸馏后的溜出液进行测定，测定条件：大口径毛细管柱，柱温70℃，进样器温度250℃，检测器温度230℃。
酵母菌发酵
通过对酵母菌在不同温度、不同培养基、不同接种量和不同发酵时间条件下，发酵产物的酒精度测定，确定其各自最佳温度、培养基、接种量和发酵时间。
菌株HJY-002可在23℃～30℃的范围内发酵，29℃时，发酵液的酒精含量最高，达到4.6％vol，相当于23℃时的1.58倍。该菌株的最佳发酵培养基是高粱汁培养基。高粱培养基中酒精含量最高，达到6.30％vol，是玉米培养基的2.1倍。接种量在2％-7％的范围内，随着接种量的提高，发酵液的酒精含量逐渐增大，3％的接种量，发酵液酒精含量最高，达到4.3％vol。当培养时间为72h时，发酵液的酒精含量最高，达到3.5％vol，是36h含量的1.3倍。
发酵参数条件为温度30℃，培养时间70h，接种量3％和pH6.5，其酒精含量达到7.4％vol。更优的发酵参数为：为：温度30
C，培养时间73h，接种量3％和pH6.5。酒精度为7.6％vol。
酿酒酵母(HJY-002)香气成分实验结果
酿酒酵母HJY-001香气成分发酵条件的L9(34)正交实验结果
结果表明，在以高粱汁为培养基的条件下，菌株HJY-002能产生多种香气成分，包括乙醛、正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯，其含量分别在1.55-8.76mg/100mL，0.30-0.96mg/100mL，1.10-3.58mg/100mL、3.11-19.42mg/100mL、16.95mg/100mL。
该菌株产乙酸乙酯的最佳工艺参数为：温度25.5℃，培养时间60h，接种量5％和pH5.7。其乙酸乙酯含量达到16.95mg/100mL。
酯在白酒中起到呈香显味的作用，白酒除酯后香气大减。老白干香型白酒乙酸乙酯和乳酸乙酯是主体香，乙酸乙酯放香愉悦，口感甜、细。适量的醛类物质对老白干酒有明显的助香、提香作用，使酒体醇香甜净，与其他香味成分互相影响，互相缓冲，互相协调，构成老白干酒醇厚丰满的独特风格。适量的高级醇含量，使酒体醇甜味甘，对老白干酒的醇香清雅起到烘托和复合作用。酿酒酵母HJY-002在产酒、产酯、产醛、产高级醇方面均有出色表现。成为老白干酿造过程不可缺少的特征性功能菌。
Claims (4)
1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，保藏编号为CGMCC No6979。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，其特征在于所述酿酒酵母CGMCC No6979的最佳发酵培养基是高粱汁培养基。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，其特征在于所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002产乙酸乙酯的最佳工艺参数为：温度25.5℃，培养时间60h，接种量5%和pH5.7，其乙酸乙酯含量达到16.95mg/100mL。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种HJY-002，其特征在于所述酿酒酵母CGMCC No6979的最佳发酵培养基是高粱汁培养基，该菌株酒精的最佳发酵工艺参数为：温度30℃，培养时间73h，接种量3％和pH6.5，发酵液的酒精度为7.6％vol。
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