CN102845243A - 一种苹果腐烂病室内抗性试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出的是一种苹果腐烂病室内抗性试验方法。通过苹果腐烂病分生孢子获取、试样采集与处理、接种培养和抗病性对照步骤。本发明通过桃枝培养基获取纯净分生孢子，克服以往研究通过菌丝或悬浮于液体培养基中萌发的分生孢子接种，菌源量过大，与田间侵染过程不符合的问题，符合病菌田间侵染规律。从田间直接获取枝条，保证枝条的活力与植株相近，且枝条打孔后用浓氨水杀伤，使枝条具有新鲜死组织保证发病率。且操作技术简单，发病时间短，鉴定迅速，能准确反映树体抗性水平。适宜作为苹果抗病性试验应用。

Description

一种苹果腐烂病室内抗性试验方法

技术领域

本发明涉及的是植物保护领域的试验方法，具体地说是一种苹果腐烂病室内抗性试验方法。

背景技术

苹果腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的苹果枝干病害，是我国和东亚其它国家的重要苹果病害，该病不仅造成苹果产量和品质的下降，也是造成死树和毁园的主要原因。每次腐烂病的大发生，均给我国各苹果产区生产造成毁灭性地打击。因此，苹果腐烂病防治问题也一直困扰着广大苹果种植者和科研人员，通常都是采取以加强栽培管理、提高树体抗病能力为基础，以及时检查刮治为重点，与清除病原、药剂防治、病树桥接相结合的综合防治方法，都难以控制苹果腐烂病的发生和蔓延。苹果腐烂病抗性品种应用便成为解决腐烂病发生和蔓延的有效途径，虽然目前的苹果栽培品种都是感病品种，日本通过室内枝段接菌丝悬浮液抗性鉴定方法，已筛选出对苹果腐烂病有较好抗性的种质资源，并且杂交后对腐烂病的抗性具有一定的遗传力。我国通过室内离体和室外抗性鉴定也发现一些品种和砧木具有抗腐烂病特性，但由于所用抗性鉴定方法不同，筛选结果有些差异。苹果资源的抗性评价应该是个综合评价体系，而抗性鉴定方法的选择是抗性评价准确与否的基础，目前的接种鉴定方法均是使用菌丝块、菌皮、菌丝液或孢子悬浮液接种烫伤、冻伤等伤口调查病斑直径的方法。但采用菌丝接种菌源过大，与田间发病源有明显的差异。最新发明的一种苹果腐烂病抗性鉴定方法，缺乏孢子获取方法，即使在普通培养基获得分生孢子器，但很难将分生孢子与孢子器分离，得到纯净的分生孢子，且离体枝条长时间放置后生理活性与田间差异较大，不足以反映树体的抗病能力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提出了一种苹果腐烂病室内抗性试验方法。该方法通过苹果腐烂病分生孢子获取、试样采集与处理、接种培养和抗病性对照步骤，解决苹果品种抗病性能试验的技术问题。

本发明解决技术问题所采用的方案是：

步骤：

（1）苹果腐烂病分生孢子获取：

利用桃枝条灭菌后制成培养基，接种苹果腐烂病病菌，在20℃～30℃温度条件下培养20～30天，待涌出分生孢子角后，挑取分生孢子角悬浮于无菌蒸馏水中，配置10⁷/mL浓度孢子悬浮液，现配现用。

（2）试样采集与处理：

利用步骤（1）孢子悬浮液接种苹果离体枝条，枝条随机采自田间植株，枝龄2～4年，直径均匀，取枝条中下部25cm枝段，用无菌水清洗，两端封蜡，树皮上打孔，直达木质部，孔内滴加1～20微升浓氨水杀伤树皮。

（3）接种培养：

将步骤（1）所配置孢子悬浮液滴加到步骤（2）的离体枝条孔内，接种后放入20℃～30℃培养箱中进行培养，培养箱内湿度控制在100%。

（4）抗病性对照：

待发病后，测量病斑纵向长度，与感病品种富士苹果枝条对照。

积极效果，本发明方法采用后，能够解决苹果腐烂病室内接种抗性鉴定的病菌纯孢子获取方法的问题和接种发病率和植物材料统一性符合田间发病规律的问题。具有操作技术简单、鉴定迅速，符合田间发病规律，能准确反映树体抗性水平的特点。适宜作为苹果抗病能力鉴定中应用。

具体实施方式

实例1：

20个苹果品种对苹果腐烂病的抗性鉴定:

1、材料与方法植物材料：

对国家苹果种质资源圃内品种进行田间调查，选取不同抗感差异的共20个品种和富士品种随机取离体枝条鉴定。

病菌材料：苹果腐烂病病菌（Valsa mali）由中国农业科学院果树研究所真菌病害组从苹果资源圃内分离保存的单孢菌株。

培养基：

PDA培养基：

配方：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 15～20g，自来水 1000mL，自然pH。配制方法是马铃薯先洗净去皮,再称取200g切成小块，加水煮沸20～30分钟，用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装后，在121℃温度条件下灭菌20分钟，冷却后贮存备用。

桃枝培养基：配方：桃树枝200g，水100mL。

配制方法：田间取桃树枝，剪成10cm左右枝段，用蒸馏水洗净后放入三角瓶中，加入100mL蒸馏水，封口后,经过121℃灭菌20分钟左右，冷却后贮存备用。

试验方法：

（1）接种前将实验室保存病菌在无菌条件下接种到桃枝培养基上，在25℃恒温培养箱中培养20天，待涌出分生孢子角后，挑取分生孢子角悬浮于无菌蒸馏水中，用血球计数板计算孢子悬浮液浓度，调节孢子悬浮液浓度为107CFU/mL备用。

（2），试验中，从资源圃选取不同抗感差异的共20个品种和富士品种，在每个品种随机取5个粗度和位置均相近的2～4年生枝条，每个枝条取中下部20～25cm枝段备用。

（3）将步骤（2）中每个枝段用无菌水清洗，两端剪口用石蜡封住，用4mm打孔器在枝段树皮上打孔，每枝段打4孔，间隔4～5cm，除去孔内外表皮，留少量韧皮部，每孔滴加20微升浓氨水杀伤树皮，待氨水风干后接种。

（4）枝段上每孔接现配的腐烂病菌孢子悬浮液20mL，后将枝段放入垫有湿纱布的搪瓷盘中，用保鲜膜覆盖搪瓷盘保湿，放入25℃培养箱中培养。

（5）接种7天后测量各孔病斑纵向扩展长度，与感病苹果品种富士对照，计算病斑相对扩展长度RLf：病斑扩展㎜长度=病斑测量长度-4RLf=各品种病斑平均长度/富士品种病斑平均扩展长度根据相对病斑扩展长度进行抗感分级：

抗病：相对扩展长度RLf<0.25；

中抗：0.25≤相对扩展长度<0.5；

感病：0.5≤相对扩展长度<0.75；

高感：相对扩展长度>0.75。

试验结果： 

表1数据表明，各品种接种腐烂病菌后全部孔穴均发病，但各品种病菌的扩展长度差异明显，其中，抗病品种只有兴山湖北海棠1个品种，病斑相对扩展长度小于0.25；四川变叶、毛山定子、小町、希特实生、苏伊斯列波等5个品种属中抗品种；锅屋等6个品种属感病品种；梅露斯等7个品种为高感品种，单个品种田间的室内鉴定结果有一定的差异；但其总体抗感性室内与田间调查结果有明显的相关性，说明此鉴定方法可区分植株的抗感性。

品种	病斑平均扩展长度（㎜）	病斑相对扩展长度（㎜）	抗感分级
				富士	20.8	1.00	高感
伏花皮	39.8	1.91	高感
				GS58	28.4	1.37	高感
克龙谢尔透明	21.2	1.02	高感
				青龙	21	1.01	高感
甜伊萨耶娃	17.9	0.86	高感
				梅露斯	17.8	0.86	高感
国玲	15.1	0.73	感病
				茶果	14.1	0.68	感病
古德伯格	13.5	0.65	感病
				丽江山定子	12.1	0.58	感病
莱芜难咽	12	0.58	感病
				Starkjambo	11.7	0.56	感病
锅屋	11.6	0.56	感病
				苏伊斯列波	9.5	0.46	中抗
希特实生	8.6	0.41	中抗
				小町	8.4	0.40	中抗
毛山定子	6.7	0.32	中抗
				四川变叶	5.7	0.27	中抗
兴山湖北海棠	3.9	0.19	抗病

 

本发明通过桃枝培养基获取纯净分生孢子，悬浮于无菌水中配制成孢子悬浮液接种，克服以往研究通过菌丝或悬浮于液体培养基中萌发的分生孢子接种，菌源量过大，与田间分生孢子直接侵染过程不符合等问题，符合病菌田间侵染规律。通过从田间直接获取枝条，保证枝条的活力与植株相近，且枝条打孔后用浓氨水杀伤，使枝条具有新鲜死组织保证发病率。且操作技术简单，发病时间短，鉴定迅速，符合田间发病规律，能准确反映树体抗性水平。

Claims (1)

1. 一种苹果腐烂病室内抗性试验方法，其特征是：

步骤：

（1）苹果腐烂病分生孢子获取：

利用桃枝条灭菌后制成培养基，接种苹果腐烂病病菌，在20℃～30℃温度条件下培养20～30天，待涌出分生孢子角后，挑取分生孢子角悬浮于无菌蒸馏水中，配置10⁷/mL浓度孢子悬浮液，现配现用；

（2）试样采集与处理：

利用步骤（1）孢子悬浮液接种苹果离体枝条，枝条随机采自田间植株，枝龄2～4年，直径均匀，取枝条中下部25cm枝段，用无菌水清洗，两端封蜡，树皮上打孔，直达木质部，孔内滴加1～20微升浓氨水杀伤树皮；

（3）接种培养：

将步骤（1）所配置孢子悬浮液滴加到步骤（2）的离体枝条孔内，接种后放入20℃～30℃培养箱中进行培养，培养箱内湿度控制在100%；

（4）抗病性对照：

待发病后，测量病斑纵向长度，与感病品种富士苹果枝条对照。