CN107828669B - 一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有果糖6‑48 g/L，蛋白胨2.75‑22 g/L，锰离子50‑400.0 g/L，叶酸0.005‑0.04 g/L，pH 5.7‑6.6。该方法通过将发酵种子液接种于上述产葡甘聚糖酶的培养基中培养，250mL的三角瓶装液量为100mL，接种量10%，于25℃，转速110 r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，具有葡甘聚糖酶产率高，活力高等优点。

Description

一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法
技术领域
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法。
背景技术
虫壳属（Torrubiella）是虫生真菌的重要成员，它主要侵染蜘蛛和介壳类昆虫使其感病来控制种群数量，这使得它能成为有效的生物防治剂。随着研究的不断推进，近年来人们发现虫壳属的代谢产物具有杀虫、抑菌等活性，这表明该菌在生物农药或医药上具有很大应用价值。
葡甘聚糖酶(glucomannanase)系一种能够将葡甘聚糖分解为葡甘低聚糖的胞外酶。葡甘低聚糖在食品、医药、生化等领域都具有重要作用。研究葡甘聚糖酶将更有益于对葡甘聚糖与葡甘低聚糖的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法。
本发明首先提供了一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，所述培养基的原料包括：果糖6-48 g/L，蛋白胨2.75-22 g/L，锰离子50-400.0 g/L，叶酸 0.005-0.04 g/L，pH 5.7-6.6。
优选的，所述培养基的原料包括：果糖48 g/L，蛋白胨11 g/L，锰离子400.0 g/L，叶酸0.02 g/L，pH6.0。
其次，本发明还提供了一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法，所述方法包含以下步骤：
（a）将一种虫壳属真菌活化后接种到种子培养基中培养，制得发酵种子液；摇床温度：25℃±1℃，种子培养周期为24h。所述种子培养基含有以下原料：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；制备方法为准确称取已削皮切块的土豆200g，加热熬汁，八层纱布过滤，向土豆汁中加入20g葡萄糖，并稀释至1000ml。
（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于所述一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，250mL的三角瓶装液量为100mL，接种量10%，于25℃，转速110r/min 下培养。培养时间为13h。
本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，具有葡甘聚糖酶产率高，活力高等特点。
附图说明
图1不同碳源对虫壳属真菌葡甘聚糖酶活性的影响；
图2不同氮源对虫壳属真菌葡甘聚糖酶活性的影响；
图3不同金属离子对虫壳属真菌葡甘聚糖酶活性的影响；
图4不同维生素对虫壳属真菌葡甘聚糖酶活性的影响；
图5不同pH对虫壳属真菌葡甘聚糖酶活性的影响。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例 1
（1）发酵种子的制备
（A）菌种和培养基
菌种：虫壳属真菌
种子培养基原料包括 ：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；制备方法为准确称取已削皮切块的土豆200g，加热熬汁，八层纱布过滤，向土豆汁中加入20g葡萄糖，并稀释至1000ml。
（B）种子液制备
将平板上的纯种虫壳属真菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有 100mL 种子培养基，然后在 25℃±1℃往复式震荡摇床转速 110 r/min 下培养培养24h后，即得发酵种子液。
（2）发酵培养
将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为 100mL，接种量为10%，于25℃，转速110r/min下培养；
发酵培养基的原料包括：果糖48 g/L，蛋白胨11 g/L，锰离子400.0 g/L，叶酸0.02g/L，pH6.0。
摇床温度为25℃ ±1℃，发酵周期为13h。
（3）葡甘聚糖酶酶活测定
吸取发酵液，在10000 r/m条件下离心10 min，上清液即为粗酶液，首先在试管内加入0.9 mL 0.4％葡甘聚糖底物，然后吸取粗酶液0.1 mL，30 ℃水浴10 min后，立即放入100 ℃水浴5 min，终止反应，接着加入2.0 mL DNS试剂，再让其在100 ℃水浴锅内显色5min，最后冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，测定OD540值，然后基于甘露糖标准曲线及酶活公式计算其酶活。酶活公式：E=C*200/0.1*10（式中C为甘露糖浓度；E为酶活）。
标准曲线的制作：取10支25 mL具塞试管，按照从1到10编号，按表1分别依次加入1mg/ml标准甘露糖溶液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，混合均匀。将各管在100℃条件下水浴5 min，然后冷却至室温，再用蒸馏水定容至20 mL，摇匀，在540 nm下测量OD值，1号管作为空白对照。以甘露糖浓度为横坐标，OD540值为纵坐标，绘制甘露糖标准曲线。经统计处理得到的线性回归方程y=0.6231x，R2为 0.9993。
按此方法测定，虫壳属真菌在基础发酵培养基：葡萄糖6.0g，蛋白胨8.0 g，NaNO33.0 g，MgSO4·7H2O 5g，KCl 5g，K2HPO4 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.01 g上产葡甘聚糖酶为90.68±0.6 U/mL。
表1 标准曲线制作表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例 2
单因素实验确定培养基最优成分
（1）种子培养基的原料包括 ：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；制备方法为准确称取已削皮切块的土豆200g，加热熬汁，八层纱布过滤，向土豆汁中加入20g葡萄糖，并稀释至1000ml。
（2）发酵种子的制作：将活化后的虫壳属真菌菌株接种至种子培养基中，25℃±1℃，转速110 r/min 下培养 24h，即得种子液。
酶液的制备：吸取发酵液，在10000 r/m条件下离心10 min，上清液即为粗酶液。酶活测定方法按实施例1中方法进行测定。
不同碳源、氮源、维生素、pH、金属离子对产葡甘聚糖酶的影响：
在基础发酵培养基的基础上，只改变其中一个条件，配置不同的培养基，将相同量的接种量（10ml）菌种接种于250mL，装有 100mL 培养液，在25℃ ±1℃，转速 110 r/min下培养培养 13h。然后按实施例 1 步骤测定酶活，结果见图1-5。
实施例 3
正交实验确定最优发酵条件
从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和 pH 值，配置不同的培养基（如表2），将相同量的接种量（10ml）菌种接种于250mL，装有 100mL 培养液，在25℃±1℃，转速 110 r/min 下培养培养 13h。然后按实施例 1 步骤测定酶活，实验结果见表3。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例 1 的方法相同。
表2 正交试验设计
Figure 356030DEST_PATH_IMAGE002
表3 正交试验结果
Figure 86219DEST_PATH_IMAGE004
注 : Ⅰ 1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和，Ⅱ 2 为各因素水平 2 的所有酶活力之和，Ⅲ 3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和，Ⅳ 4 为各因素水平 4 的所有酶活力之和，R 为极差，酶活力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean)± 标准差 (S.D)。
表 4 培养基优化验证试验
Figure DEST_PATH_IMAGE005
正交结果分析表明 ：最佳因素组合是A4B3C4D3E2，即果糖48 g/L，蛋白胨11 g/L，锰离子400.0 g/L，叶酸 0.02 g/L，pH6.0，且结果与验证试验相符合。表 3变化因子的极差值R分别为碳源 (6172.51)、氮源（785.45)、金属离子 (6486.6)、维生素 (966.47) 和 pH(866.16)，表明碳源、金属离子、维生素和 pH 的变化与虫壳属真菌产葡甘聚糖酶的培养基息息相关，尤其是金属离子的变化对该真菌产酶的影响更大。相对而言，氮源的改变对产酶的影响较小。
发酵产生结果虫壳属真菌产葡甘聚糖酶为1151.34±7.27U/mL，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好，相比基础培养基提高了12.7倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，其特征在于：培养基的原料包括：果糖6-48 g/L，蛋白胨2.75-22 g/L，锰离子50-400.0 g/L，叶酸 0.005-0.04 g/L，pH 5.7-6.6。
2.根据权利要求1所述的一种虫壳属真菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，其特征在于：培养基的原料包括：果糖48 g/L，蛋白胨11 g/L，锰离子400.0 g/L，叶酸0.02 g/L，pH6.0。
3.一种利用权利要求1或2所述的培养基生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：包含以下步骤：
（a）将虫壳属真菌活化后接到种子培养基中培养，获得发酵种子液；
（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为 100mL，接种量为10%，于25℃，转速110r/min下培养。
4.根据权利要求3所述的生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：步骤（a）所述的种子培养基含有以下原料：土豆200g/L，葡萄糖20g/L。
5.根据权利要求3所述的生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：步骤（a）所述培养条件为摇床温度：25℃±1℃，种子培养周期为24h。
6.根据权利要求3所述的生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于 ：步骤（b）中的培养时间为13h。
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