CN104611389A - 一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(sad)发酵优化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，涉及一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，具体涉及一种高产、高稳定表达的草酸青霉菌发酵工艺优化。一种草酸青霉菌生产SAD发酵优化工艺，其特征是，所述的发酵上培养基组成为(g/l)：甘露醇48.25、酵母膏14.5、玉米浆1.65、KH₂PO₄,0.81，去离子水定容，发酵条件为：装瓶量100ml(500ml三角瓶)，接种量1.5ml(1%,v/v)，初始pH6-7(未人为调节)，培养温度28℃，摇床转速180r/min，经8天发酵完成发酵过程。本发明工艺具有组成简单，经济，高稳定产生SAD的特点。SAD产量约900mg/l，具有一定应用前景。

Description

一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高产、高稳定表达的草酸青霉菌发酵工艺优化。

背景技术

Secalonic acids类化合物及其类似物广泛分布于各类真菌或地衣的次级代谢产物中,是一系列通过2-2′、2-4′或4-4′连接的双四氢化口山酮类化合物，2-2′连接主要是secalonic acids A-G类化合物),它们互为差向/对映异构体。

Secalonic acid D(SAD)是研究较多的一种真菌毒素，最早与十九世纪40十年代在造成美国西部成熟前小麦发霉的草酸青霉菌(P.oxalicum)中被分离得到，经过很多学者的努力在十九世纪60年代他的结构被完全确定。

在早期研究中SAD只被当致畸的毒剂(如对鸡胚胎的致畸作用)，后来很多学者发现SAD具有一定的抗癌作用它对各种同工酶(如蛋白激酶C和蛋白激酶A)有抑制作用，并且显示对鼠类动物具有致畸作用(如唇腭裂)。Gu等利用MTT法测定了SAD对四种肿瘤细胞P388,A549,K562和BEL7402的IC₅₀值分别为0.03,0.26,5.76,和15.50μM，并且低于产生致畸作用的最小浓度50倍以上；同时，SAD还对K562细胞周期的Go/G₁期有明显抑制作用。近年来随着药理学和分子生物学的发展，学者们对SAD细胞毒活性机制研究 也取得了很大的突破，Jian-ye Zhang等发现SAD抗癌机制可能GSK-3/-catenin/c-Myc通路有关。

据文献报道，Gliocladium sp.和Penicillium oxalicum等几个属的真菌或放线菌都能产生SAD，但产量都很低。

对该化合物的全合成随已有一定的进展，该合成路径需要经多步反应，导致该方法具有收率低、费用高等缺陷。

发明内容

为解决以上不足本发明提供一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，该工艺通过改善培养基组成与培养条件，提高SAD的产量

本研究主要应用草酸青霉菌(penicillium oxalicum中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心新(CGMCC)编号：8504)，通过大量实验试验优化草酸青霉菌培养基组成及培养条件，以期实现SAD产量的大幅提高，为SAD大规模生产提供条件。

本发明所采用的技术方案是，一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，所述发酵工艺如下：

菌种培养：配制菌种培养基(真菌四号)，接入草酸青霉菌(p.oxalicum)，获得液体发酵菌种；

配制发酵培养基：甘露醇48.25g、酵母膏14.5g、玉米浆1.65g、KH2PO4,0.81g，去离子水定容至1000ml。得到发酵培养基；

发酵：量取上述发酵培养基100ml与500ml三角瓶中，灭菌后接入菌种1ml(1％,v/v)，于28℃，摇床转速180r/min，经7天发酵完成发酵过程；

收集菌种：将发酵液经12层医用纱布过滤后得到菌体，菌体干燥后经丙酮超声破碎、提取纯化得到目标代谢产物。

1.作为优选，所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，所述的发酵工艺装瓶量为100ml/500ml，接种量是1ml(1％，v/v)，pH不进行调节，发酵时间为8d。

2.作为优选，所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，发酵培养基中最佳碳源和氮源分别为甘露醇和酵母膏。

3.作为优选，所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，发酵培养基组成为48.25g、酵母膏14.5g、玉米浆1.65g、KH₂PO₄,0.81g，去离子水定容至1000ml。

4.作为优选，所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，配制培养基溶剂为去离子水，并且不额外添加任何离子盐。

5.本发明有益效果：本发明生产工艺简便、便于推广，同时能使草酸青霉菌代谢产物中SAD含量大幅提升；所生产的SAD含量已接近丙酮超声提取物的80％，便于后续的分离纯化。本发明工艺具有高稳定的特点，便于扩大规模生产。

为使更进一步了解本发明的特征和技术内容，详见本发明附图和实施方式，然而所示附图和实施方式仅供参考与说明用，并非是对本发明加以限制。

附图说明

图1，本发明碳源类型对SAD产量影响；

图2，本发明氮源类型对SAD产量影响；

图3，本发明离子盐类型对SAD产量影响；

图4，本发明碳源-氮源组合情况对SAD产量影响；

图5，本发明培养条件(温度、pH、装瓶量、接种量)对SAD产量影响；

图6，本发明培养基各组成浓度对SAD产量影响。

具体实施方式

实例1

初始培养基(即种子培养基)组成(g/l)：甘露醇20，葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O 0.3,玉米浆1，自来水定容。

实例2

在初始发酵培养中，分别加入4％(w/v)的不糖类质代替葡萄糖和淀粉为碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、山梨醇、乳糖和甘露醇。所选定的糖类替代原始培养基中碳源成为单一碳源，培养条件：28℃，180rpm发酵8d测定发酵产物中SAD含量。

不同的单独碳源所对应的SAD产量见图1。从图中可以看出，最佳碳源为山梨醇(218.2mg/l)和甘露醇(210.7mg/l)。另外山梨醇和和甘露醇作为碳源时SAD产量相近且远超过其他碳源，所以最佳碳源需要以山梨醇和甘露醇为目标进行进一步确认。

实例3

在初始发酵培养中，分别加入1.5％(w/v)的不同有机氮源或者无机氮源代替酵母膏和蛋白胨为氮源，有机氮源包括：蛋白胨、酵母膏、牛肉膏和尿素，无机氮源包括：KNO₃、NH₄NO₃、NH₄SO₄。所选定的氮源替代原始培养基中氮源物质成为单一氮源，培养条件：28℃，180rpm发酵7d测定发酵产物中SAD含量。

不同的单独氮源所对应的SAD产量见图2。从图中可以看出：最佳有机氮源为为酵母膏(产量为268.2mg/l)；最佳无机氮源分别为为酵母膏和KNO₃(产量为238.8mg/l)，由于酵母膏和KNO₃作为氮源时产量相近且原始培养基中氮源为混合氮源，所以最佳氮源需要在酵母膏和KNO₃进行进一步确认。

实例4

在初始发酵培养中，分别加入0.5％(w/v)的不同物质代替MgSO₄为金属离子：CuSO₄,MnSO₄,ZnSO₄和FeSO₄。所选定的硫酸盐替代原始培养基中离子盐成为单一离子盐，另外以去离子水溶解培养基制成无(人为额外添加)离子试验组，盐培养条件：28℃，180rpm发酵7d测定发酵产物中SAD含量。

从图3可以看出，用蒸馏水溶解培养基(无额外添加离子盐)组，SAD产量最高(达到247.2mg/l)，这一产量比其他离子盐组高出15倍甚至更多。在以后的培养基优化中，均使用去离子水做培养基溶剂

实例5

将试验1和2中表现最佳且相近的碳源(甘露醇和山梨醇)和氮源(酵母膏和KNO₃)通过全因子实验设计进行组合。培养基中氮源和氮源的质量百分含量保持不变(分别为4％和1.5％，w/v)，当为混合碳源或者氮源时设定其比例为1:1，具体设计建表一，培养事件均为7d。

表一：最佳碳源-氮源组合情况试验设计

注：-为相应成分不加入

数字为相应物质加入含量质量百分比(w/v)

考虑到对氮源和氮源优化实验中，表现最佳且相近的两种碳源(山梨醇和甘露醇)和氮 源(酵母膏和KNO₃)之间可能存在得相互影响，本实验设计了全因子试验对最佳碳源----氮源组合进行选择。从图4得结果可以看出，甘露醇----酵母膏组合对SAD产量提高比其他组合更为明显。所以甘露醇和酵母膏被证明是提高SAD产量的最佳碳源和氮源，在以后得试验中分别采用甘露醇和酵母膏为单独碳源和氮源。

实例6

在以上试验确定得最佳培养基组成得基础上，通过单因子实验设计对可能影响SAD产量的培养条件(如：温度、装瓶量、接种量及培养基初始pH)进行优化。具体设定为温度23℃、28℃、33℃，装瓶量100ml/500ml、150ml/500ml、200ml/500ml，接种量1％、3％、5％(v/v)，初始pH3-4、5-6、7-8。培养基组成为(g/l)：甘露醇40，酵母膏15，玉米浆1，KH₂PO₄0.5，培养基用去离子水定容。

从图5数据可以得出如下结论：1、温度对SAD产量得影响并不明显。2、初始pH为6-7(未人为调节)时，更有利于SAD生产，这可能与pH变化影响草酸青霉菌生化过程或者SAD合成相关酶系统活性有关。3、较小的装瓶量(100ml)更有利于SAD生产。4、较小的接种量(1％,v/v)有利于SAD生产。基于以上结果，对培养条件的优化结果为：装瓶量100ml，接种量1.5ml(1％,v/v)，初始pH6-7(未人为调节)，培养温度28℃。

实例7

采用4因子得中心复合实验设计(CDD)在最佳培养条件下确定各培养基的最佳浓度。这四个因子为：甘露醇、酵母膏、玉米浆和KH₂PO₄。本实验中采用Mintab 15进行了4因子5水平的实验设计，共进行了31组试验，具体试验设计见表二,所有的试验均进行了三组平行试验，并以他们的SAD产量平均值作为响应值。

为确定培养基四种成分(甘露醇、酵母膏、玉米浆和KH₂PO₄)的最佳浓度，设计了一个四因素五水平的中心复合试验，该试验总共进行31次试验。试验所设计的矩阵和预测结果见表二。模型的P-值为0.000，失拟值为0.051说明试验结果适应于模型。通过计算软件得出回归方程系数，而且试验结果也适应于所得到的二阶-多项方程。SAD产量的响应值(Y)与各变量的关系可以用以下方程表示：Y＝786.99+119.93X₁-16.94X₂+35.84X₃+12.72X₄-117.10x₁ ²-79.4x₂ ²-0.68x₃ ²+2x₄ ²+76.55X₁X₂+11.64X₁X₃+15.66X₁X₄-34.25X₂X₃+10.44X₂X₄-17.24X₃X₄。

其中X₁代表甘露醇、X₂代表酵母膏；、X₃玉米浆、X₄代表KH₂PO₄

表二：CCD试验设计及SAD试验结果

对中心复合试验结果进行方差分析，结果表明这四种培养基组成中甘露醇浓度对SAD产量影响显著，而酵母膏、玉米浆和KH₂PO₄影响不明显。另外，较低的甘露--和酵母膏的交互系数(P-值为0.0002)，说明甘露--和酵母膏的交互作用对SAD产量影响明显。从回归方程的方差分析结果表明多重相关系数R²＝0.8941，说明只有10.59％试验没有被所建立模型检验。调整方差值Adj-R²＝0.8014再次确认了所建立模型的意义。

Table4.ANOVA of regression model.

^a DF,Degree of freedom；

^b Adj.SS,,sum of squares；

^c Adj.MS,mean square

通过对该模型的方程进行回归分析结果表明，SAD产量的理论最大值为839.36mg/l，相应的最佳培养基为(g/l)：甘露醇48.25、酵母膏14.5、玉米浆1.65、KH₂PO₄,0.81。

.实例8

为进一步验证培养基优化结果，用实验所确定得最佳培养方式和培养基组成进行发酵，在发酵过程中每天进行取样，对微生物生长曲线和SAD积累曲线进行再次验证。

如图6所示，在优化后的培养基组成和培养条件下测定了SAD的积累曲线和草酸青霉菌(P.oxalicum)的生长曲线。结果表明(如图6所示)：SAD的产量与细胞的生长相关，在第7天达到最大浓度(858.48mg/l)，第七和第八天基本一致，第九天开始有所下降。SAD产量在经过8天的发酵后达到904.31mg/l，这一值与预测值839.36mg/l相近。

Claims (4)

1.一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，所述发酵工艺如下：

菌种培养：配制菌种培养基(真菌四号)，接入草酸青霉菌(penicillium oxalicum中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心新(CGMCC)编号：8504)，获得液体发酵菌种；

配制发酵培养基：甘露醇48.25g、 酵母膏14.5g、玉米浆1.65g、KH₂PO₄, 0.81g，去离子水定容至1000ml；

得到发酵培养基；

发酵：量取上述发酵培养基100ml与500ml三角瓶中，灭菌后接入菌种1ml(1%,v/v)，于28℃，摇床转速180r/min，经7天发酵完成发酵过程；

收集菌种：将发酵液经12层医用纱布过滤后得到菌体，菌体干燥后经丙酮超声破碎、提取纯化得到目标代谢产物。

2.根据权利要求1所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，培养基组成为(g/l)：甘露醇48.25、 酵母膏14.5、玉米浆1.65、KH₂PO₄, 0.81，去离子水定容，发酵条件为：装瓶量100 ml(500ml三角瓶)，接种量1.5ml (1%, v/v)，初始pH6-7(未人为调节)，培养温度28℃，摇床转速180r/min，经8天发酵完成发酵过程。

3.根据权利要求1所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，所用培养基配制为甘露醇48.25g、 酵母膏14.5g、玉米浆1.65g、KH₂PO₄, 0.81g，去离子水定容至1000ml。

4.根据权利要求1所述的一种草酸青霉菌生产麦黑酮酸(SAD)发酵优化工艺，其特征是，其发酵过程特点为装瓶量100 ml(500ml三角瓶)，接种量1.5ml (1%, v/v)。