CN109609391A - 一种菌丝球的定量接种方法 - Google Patents

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    • C12Q1/06—Quantitative determination

Abstract

本发明提供了一种菌丝球的定量接种方法，利用微孔板进行菌丝球培养，绘制菌丝球干重与培养体积之间的标准曲线，以标曲确定菌丝球的接种量。在微孔板培养体系中，可根据不同培养液体积来制备不同数量及大小的菌丝球，同一培养体积下菌丝球的数量及大小相近，可满足不同的接种需求。本发明所述的菌丝球接种方法，为菌丝球的接种拟定了计量标准，能够克服菌丝球接种时难以定量的问题。

Description

一种菌丝球的定量接种方法
技术领域
本发明属于丝状真菌接种发酵技术领域，具体涉及一种菌丝球的定量接种方法。
背景技术
丝状真菌在一定条件下液态发酵容易缠绕成球，球状菌丝体与游离菌丝体相比，物质的传递效率不同，群体感应和胁迫程度也不同，进而影响其代谢水平。有研究表明，红曲霉在菌丝球条件下洛伐他汀的产量增加；黑曲霉在菌丝球条件下柠檬酸产量增加。
当前文献极少体积菌丝球的接种问题，因为多数文献都是直接接种孢子液让其自然成球，随后继续发酵。然而，这种发酵方式下，菌丝球的成球情况太多随机，菌丝球的数量、大小不一，菌丝球的量更是无从得知，对于菌丝球的发酵研究较为不利。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种菌丝球的定量接种方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种菌丝球的定量接种方法：把PDA平板上的丝状真菌孢子制备成孢子悬液，接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中30℃、200r/min发酵4d形成菌丝球，绘制培养液体积与菌丝球干重之间的标曲。根据预先确定菌丝球的接种量，由标曲换算应在微孔板中加多少体积的培养液，培养后经过无菌纱布过滤，将菌丝球接种于发酵液即可。具体操作方法如下：
PDA培养基的配置方法为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、15~20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min。临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固。
丝状真菌孢子悬液的配置方法为：在平板中加生理盐水，用接种铲轻轻刮下孢子，把孢子液过四层擦镜纸，滤掉菌丝，将滤液稀释至106CFU/mL。
24深孔板中的培养液的配置方法为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
干重测定方法为：将孔板中每个孔的菌丝球分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重。
标曲的绘制方法为：24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%。待发酵完成后，按照所述方法称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线。
本发明的有益效果在于：
（1）由于孔板培养条件下孢子接触几率增加，相比于摇瓶发酵而言，丝状真菌更易成球，从而更容易获得菌丝球；
（2）微孔板中不同培养体积条件下菌丝球的大小及数量不同，可根据实际所需定向培养菌丝球；
（3）可根据菌丝球的标曲知晓菌丝球的接种量，更利于菌丝球接种的量化管理。
附图说明
图1为红曲霉摇瓶发酵效果图。
图2为不同培养体积下的24深孔板发酵效果图。
图3为红曲霉菌丝球接种量的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
所用丝状真菌为红曲霉。
红曲霉孢子液的制备：在PDA平板中加生理盐水，用接种铲轻轻刮下孢子，把孢子液过四层擦镜纸，滤掉菌丝，将滤液稀释至106CFU/mL。
PDA培养基的配置方法为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min。临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固。
红曲霉培养液的制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
摇瓶发酵：将红曲霉孢子液接种于装有30mL的培养液的250mL锥形瓶中，30℃200r/min培养4d，接种量为5%。
24孔板发酵：将红曲霉孢子悬液接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中30℃、200r/min发酵4d，接种量为5%。其中，24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL。
摇瓶发酵的效果如图1，从图1可看出，红曲霉难以形成肉眼可见的菌丝球。孔板发酵效果如图2，孔板中培养液体积为1.2mL时，菌球数量少、直径小；培养液体积在2.4~4.8mL时，菌球直径几乎一致，但菌球的数量随着培养液体积的增加而增加；培养液体积为6.0或7.2时，几乎形成一个大菌球，且培养液的体积在7.2mL时红曲霉菌丝球较为规则、表面较为光滑。因此可根据实际接种菌丝球的数量或大小需求来定向培养红曲霉。
另一方面，将不同培养液体积中的红曲霉菌丝球进行干重测定绘制标曲，标曲如图3所示，标曲线性良好，即可根据初始培养液体积去换算实际接种菌丝球的质量，使菌丝球发酵的接种问题从经验化转变为数量化。
干重测定方法为：将孔板中每个孔的所有物质分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重。
标曲的绘制方法为：24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%。待发酵完成后，按照所述的方法称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：把PDA平板上的丝状真菌孢子制备成孢子悬液，接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中，30℃、200r/min发酵4d形成菌丝球，绘制培养液体积与菌丝球干重之间的标曲，根据标曲确定菌丝球的接种量。
2.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：PDA培养基为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、15~20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min；临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固。
3.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：孢子悬液浓度为106CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：培养液配置方法为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：干重测定方法，将孔板中每个孔的菌丝球分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重。
6.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：标曲的绘制方法，24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%；待发酵完成后，按照权利要求5的方法称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线。
7.根据权利要求1所述的一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：接种方法，预先确定菌丝球的接种量，根据标曲换算应在微孔板中加多少体积的培养液，培养后经过无菌纱布过滤，将菌丝球接种于发酵液即可。
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