CN106701841B - 一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过在一定的培养时间下往培养基中添加大豆卵磷脂或者还添加烟叶与甲羟戊酸，有效地提高了樟芝樟芝液态发酵产安卓奎诺尔的产量。

Description

一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法
技术领域
本发明涉及一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
樟芝(Antrodiacamphorata)又称为牛樟芝、牛樟菇，是台湾特有的一类十分珍稀的食药两用真菌。樟芝子实体和菌丝体中含有多糖类物质，三萜类物质，不饱和脂肪酸，泛醌类物质，马来酸与琥珀酸衍生物等70多种生理活性物质，具有广泛的药理活性。
生理活性物质安卓奎诺尔(Antroquinonol)是2007年Lee等人利用正己烷从樟芝子实体或樟芝固体发酵粉末中萃取并鉴定一种新化合物，属于泛醌类的衍生物。2010年Chiang等人研究表明Antroquinonol可以通过活化AMPK来抑制胞内蛋白质的合成途径，进而抑制细胞周期，从而产生抗癌效果。2012年Tsai等研究发现Antroquinonol具有抗氧化应激和抗炎等活性。由于Antroquinonol具有显著的抗癌活性，并且，它对于癌细胞与正常细胞具有选择性，目前已进入FDA二期临床实验，是具有优良前景的抗癌化合物。
目前与樟芝中生理活性物质Antroquinonol相关的研究基本集中在成分、抑制癌细胞、抑制B型肝炎、护肝、自体免疫调节及抗疲劳等药理活性及药理机制，而对于其生物合成方面的研究非常欠缺，有关樟芝生物合成Antroquinonol的发酵调控及发酵水平的文献报道极为有限。公开号为CN102356728A(一种提高樟芝活性产物产量的固态培养方法)的专利，该专利公开了利用固体培养基栽培樟芝获得活性产物Antroquinonol，但由于该专利中的固态发酵培养方法过于耗时且成本较高，此外产物的发酵单位也比较低。也有研究通过樟芝深层液态发酵已经成功地实现了菌丝体的快速收集，樟芝液态发酵生产活性产物是一种十分有效的方法，故如何通过樟芝液态深层发酵来有效地提高Antroquinonol的产量将成为该领域的研究热点。
樟芝发酵活性产物安卓奎诺尔，分子结构较为新颖，目前对其生物合成途径仍然没有深入研究，采用普通的液态发酵培养基成分，很难合成Antroquinonol。已有报道根据其分子结构的特点，通过实验不断探索培养基中的添加因子及其添加方式，研究了外源前体物质和效应物对樟芝液态发酵生物合成Antroquinonol的影响。有必要开发更多的通过廉价添加物提高发酵生产水平
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法，通过在一定的培养时间下往培养基中添加大豆卵磷脂或者还添加烟叶与甲羟戊酸，有效地提高了樟芝樟芝液态发酵产安卓奎诺尔的产量。
在一种实施方式中，所述方法是接种樟芝(Antrodia camphorata)种子培养液于液态发酵基本培养基后，在22-34℃发酵6-8d；其中在发酵14-18h时向发酵培养液中加入终浓度为 1～5g/L的大豆卵磷脂。
在一种实施方式中，所述方法还包括在发酵32～36h时向发酵培养液中加入终浓度为5～8g/L的烟叶，在发酵50～54h时向发酵培养液中加入终浓度为40～60mg/L的甲羟戊酸。
在一种实施方式中，所述液态发酵基本培养基组成：葡萄糖10-100g/L，黄豆粉2-10g/L，玉米浆粉1-10g/L，硫酸镁0.1-10g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L。
在一种实施方式中，所述樟芝种子培养液的制备方法：利用一定量的无菌水从新鲜的樟芝菌斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比5-15％接入装有种子培养基中，于20-35℃，转速50-250r/min培养1-10d，得到处于生长对数期的樟芝种子液。
在一种实施方式中，所述发酵是采用摇瓶发酵，转速50-250r/min。
本发明还要求保护按照上述方法发酵生产得到的安卓奎诺尔及其在医药等领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种新的促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法，方法简便、易控，发酵时间短。
具体实施方式
实施例1
本实施例的培养基配方为：
斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
液态种子培养基：葡萄糖20g/L，黄豆粉4g/L，玉米浆粉2g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L
液态发酵基本培养基：葡萄糖30g/L，黄豆粉5g/L，玉米浆粉3g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。
将樟芝菌转接到新鲜斜面上，30℃恒温培养14d，得新鲜樟芝斜面，用一定量无菌水洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比为10％的接种量接入装有100mL种子培养基的500mL 三角瓶中，30℃、130r/min恒温培养3d；再将种子液以体积比为15％的接种量接入装有100 mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、110r/min恒温摇床发酵培养。发酵培养的时间为8d。
实验组分别进行如下处理：
A组：直接摇床发酵培养8d，发酵结束后活性产物Antroquinonol的产量为6mg/L。
B组：在发酵16h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂。
C组：在发酵48h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂。
D组：在发酵96h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂。
E组：在发酵16h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂，在发酵34h时向发酵培养液中加入终浓度为5g/L的烟叶，在发酵54h时向发酵培养液中加入终浓度为50mg/L 的甲羟戊酸。
F组：发酵96h时，向发酵培养液中加入终浓度为10g/L的烟叶粉末。
G组：在发酵16h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂，在发酵34h时向发酵培养液中加入终浓度为50mg/L的甲羟戊酸，在发酵54h时向发酵培养液中加入终浓度为5g/L的烟叶。
H组：在发酵34h时向发酵培养液中加入终浓度为5g/L的烟叶，在发酵54h时向发酵培养液中加入终浓度为50mg/L的甲羟戊酸。
I组：在发酵16h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂，在发酵34h时向发酵培养液中加入终浓度为100mg/L的甲羟戊酸和6ml/L茄尼醇，在发酵54h时向发酵培养液中加入终浓度为5g/L的烟叶。
表1不同培养基成分对发酵生产安卓奎诺尔的影响
产量(mg/L) 相对于A组的提高比例
A组 6 -
B组 24 300％
C组 9.1 51.7％
D组 8.7 45％
E组 48 700％
F组 17.4 190％
G组 28 366.7％
H组 17.2 186.7％
I组 27 350％
结果显示，大豆卵磷脂的添加时机对安卓奎诺尔产量影响较大，而且添加时机合适能够显著提高安卓奎诺尔产量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种促进生物发酵合成安卓奎诺尔的方法，其特征在于，所述方法是接种樟芝种子培养液于液态发酵基本培养基后，在22-34℃发酵6-8d；其中在发酵16h时向发酵培养液中加入终浓度为3g/L的大豆卵磷脂，在发酵34h时，向发酵培养液中加入终浓度为5g/L的烟叶，在发酵54h时向发酵培养液中加入终浓度为50mg/L的甲羟戊酸；所述液态发酵基本培养基组成：葡萄糖10-100g/L，黄豆粉2-10g/L，玉米浆粉1-10g/L，硫酸镁0.1-10g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L；所述发酵是采用摇瓶发酵，转速50-250r/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述樟芝种子培养液的制备方法：利用一定量的无菌水从新鲜的樟芝菌斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比5-15％接入装有种子培养基中，于20-35℃，转速50-250r/min培养1-10d，得到处于生长对数期的樟芝种子液。
3.权利要求1或2所述方法在制备药物安卓奎诺尔方面的应用。
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