CN103444430B - 牛樟芝的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种牛樟芝的培养方法，所述培养方法包括：培养基配制步骤，将重量百分比为0.1～50％的葡萄糖、1～5％的蛋白胨、0.1～50％的大麦萃取物、0.1～50％的酵母萃取物及0.5～10％的固化剂，以水配制成柱体培养基，该柱体培养基的深度为2～20公分；接种步骤，在所述柱体培养基的内部设置有多个预定接种位，该多个预定接种位距离所述柱体培养基的外表面0.5～10公分深处，将牛樟芝接种于各个预定接种位上；以及培养步骤，将所述柱体培养基于温度23～28℃下培养至少三个月，获得牛樟菌体。本发明的牛樟芝的培养方法不仅能够提高单位培养基的牛樟芝菌丝体或子实体的生长量，而且能够降低杂菌污染的情形，减少生产损失。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝的培养方法，特别涉及一种能够使牛樟芝产生三萜类化合物的牛樟芝培养方法。
背景技术
牛樟芝(Taiwanofungus camphorates)，又名牛樟菇或樟芝，属于真菌界中的担子菌门(Basidiomycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、同担子菌纲(Homobasidiomycetes)、无折菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)，牛樟芝只生长在台湾的保育树种牛樟木上，为台湾特有菇类。
从牛樟芝的菌丝体或子实体抽出物中，发现多种生理活性物质，例如多醣体、腺苷或多种三萜类化合物，其中，在这些三萜类化合物中，如胺蕈A(Antcin A)、胺蕈B(Antcin B)、胺蕈C(Antcin C)、胺蕈E(Antcin E)、胺蕈F(Antcin F)、甲基胺蕈酯G(MethylantcinateG)、甲基胺蕈酯H(Methylantcinate H)、胺卓蕈(Antrocin)、4，7-双甲氧基-5-甲基-1，3双氧苯(4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole)及2，2’，5，5’-四甲氧基-3，4，3’，4’-双甲基-内双氧-6，6’-联苯(2，2’，5，5’-tetramethoxy-3，4，3’，4’-bimethyl-enedioxy-6，6’-dimethylbiphenyl)等，经研究证实具有抗癌细胞生长的能力。
然而，由于牛樟芝是生长于牛樟木上的真菌，产量稀少且不易取得，因此本领域是通过人工培育牛樟芝的方式，获得牛樟芝菌丝体或子实体，进一步萃取该牛樟芝菌丝体或子实体内的生理活性物质(如三萜类化合物或多醣体)。
现有技术的牛樟芝培养方法包括：固态培养法、液态发酵法、椴木栽培法或太空包栽培法，然而，上述现有技术却各有缺点。
现有技术的固态培养法，是挖取一块约1公分见方的牛樟芝菌丝体或子实体，并将其贴附于固态培养基的表面，使该牛樟芝能够贴附于该固态培养基的表面生长，虽然现有技术的固态培养法可以获得牛樟芝的菌丝体或子实体，且较不易产生杂菌，然而，以现有技术的固态培养法所获得的菌丝体或子实体中却仅含有极低量的三萜类化合物，因此现有技术的固态培养法所获得的牛樟芝菌丝体或子实体，无法应用于萃取其生理活性物质从而不在产业上使用。
现有技术的液态发酵法，是将牛樟芝的菌丝体接种于液态培养液中，该液态培养液虽然能够提高牛樟芝内所含有的生理活性物质，然而培养过程中需加入如蔗渣或五谷杂粮等固体基质作为牛樟芝菌丝体的支撑物，因此，液态发酵法必须以大体积的反应器培养，其制备成本高，且液态发酵法也容易发生杂菌污染的情形。
现有技术的椴木栽培法，是将牛樟芝接种在牛樟椴木上，其所获得的牛樟芝成分与野生牛樟芝所含的生理活性物质的种类相近，但由于牛樟椴木取得不易，并且培育成本较高，因此无法大量生产制备三萜类化合物。
现有技术的太空包栽培法，虽然整体成本较低，但其培育过程中容易受到杂菌污染，且生理活性物质含量较低，因此，也无法大量生产制备三萜类化合物。
上述方法虽然都能够获得含有三萜类化合物的牛樟芝菌丝体或子实体，但是其培养操作不易，容易产生杂菌，使得整批次培养的牛樟芝受到污染而造成生产上的重大损失，且现有技术的牛樟芝培养方法所生产制备的牛樟芝菌丝体或子实体的质量不高，其所含的三萜类化合物仍不足。
因此，现有技术的牛樟芝培养方法仍存在有不足之处，有待于进一步改良。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种改进的牛樟芝的培养方法，以克服现有技术中的缺陷。
本发明的主要目的是提供一种牛樟芝的培养方法，所述培养方法包括：(1)培养基配制步骤，所述培养基配制步骤包括将重量百分比为0.1～50％的葡萄糖、1～5％的蛋白胨、0.1～50％的大麦萃取物、0.1～50％的酵母萃取物以及0.5～10％的固化剂，用水配制成混合溶液，将所述混合溶液煮沸，使其完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱体培养基，所述柱体培养基的深度为2～20公分；(2)接种步骤，所述接种步骤包括在所述柱体培养基的内部设置有多个预定接种位，所述多个预定接种位距离所述柱体培养基的外表面有0.5～10公分深，将牛樟芝接种于所述各个预定接种位上；以及(3)培养步骤，所述培养步骤包括将接种完成的柱体培养基在温度23～28℃环境下培养至少三个月，获得牛樟菌体。
优选地，在所述培养步骤后，还包括干燥步骤，所述干燥步骤包括将长有牛樟菌体的柱体培养基，在30～40℃下烘干至含水量低于2％，获得牛樟干燥菌块。
优选地，所述各个预定接种位之间相距0.5～2公分。
优选地，所述柱体培养基为多面柱体或圆柱体。
优选地，所述固化剂为琼脂。
优选地，所述培养步骤的培养时间为4～12个月。
优选地，所述干燥步骤的干燥时间为24～72小时。
通过本发明的培养方法，不仅能够提高单位培养基的牛樟芝菌丝体或子实体的生长量，而且能够降低杂菌污染的情形，大大改进了现有技术中生产制备的牛樟芝菌丝体或子实体的质量不高，所含的三萜类化合物仍不足的缺点，并简化了培养程序，避免了生产上的损失。
附图说明
图1是本发明牛樟芝培养方法的步骤方块图(一)；
图2a是本实施例的柱体培养基的立体外观图-四面柱体；
图2b是本实施例的柱体培养基的立体外观图-六面柱体；
图2c是本实施例的柱体培养基的立体外观图-八面柱体；
图2d是本实施例的柱体培养基的立体外观图-十二面柱体；
图2e是本实施例的柱体培养基的立体外观图-圆柱体；
图3是本发明牛樟芝培养方法的步骤方块图(二)；
图4是本实施例的UPLC-MS/MS层析图([m/z]+)；
图5是本实施例的UPLC-MS/MS层析图([m/z]-)。
附图标记说明如下：
培养基配制步骤S1、接种步骤S2、培养步骤S3、干燥步骤S4、柱体培养基1、底面11、顶面12、侧表面13、间距D、预定接种位P、斜线部分S。
具体实施方式
为使审查员能进一步了解本发明的结构、特征及其他目的，现结合所附较佳实施例附以附图详细说明如下，本附图所说明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
如图1所示，图1是本发明的牛樟芝培养方法的步骤方块图，包括培养基配制步骤S1、接种步骤S2及培养步骤S3。
该培养基配制步骤S1，将重量百分比为0.1～50％的葡萄糖(Glucose)、1～5％的蛋白胨(Peptone)、0.1～50％的大麦萃取物(Maltextract)、0.1～50％的酵母萃取物(Yeast extract)及0.5～10％的固化剂，用水配制成混合溶液，将该混合溶液煮沸，使上述成分完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱体培养基，所述柱体培养基的深度为2～20公分。
具体地说，本发明的混合溶液中，葡萄糖提供牛樟芝生长所需的碳源，蛋白胨、大麦萃取物及酵母萃取物提供牛樟芝生长所需的氮源及其他微量元素，所述混合溶液能够依本领域人员的所常规技术，额外添加其他有助于牛樟芝生长的成分，如微量元素或维生素；其中，所述固化剂可以选择琼脂(Agar)，混合溶液含有0.5～10％的琼脂，以提供牛樟芝菌丝生长时所需的支持，又能够避免琼脂的密度过高而阻碍牛樟芝菌丝的生长。
本发明柱体培养基可以选择多面柱体或圆柱体，其中，本发明所指的所述柱体培养基的深度，不限定为该柱体培养基的柱高及柱宽，即该柱高与该柱宽是介于2至20公分，以提供足够的深度供牛樟芝在所述柱体培养基的内部生长，又不会因柱体培养基的厚度过大而不易进行该接种步骤S2的操作。
如图2a至2e所示，该柱体培养基1为多面柱体，所述多面柱体包括底面11、顶面12及至少一个侧表面13，该底面11是贴附于一个培养盘上，该顶面12及该侧表面13提供用以接种牛樟芝的表面，其中，该侧表面13可以为平面或曲面，若该侧表面13为平面，该侧表面13的个数较佳优选3至12个，如图2a至图2e所示的四面柱体、六面柱体、八面柱体或十二面柱体，或者该所述柱体的侧表面13的个数超过12个，所述该柱体则接近为圆柱体，故该侧表面13接近为曲面。
该接种步骤S2，在所述柱体培养基的内部设有多个预定接种位，所述多个预定接种位距离该柱体培养基的外表面0.5～10公分深处，将牛樟芝接种于各个预定接种位上。具体地说，所述牛樟芝不限定为既有的牛樟菌株，如Taiwanofungus camphorates KP01(GenBankaccession number：JQ945230)或台湾新竹食品科学工业发展研究所的牛樟菌株(BCRC 35396、BCRC 35398、BCRC 35716、BCRC 36401、BCRC 36711、BCRC 36795、BCRC 37848、BCRC 37849或BCRC37850)。本发明通过将该牛樟芝的菌丝于三维空间中且多次地接种在所述柱体培养基内部，使所述牛樟芝受到所述柱体培养基的全面性的包覆，并提高柱体培养基的营养成分及空间利用率，增加牛樟芝于单位培养基中的菌丝量，进而提高牛樟芝产生生理活性物质(如三萜类化合物)的含量；本发明也可在所述柱体培养基的外表面进行接种，以充分利用柱体培养基。
举例说明，如图2a所示，本实施例的柱体培养基1的外表面包括有底面11、顶面12及四个侧表面13，以该顶面12为基准，朝向该底面11延伸至至少0.5公分以深处，其余五个面以此类推，其所圈围的范围为该预定接种位P的许可范围，即如图所示的斜线部份S；本实施例的四面柱体的柱高选择为6公分，该底面11及顶面12为正四边形，该四边形的边长选择为3公分(即该四个侧表面13边长为3公分及6公分)。
如图2e所示，本实施例的柱体培养基1的外表面包括有底面11、顶面12及一个侧表面13，以该顶面12为基准，朝向该底面11延伸至至少0.5公分以深处，该顶面12及该侧表面13以此类推，其所圈围的范围为该预定接种位P的许可范围，即如图所示的斜线部份S；该圆柱体的柱高为6公分，该圆柱体的底面11及顶面12为圆形，该圆形的直径为6公分。
以接种环(或接种针)沾取牛樟芝菌丝体(Taiwanofunguscamphorates KP01)后，将沾取有牛樟芝菌丝体的接种环深入该柱体培养基1的斜线区块中，且各预定接种位之间设有一个间距D，该间距D优选是0.5～2公分，以避免各个接种的牛樟芝菌丝距离过近，而互相抑制生长。
通过各个预定接种位的间距D为0.5～2公分的距离，确保各个预定接种位上的牛樟芝菌丝体能够充分利用周围的营养，有利于牛樟芝菌丝的生长，又能够避免各预定接种位上的牛樟芝菌丝体因接种过于密集而抑制其生长效率。
该培养步骤S3，将接种完成的柱体培养基于温度23～28℃的环境下培养至少三个月，获得一个牛樟菌体。具体地说，本实施例的牛樟芝是培养至少3个月以上，优选培养至4～12个月后，即可获得含有生理活性物质的牛樟菌体，特别是含有较高含量的三萜类化合物。
如图3所示，本发明的牛樟芝的培养方法优选是在该培养步骤S3后，再进行干燥步骤S4，该干燥步骤将长有牛樟菌体的柱体培养基，于30～40℃下烘干至含水量低于2％，获得牛樟干燥菌块。由于所述牛樟干燥菌块去除了大部分的水分，因此易于保存或进行后续生理活性物质的萃取操作。
为证实本发明牛樟芝的培养方法所获得的牛樟菌体，确实能够产生如三萜类化合物的生理活性物质，以下是本发明的较佳实施例及其三萜类化合物的定性结果。
如表1所示，表1是本实施例混合溶液的成分及重量百分比，将所述混合溶液煮沸后，待混合溶液冷却凝固之前时，倒入四面柱体的模具中，并于室温静置至该混合溶液凝固，获得如图2a所示的四面柱体培养基，将所述柱体培养基倾倒出来，置于培养盘上；本实施例的操作优选在无菌操作台内进行，以避免其他微生物污染所述柱体培养基而影响后续牛樟芝的培养。
表1：本实施例的混合溶液的配方
如图2a所示的预定接种位设置示意图，分别于各个该预定接种位P进行多次接种后，于25℃的培养箱中进行培养，并于第4个月获得牛樟菌体，将所述牛樟菌体于40℃烘箱中干燥72小时后，获得牛樟干燥菌块，并将所述牛樟干燥菌块进行萃取后，以超高压液相层析双质谱仪(UPLC-MS/MS)分析萃取液中的三萜类化合物中的代表性物质-胺蕈A。
本实施例的胺蕈A萃取液是经由下列方式获得：将所述牛樟干燥菌块(100克)，浸泡于90％的乙醇(500毫升)，静置24小时后，利用真空浓缩机浓缩成萃取物粉末后，再以95％乙醇定量至10微升(μL)，即获得该胺蕈A萃取液。
本实施例UPLC-MS/MS的检测条件如下：流动相(A-水、B-乙腈)、流速0.4mL/min、进样体积4μL、柱温35℃。双质谱仪LCMS-8030、离子源ESI(+)/ESI(-)(正负离子同时扫描)、离子源介面电压4.5kV/-3.5kV、雾化气-氮气3.0L/min、干燥气-氮气15L/min、碰撞气-氩气230kPa、脱溶剂管温度250℃、加热模组温度400℃、扫描范围Q3scan，m/z 200-800。
如图4和图5所示，图4、图5是本实施例以UPLC-MS/MS检测的层析图，其中，该胺蕈A的[m/z]+为455.3(如图4所示)，[m/z]-为453.3(如图5所示)，其流滞时间(Retention time)分别为13.129分钟及13.204分钟，由此可知，本实施例确实能够生产含有三萜类化合物的牛樟芝菌丝体或子实体，特别是生产出含有胺蕈A的牛樟芝菌丝体或子实体。
因此，本发明牛樟芝的培养方法通过增加牛樟芝菌丝接种于柱体培养基的次数，且将牛樟芝菌丝接种至所述柱体培养基的内部，使牛樟芝能够受到培养基的全面性包覆；同时，相对于好氧条件的培养基表面，本发明是将牛樟芝菌丝接种在相对厌氧的培养基内部位置，通过提供牛樟菌相对厌氧的生长环境，而促进牛樟芝改变其生理条件而生产出三萜类化合物，又能够通过牛樟芝自己所产出的抗生素物质，而抑制杂菌的生长。
进而，本发明的牛樟芝的培养方法能够提高单位培养基中牛樟芝菌丝体或子实体的生长量，达到提高单位培养基中的生理活性物质-如三萜类化合物的含量的功效。
本发明的牛樟芝的培养方法通过提高牛樟芝菌丝体的接种次数，并密集地分布于所接种的培养基内部，因而抑制杂菌的生长，具有避免因杂菌污染而造成损失的功效。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种牛樟芝的培养方法，所述培养方法包括：
培养基配制步骤，所述培养基配制步骤包括将重量百分比为0.1～50％的葡萄糖、1～5％的蛋白胨、0.1～50％的大麦萃取物、0.1～50％的酵母萃取物以及0.5～10％的固化剂，用水配制成混合溶液，将所述混合溶液煮沸，使其完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱体培养基，所述柱体培养基的深度为2～20公分；
接种步骤，所述接种步骤包括在所述柱体培养基的内部设置有多个预定接种位，所述多个预定接种位距离所述柱体培养基的外表面有0.5～10公分深，将牛樟芝接种于所述各个预定接种位上；以及
培养步骤，所述培养步骤包括将接种完成的柱体培养基在温度23～28℃环境下培养至少三个月，获得牛樟菌体。
2.如权利要求1所述的牛樟芝的培养方法，其中，在所述培养步骤后，还包括干燥步骤，所述干燥步骤包括将长有牛樟菌体的柱体培养基，在30～40℃下烘干至含水量低于2％，获得牛樟干燥菌块。
3.如权利要求1或2所述的牛樟芝的培养方法，其中，所述各个预定接种位之间相距0.5～2公分。
4.如权利要求3所述的牛樟芝的培养方法，其中，所述柱体培养基为多面柱体或圆柱体。
5.如权利要求1或2所述的牛樟芝的培养方法，其中，所述固化剂为琼脂。
6.如权利要求1或2所述的牛樟芝的培养方法，其中，所述培养步骤的培养时间为4～12个月。
7.如权利要求2所述的牛樟芝的培养方法，其中，所述干燥步骤的干燥时间为24～72小时。
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