CN103740772A - 一种促进樟芝液态发酵生物合成安卓奎诺尔的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进樟芝液态生物合成安卓奎诺尔的方法，接种樟芝（Antrodiacamphorata）种子培养液于液态发酵基本培养基后，在22-34℃发酵8-20d；其中在发酵开始后的144h内向发酵培养液中加入外源前体物质或效应物，以促进樟芝在生长过程中合成活性物质Antroquinonol。本发明通过这些有效的发酵调控，可提高樟芝液态发酵安卓奎诺尔的生物合成能力；仅通过较低的附加投入，就可以提高发酵合成高附加值目标产物的浓度，方便实用，且具有重大的经济效益。

Description

一种促进樟芝液态发酵生物合成安卓奎诺尔的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及外源前体物质和效应物对樟芝液态发酵生物合成Antroquinonol的影响。

技术背景

樟芝（Antrodiacamphorata）又称为牛樟芝、牛樟菇，是台湾特有的一类十分珍稀的食药两用真菌。樟芝子实体和菌丝体中含有多糖类物质，三萜类物质，不饱和脂肪酸，泛醌类物质，马来酸与琥珀酸衍生物等70多种生理活性物质，具有广泛的药理活性。

本研究中的生理活性物质安卓奎诺尔（Antroquinonol）是2007年Lee等人利用正己烷从樟芝子实体或樟芝固体发酵粉末中萃取并鉴定一种新化合物，属于泛醌类的衍生物。2010年Chiang等人研究表明Antroquinonol可以通过活化AMPK来抑制胞内蛋白质的合成途径，进而抑制细胞周期，从而产生抗癌效果。2012年Tsai等研究发现Antroquinonol具有抗氧化应激和抗炎等活性。由于Antroquinonol具有显著的抗癌活性，并且，它对于癌细胞与正常细胞具有选择性，目前已进入FDA二期临床实验，是具有优良前景的抗癌化合物。

目前与樟芝中生理活性物质Antroquinonol相关的研究基本集中在成分、抑制癌细胞、抑制B型肝炎、护肝、自体免疫调节及抗疲劳等药理活性及药理机制，而对于其生物合成方面的研究非常欠缺，有关樟芝生物合成Antroquinonol的发酵调控及发酵水平的文献报道极为有限。唯一的报道见于公开号为CN102356728A（一种提高樟芝活性产物产量的固态培养方法）的专利，该专利公开了利用固体培养基栽培樟芝获得活性产物Antroquinonol，但由于该专利中的固态发酵培养方法过于耗时且成本较高，此外产物的发酵单位也比较低，而目前通过樟芝深层液态发酵已经成功地实现了菌丝体的快速收集，因此樟芝液态发酵生产活性产物将是一种十分有效的方法，故如何通过樟芝液态深层发酵来有效地提高Antroquinonol的产量将成为该领域的研究热点。

发明内容

樟芝发酵活性产物安卓奎诺尔（Antroquinonol），分子结构较为新颖，目前对其生物合成途径仍然没有深入研究，采用普通的液态发酵培养基成分，很难合成Antroquinonol。必须根据其分子结构的特点，通过实验不断探索培养基中的添加因子及其添加方式，才能达到提高其发酵生产水平的目的。

本发明的目的是通过在樟芝液态发酵培养基中添加前体物质或效应物来提高活性物质Antroquinonol产量的方法，重在寻找一种或几种最优的外源添加物来提高樟芝液态发酵生物合成Antroquinonol的能力，该方法操作简单，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高目标产物合成的浓度，因而具有重大的经济效益。

本发明所采取的技术方案为：

以樟芝（Antrodiacamphorata）为出发菌种，采用斜面菌种活化、种子培养基培养、液体发酵培养的流程来生产活性物质Antroquinonol，其中，在发酵的第0-144h向发酵培养液中加入外源前体物质或效应物。

本发明樟芝斜面菌种活化是将保藏的樟芝菌株转接于新鲜斜面上，置于生化培养箱内20-35℃培养4-20d。

本发明樟芝液态发酵种子培养是利用一定量的无菌水从新鲜的樟芝菌斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，镜检孢子数达到1×10⁸个/mL，以体积比5-15%接入装有100-150mL种子培养基的500mL三角瓶中，置于恒温摇床中，于20-35℃，转速50-250r/min培养1-10d，得到处于生长对数期的樟芝种子液。

本发明樟芝液态深层发酵是将种子液以体积比为5-15%的接种量接入不同容积的三角瓶或液态发酵罐中，于20-35℃，转速50-250r/min培养5-20d。

所述斜面活化培养基组成及含量为：马铃薯200g/L，葡萄糖10-50g/L，琼脂20g/L；种子培养基组成及含量为：葡萄糖10-50g/L，黄豆粉2-10g/L，玉米浆粉1-10g/L，硫酸镁0.1-10g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L。发酵培养基组成及含量为：葡萄糖10-100g/L，黄豆粉2-10g/L，玉米浆粉1-10g/L，硫酸镁0.1-10g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L。

所述的方法中，优选的外源前体物质为对羟基苯甲酸、甲羟戊酸、香叶醇、茄尼醇中的一种或几种的组合；优选的效应物为豆油、樟脑油、烟叶粉末中的一种或几种的组合。

按照本发明优选的技术方案，外源前体物质和效应物的添加时间为樟芝液态发酵的0-144h，其中外源前体物质对羟基苯甲酸、甲羟戊酸的添加量为20-600mg/L，香叶醇、茄尼醇的添加量为1-20mL；效应物豆油、樟脑油的添加量为5-100ml/L，烟叶粉末的添加量为1-20g/L。

本发明的优点在于在提供一种樟芝液态发酵生物合成Antroquinonol的培养基的基础上，通过外源前体物质或效应物来提高液态发酵Antroquinonol的产量。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详述。

实施例1

本实施例的培养基配方为：

斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

液态种子培养基：葡萄糖20g/L，黄豆粉4g/L，玉米浆粉2g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L

液态发酵基本培养基：葡萄糖30g/L，黄豆粉5g/L，玉米浆粉3g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。

将樟芝菌转接到新鲜斜面上，30℃恒温培养14d，得新鲜樟芝斜面，用一定量无菌水洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比为10%的接种量接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、130r/min恒温培养3d；再将种子液以体积比为15%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、110r/min恒温摇床培养，于发酵48h时，向发酵培养液加入终浓度为300mg/L的对羟基苯甲酸，继续培养10d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为19.6mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了200%。

实施例2

与上述实施例1的步骤不同的是：发酵48h时，向发酵培养液中加入终浓度为10ml/L的茄尼醇，继续培养10d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为18.1mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了190%。

实施例3

与上述实施例1的步骤不同的是：发酵48h时，向发酵培养液中加入终浓度为200mg/L的对羟基苯甲酸和6ml/L的香叶醇的组合，继续培养10d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为27.6mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了330%。

实施例4

与上述实施例1的步骤不同的是：发酵48h时，向发酵培养液中加入终浓度为100mg/L的甲羟戊酸和6ml/L茄尼醇的组合，继续培养10d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为26.4mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了290%。

实施例5

与上述实施例1的步骤不同的是：发酵96h时，向发酵培养液中加入终浓度为20ml/L的樟脑油，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为15.7mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了150%。

实施例6

与上述实施例1的步骤不同的是：发酵96h时，向发酵培养液中加入终浓度为10g/L的烟叶粉末，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为17.6mg/L，比未加前体物质的空白对照组提高了190%。

实施例7

与上述实施例3的步骤不同的是：在发酵96h时，再加入终浓度为20ml/L的樟脑油，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为35.4mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了450%。

实施例8

与上述实施例3的步骤不同的是：在发酵96h时，再加入终浓度为10g/L的烟叶粉末，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为36.5mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了460%。

实施例9

与上述实施例4的步骤不同的是：在发酵96h时，再加入终浓度为20ml/L的樟脑油，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为37.1mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了480%。

实施例10

与上述实施例4的步骤不同的是：在发酵96h时，再加入终浓度为10g/L的烟叶，继续培养8d结束发酵，活性产物Antroquinonol的产量为27.9mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了340%。

实施例11

与上述实施例7的步骤及添加物相同，所不同的是：所用液态发酵水平为发酵罐水平，活性产物Antroquinonol的产量为50.9mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了600%。

实施例12

与上述实施例8的步骤及添加物相同，所不同的是：所用液态发酵水平为发酵罐水平，活性产物Antroquinonol的产量为48.7mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了580%。

实施例13

与上述实施例9的步骤及添加物相同，所不同的是：所用液态发酵水平为发酵罐水平，活性产物Antroquinonol的产量为53.6mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了650%。

实施例14

与上述实施例10的步骤及添加物相同，所不同的是：所用液态发酵水平为发酵罐水平，活性产物Antroquinonol的产量为52.8mg/L，比未加前体物质和效应物的空白对照组提高了630%。

由实施例1到14可知在发酵过程中，通过改变发酵培养基的组成或者外源加入前体物质及效应物，可以促进樟芝在生长过程中合成活性物质Antroquinonol，从而大大提高樟芝液态发酵Antroquinonol的产量，尤其是在前体物质和效应物复合添加的情况下效果更佳显著，具有良好的应用价值。

Claims (10)

1.一种促进樟芝液态发酵生物合成安卓奎诺尔的方法，其特征在于：接种樟芝（Antrodiacamphorata）种子培养液于液态发酵基本培养基后，在22-34℃发酵8-20d；其中在发酵开始后的144h内向发酵培养液中加入外源前体物质或效应物，以促进樟芝在生长过程中合成活性物质Antroquinonol，从而大大提高樟芝液态发酵Antroquinonol的产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外源前体物质为甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、辅酶Q系列、对羟基苯甲酸、丙酸、甲羟戊酸、α-亚麻酸、丁羟甲苯、香叶醇、茄尼醇、异戊烯醇中的一种或几种的组合；外源效应物为半胱氨酸、维生素B₂、肌醇、烟叶粉末、胡萝卜汁、西红柿汁、豆油、樟脑油、香樟树叶粉、香樟果粉、香樟树干粉中的一种或几种的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述外源前体物质或效应物甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、辅酶Q系列、对羟基苯甲酸、甲羟戊酸、α-亚麻酸、丁羟甲苯的添加量为20-600mg/L，丙酸、香叶醇、茄尼醇、异戊烯醇、肌醇的添加量为1-20ml/L；胡萝卜汁、西红柿汁、豆油、樟脑油的添加量为5-100ml/L，烟叶粉末、香樟树叶粉、香樟果粉、香樟树干粉的添加量为1-20g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基包括：葡萄糖10-100g/L，黄豆粉2-10g/L，玉米浆粉1-10g/L，硫酸镁0.1-10g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于前体物质优选对羟基苯甲酸、甲羟戊酸、香叶醇、茄尼醇中的一种或几种的组合；效应物优选豆油、樟脑油、烟叶粉末中的一种或几种的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于发酵48h时，向发酵培养液加入终浓度为300mg/L的对羟基苯甲酸。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于发酵48h时，添加终浓度为200mg/L的对羟基苯甲酸和6ml/L的香叶醇的组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于发酵96h时，继续添加终浓度为20ml/L的樟脑油或10g/L的烟叶粉末。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于发酵48h时，添加终浓度为100mg/L的甲羟戊酸和6ml/L茄尼醇的组合。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于发酵96h时，继续添加终浓度为20ml/L的樟脑油或10g/L的烟叶粉末。