CN101151957A

CN101151957A - 樟芝的培养方法及其应用

Info

Publication number: CN101151957A
Application number: CNA2006101413859A
Authority: CN
Inventors: 黄三保; 王玉龙; 刘胜勇
Original assignee: GUODING BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUODING BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2008-04-02

Abstract

本发明提供一种樟芝的培养方法，首先在一斜面培养基上预培养樟芝，取出一部分预培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中。之后，将在液态培养基中培养出的樟芝接种至一固态培养基上进行培养。上述的方法所培养出的樟芝具与野生樟芝类似的功效，包含抑制人类癌细胞生长活性及癌症辅助治疗的功效；还具有抑制人类低密度脂蛋白氧化的能力，以降低动脉粥状硬化的发生率，并可回复受损的肝脏功能。

Description

樟芝的培养方法及其应用

技术领域

本发明有关于樟芝的培养方法及其应用，特别是有关于一种包含有固态培养步骤的樟芝培养方法以及以所述的方法所培养出的樟芝的应用。

背景技术

樟芝又称牛樟芝或牛樟菇，属于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类，学名为Antrodia camphorata，其是中国台湾特有的一种真菌，仅生长于中国台湾特有的牛樟树。樟芝是独特且珍贵的药用真菌，也是目前中国台湾最昂贵的野生真菌。樟芝的第一次新种发表是在1990年。到了1995年有第二次的新种发表，其命名为Antrodia cinnamomea。到了1997年有了第三次的新种发表，而将樟芝重新命名为Antrodia camphorata。

已经有研究显示，樟芝子实体的抽提物中含有三种三帖类化合物，其分别是胺蕈A(antcin A)、胺蕈B(antcin B)以及胺蕈C(antcin C)。之后，又有研究报告指出，从子实体的抽提物中还发现了三种新的三帖类化合物，其分别是胺卓蕈(antrocin)、4，7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯并间二氧杂环戊烯(4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole)、2，2’，5，5’-四甲氧基-3，4，3’，4’ -二甲基-内双氧-6，6’-二甲基联苯(2，2’，5，5’-tetramethoxy-3，4，3’，4’-bimethyl-enedioxy-6，6’-dimethylbiphenyl)。到了1996年，又有研究显示另外四种新的三帖类化合物，其分别是胺蕈E(antcin E)、胺蕈F(antcin F)、甲基胺蕈酯G(methylantcinate G)、甲基胺蕈酯H(methylantcinate H)。在1996，另外又从子实体的抽提物中发现了两种以麦角甾烷(ergostane)为骨架的新化合物，其分别是笕菇酸D(zhankuic acid D)与笕菇酸E(zhankuic acidE)；以及三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物，其分别是15α-乙酰基-去氢亚硫酸(15α-acetyl-dehydro-sulphurenic acid)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)、去氢硫磺菌酸(dehydro-sulphurenic acid)。

由以上可知，樟芝成分非常复杂，其除了三帖类化合物，还含有很多生理活性物质，例如多糖体、超氧歧化酶(SOD)、腺苷、小分子蛋白质、维生素、微量元素、核酸、固醇类、血压稳定物质等。从先前的研究结果得知，樟芝含有独特的三帖类化合物，而这些化合物的抗癌细胞生长能力、活化神经细胞生长能力等生理活性机制仍待理清。

由于野生樟芝的生长环境均属于幽暗、潮湿且温度稍低的中海拔地区，且生长缓慢(生长期为6-10月)，因此要产生子实体的时间相当长。牛樟树及野生樟芝为保育类植物，目前人工培养的技术仍无法大量的栽培成功，且樟芝盗采情形严重，有濒临灭种的危机。

在US 6,588,942 B1，Li等人揭示以固态培养基培养冬虫夏草。在US2003/0138408 A1，Lan等人揭示用太空包培养樟芝的方法。在US 6,391,615B1，US 6,395,271 B1，与US 6,355,475 B1，Huang等人揭示从培养基分离樟芝(Antrodia Camphorata)的方法。在US 2003/0086908 A1，Wu等人揭示运用刺激与酸碱值(pH)找出培养樟芝(Antrodia Camphorata)的较佳条件。在US 2003/0148517 A1，Chen等人揭示对樟芝(Antrodia Camphorata)的生理活性测试；在US 2003/0113297 A1，Chen等人揭示樟芝(AntrodiaCamphorata)对肝癌的生理活性测试。

在J.Agric.Food Chem.杂志，Song等人发表运用樟芝测试肝癌的步骤方法(T-Y Song and G-C Yen，Protective Effects of Fermented Filtratefrom Antrodia Camphorata in submerged Culture against CCl4-inducedHepatic Toxicity in Rats，J.Agric.Food Chem.，2003，51，1571-1577)；也发表运用樟芝做抗氧化测试的步骤方法(T-Y Song and G-C Yen，Antioxidant Properties of Antrodia Camphorata in Submerged Culture，J.Agric.Food Chem.，2002，50，3322-3327)。在“保健食品研究期间开发计画期末成果报告”中国医院学院营养系的杨新玲教授发表“樟芝对血管内皮细胞的影响及保护心血管作用机制的探讨”。

发明内容

因此，本发明的目的就是提供一种培养樟芝的方法，利用人工培养方式取代摘取野生樟芝，且所述的培养方法可以大量的培养出具有与野生樟芝类似功效的樟芝菌丝体。

本发明的另一目的是提供一种食品组成物，其含有以本发明的培养方法所培养出的樟芝。

本发明的另一目的是提供一种药物组成物，其含有以本发明的培养方法所培养出的樟芝。

本发明的另一目的是提供一种美容产品，其含有以本发明的培养方法所培养出的樟芝。

本发明的另一目的是提供一种饮品组成物，其含有以本发明的培养方法所培养出的樟芝。

本发明的另一目的是提供一种酿造樟芝发酵酒的方法，其抗氧化能力是未发酵樟芝抽提物的2.5-4.0倍。

本发明提供一种樟芝培养方法，所述的方法包括在一斜面培养基上预培养樟芝。接着，取出一部分预培养出的樟芝并将其接种于一液态培养基(liquid culture media)中。之后，将在液态培养基中培养出的樟芝接种至一固态培养基(solid culture media)上进行培养。

依照本发明一较佳实施例，上述的固态培养基包括一基材、一碳源、一氮源以及一种以上的无机盐类。上述的基材例如是米、琼脂或是由米及琼脂构成的混合物。在一实施例中，基材的米品种例如是选自由糯米(GlutinousRice)、蓬莱米(Japonica Rice)、在来米(Indica Rice)、茭白(Zizania，也称Water Rice或Wild Rice)所组成的族群其中之一。

依照本发明一较佳实施例，若基材是由米及琼脂所构成，则米的重量百分比是0％至60％，琼脂的重量百分比是0％至3％，其是以固态培养基总重量为100％计。

依照本发明一较佳实施例，上述的碳源是选自由葡萄糖(glucose或Dextrose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、乳糖(lactose)、淀粉(starch)、纤维素(cellulose)、蔗糖(Sucrose)所组成的族群其中之一。

依照本发明一较佳实施例，上述的氮源是选自由蛋白胨(peptone)、三蛋白胨(tripeptone)、牛肉抽提物(beef extract)、麦芽抽提物(maltextract)、酵母抽提物(yeast extract)等所组成的族群其中之一。

依照本发明一较佳实施例，其中无机盐选自由磷酸盐、氯化钠(NaCl)、硫酸镁(MgSO₄)、氯化钾(KCl)等所组成的族群；浓度范围界于0.01％至2.5％；且磷酸盐选自由K₂HPO₃、K₃PO₃、KH₂PO₃、NaH₂PO₃、Na₂HPO₃等所组成的族群，其中磷酸盐的浓度范围界于0.01％至1.0％。

依照本发明一较佳实施例，经固态培养基(solid culture media)培养的樟芝可用于抑制人类癌细胞生长，且具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性，其中所述的人类癌细胞为乳癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(Hep 3B)、前列腺癌细胞(LNCaP)、及其他癌细胞，还可用于抗人类低密度脂蛋白氧化，可降低动脉粥样硬化的发生率；另可用于受损肝脏功能的回复。

本发明还提供一种食品组成物，其包括以上述的方法所培养出的樟芝。

依照本发明一较佳实施例，上述的食品组成物的形式可以是粉末、胶态、固态或是液态。另外，上述的食品组成物还包括一添加物，所述添加物选自中草药、保健食品成份、食材成份及其组合其中之一。

本发明还提供一种药物组成物，其包括以上述的方法所培养出的樟芝。

依照本发明一较佳实施例，上述的药物组成物的形式是选自锭剂、粉末、颗粒剂、胶囊、速溶锭、针剂、冻晶、悬浮剂、乳剂、糖浆、酊剂或是溶液剂所组成的剂型，可同时合并第二治疗药剂，其中第二治疗药剂选自由抗病毒药物、抗癌药物、抗发炎药物、以及适合改善自体免疫的药剂所组成的族群；且第二治疗药剂服用顺序可以先于、同时、或后于所述的药物组成物。

本发明还提供一种美容产品，其包括以上述的方法所培养出的樟芝，可使用于美白、抗老化、以及除皱。

依照本发明一较佳实施例，上述美容产品还包括一载体，其是选自色彩化妆品，例如粉底、腮红及唇膏色；头发产品，例如染发剂、洗发精及润发乳；腋下除臭产品；女用香水产品；男用香水产品和乳液保养产品。此外，上述美容产品更可包括香料、色彩添加剂，其例如是选自由FD&C红色40号、FD&C红色3号、FD&C蓝色2号、FD&C蓝色1号、FD&C绿色1号、FD&C绿色3号、FD&C黄色6号或是FD&C黄色5号所组成的族群。

本发明还提供一种饮品组成物，其包括以上述的方法所培养出的樟芝。

依据本发明一较佳实施例，上述饮品组成物还包括一保健食品成份，其是选自柠檬酸、牛磺酸、维生素C、维生素B群、泛酸、泛酸盐、烟碱酸、烟碱酸盐、肌醇、胡萝卜素、赖氨酸、茶精及其组合其中之一。另外，所述饮品组成物甚至还可包括一食品添加成份，其是选自碳酸水、砂糖、果糖、天然香料、食物色素及其组合其中之一。另外，所述饮品组成物还可以包括香料。

本发明还提供一种酿造樟芝发酵酒的方法，其抗氧化能力是未发酵樟芝抽提物的2.5-4.0倍。

依据本发明一较佳实施例，所述方法包括在一斜面培养基上预培养樟芝；取出一部分预培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中进行培养；再接种至一固态培养基上，同时添加酒酿进行培养4-6周；过滤取得樟芝含酒精的酿造液。其中所述的樟芝发酵酒，可用于抑制人类癌细胞生长，具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性，例如乳癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(Hep3B)、前列腺癌细胞 (LNCaP)、及其他癌细胞，且可用于抗人类低密度脂蛋白氧化，可降低动脉粥状硬化的发生率，另可用于受损肝脏功能的回复。其中经过滤取得的樟芝含酒精的酿造液经过巴斯德灭菌法处理，其酒精含量介于3.5％-16％。也可经蒸馏处理，形成酒精含量介于20％-40％的烈酒。

本发明所采用的樟芝培养方法可缩短培养的时间且能大量培养，而且经所述培养方法生产出具有与野生樟芝类似的抗氧化能力以及抑制异常细胞增生的特性；并可应用于受损肝脏功能的回复。因此，以本发明的方法所培养出的樟芝能应用于医药、生活消费、美容、保健、酿酒等用途，例如运用本发明的樟芝抽提物具抑制前列腺癌及其他人类癌症细胞的异常增生；以及抑制低密度的蛋白氧化以预防动脉粥状硬化的能力；还可回复受损的肝脏功能；并添加于药品、食品、美容保养品暨彩妆用品、美发产品、饮品、酒类。

为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是依照本发明一较佳实施例的樟芝培养的方法的流程图。

图2是在不同培养天数培养出的樟芝的抽提物与抗LDL氧化活性的关系图。

图3是在固态培养基中以不同碳源培养出的樟芝的抽提物与抗LDL氧化活性的关系图。

图4是以不同培养天数培养出的樟芝的抽提物与抑制人类癌细胞株生长的关系图。

图5是在固态培养基中以不同碳源培养40天的樟芝的抽提物与人类癌细胞存活率的关系图。

附图标号说明如下：

100、102、104：步骤

具体实施方式

培养方法

图1是依照本发明一较佳实施例的樟芝培养的方法的流程图。请参照图1，首先对樟芝进行预培养步骤(步骤100)，在此，樟芝是取自野生樟芝或是人工培养的樟芝。例如由倒伏的牛樟树的心材空洞处，截取樟芝子实体或被樟芝殖据(colonization)的心材，携回研究室，立即将所述心材或子实体部分组织置放在3％水脂培养基(water agar)上，再于25℃恒温箱培养，待新生菌丝长出后，即进行单菌丝切割，将其移植于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)或其他适当培养基的斜面，预培养樟芝。而预培养的目的是为了保留樟芝菌种，以作为日后再进行人工培养樟芝时的菌种来源。在此，预培养的条件与方式可以采用已知的任何一种方法。

由所产生的断生孢子、菌丝、菌落型态等特征加以确定之后，再将樟芝接种于一液态培养基中(步骤102)。换言之，取出一部分由步骤100所预培养出的樟芝，并将其接种于一液态培养基中进行培养。在此，所使用的液态培养基可以采用已知用于培养樟芝的液态培养基，例如是在US 6,355,475的专利中所揭示的液态培养方法。当然，本发明在步骤102中所使用的液态培养基也可以是其他已知的任何一种适用于培养樟芝的液态培养基。在一较佳实施例中，液态培养基的pH值例如是介于4～7之间。另外，在液态培养基中培养樟芝的时间例如是7～28天。

接着，将樟芝接种至一固态培养基中(步骤104)。换言之，将由步骤102中的液态培养基所培养出的樟芝接种于一固态培养基中进行培养。在一实施例中，液态培养基与固态培养基的重量比例如是介于1∶1至3∶1之间。

特别是，本发明的固态培养基包括一基材、一碳源、一氮源以及一种以上的无机盐类。上述的基材例如是米、琼脂或是由米及琼脂构成的一混合物。作为基材的米的品种例如是选自由糯米(Glutinous Rice)、蓬莱米(JaponicaRice)、在来米(Indica Rice)、茭白(Zizania，也称Water Rice或Wild Rice)及其组合其中之一。

在另一较佳实施例中，基材是由米及琼脂所构成，且米的重量百分比例如是0％至60％之间，琼脂的重量百分比例如是介于0％至3％之间，其是以固态培养基总重量为100％计。

此外，固态培养基中的碳源例如选自葡萄糖(glucose或Dextrose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、乳糖(lactose)、淀粉(starch)、纤维素(cellulose)、蔗糖(Sucrose)及其组合其中之一。另外，固态培养基中的氮源例如是选自蛋白胨(peptone)、三蛋白胨(tripeptone)、牛肉抽提物(beef extract)、麦芽抽提物(malt extract)、酵母抽提物(yeastextract)及其组合其中之一。在一较佳实施例中，碳源与氮源的比例例如是介于1∶1至5∶1之间。较佳的是，碳源的重量百分比是0.5％至10％，其是以固态培养基的总重量为100％计。氮源的重量百分比是0.05％至5％，其是以固态培养基的总重量为100％计。

另外，固态培养基中的无机盐酸例如是选自磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、氯化钾及其组合其中之一。其中，磷酸盐例如是选自K₂HPO₃、K₃PO₃、KH₂PO₃、NaH₂PO₃、Na₂HPO₃及其组合其中之一。在一较佳实施例中，无机盐的重量百分比例如是介于0.01％至2.5％之间，其是以固态培养基的总重量为100％计。

在固态培养基中培养樟芝的温度例如是介于18至28℃之间。另外，在固态培养基上培养樟芝时例如是不给予日照。再者，在固态培养基上进行培养时的培养震荡条件为静止。而在固态培养基上进行培养的时间例如是介于20至90天。

以上述的方法所培养出的樟芝例如是菌丝体樟芝。而且以本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有与野生樟芝子实体类似的生理活性，因而能用于抑制人类癌细胞生长，且具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性，也可以抑制人类低密度脂蛋白氧化以降低动脉粥状硬化的发生率；另可用于受损肝脏功能的回复。

以下将举出一些测试结果，以证明利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抑制人类癌细胞生长以及抑制人类低密度脂蛋白氧化的能力。

抗氧化活性测试

此测试方法是采用超高速离心分离方法以取得人类低密度脂蛋白(LDL)，并且以10μM铜离子(Cu²⁺)诱导LDL氧化。与此同时加入待测试样品进行抗LDL氧化的测试。LDL氧化过程是以共轭二烯(conjugated dienes)作为指标，并以光谱法连续侦测234nm的吸光值得知。另外，抗LDL氧化测试是以2μM维生素E的衍生物(Trolox)作为正对照组(positive control)。

表1所列是不同培养天数的樟芝抽提物对于铜离子所引发的LDL的抗氧化活性的测试结果，其中表1中的培养樟芝时间是指在固态培养基中进行培养的时间。另外，图2绘示了不同培养天数的樟芝抽提物与抗LDL氧化活性的关系图，其是依照表1的数据所绘示的图表。

表1：以1μL/mL浓度的樟芝抽提物进行抗氧化活性测试

樟芝培养时间(天数)	相对有效度
樟芝培养时间(天数)	相对有效度	20253035404550	1.01.51.71.61.81.91.9

注：维生素E的衍生物(Trolox)是作为对照组，其相对有效度是以Trolox浓度为2.00μM时，设有效度为1.00以作为基准。

由表1以及图2的结果显示，随着培养天数的增加，所培养出的樟芝抑制人类LDL氧化的能力越好。

另外，在此更针对以不同碳源所培养的樟芝对于抑制人类LDL氧化进行测试。表2所列是在固态培养基中使用不同培养碳源所培养出的樟芝，其抽提物对于铜离子所引发的LDL的抗氧化活性的测试结果。图3绘示了不同碳源培养出的樟芝抽提物与抗LDL氧化活性的关系图，其是依照表2的数据所绘示的图表。

表2：以1μL/mL浓度的樟芝抽提物进行抗氧化活性测试

碳源	相对有效度
碳源	相对有效度	葡萄糖(Dextrose)果糖(Fructose)半乳糖(Galactose)	1.41.82.0

由以上表1以及表2所列的结果可知，以本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝确实具有抑制人类低密度脂蛋白氧化的能力。

抗人类癌细胞生长测试

此测试方法是根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institution，NCI)所制定的抗肿瘤药物筛检模式进行的测试。所述的测试方法是以人类前列腺癌细胞株(LNCaP)、人类肝癌细胞株(Hep3B)以及人类乳癌细胞株(MCF-7)以进行离体测试。其中，人类肝癌细胞株(Hep3B)以及人类乳癌细胞株(MCF-7)是于含有胎牛血清的培养基中培养24小时之后再更换新的培养基，然后加入待测试样品后培养48小时。之后再以MTT呈色分析法评估细胞的存活率。另外，人类前列腺癌细胞株(LNCaP)是在含有胎牛血清的培养基中培养24小时后再更换新的培养基，然后加入待测试样品后培养72小时。之后再以MTT呈色分析法评估细胞的存活率。

表3所列是不同培养天数的樟芝抽提物对人类癌细胞抑制效果，其中表3中的培养樟芝时间是指在固态培养基中进行培养的培养时间。另外，图4绘示了不同培养天数培养出的樟芝抽提物与人类癌细胞活性的关系图，其是依照表3的数据所绘示的图表。

表3：以10μL/mL浓度的樟芝抽提物进行抗癌活性测试

樟芝培养时间	细胞存活率(％)
樟芝培养时间	细胞存活率(％)			(天数)	Hep 3B	LNCaP	MCF-7
202530354045	646846463313	374.9333.52.00.74	1413312.50.00.0	(天数)	Hep 3B	LNCaP	MCF-7

注：

1.测试以本发明的方法所培养出的樟芝对人类前列腺癌细胞的生长抑制作用时，是以计算96孔微量盘各孔中的细胞存活率，以MTT呈色分析法评估癌细胞的存活率。

2.MTT呈色分析法：MTT是一种tertrazolium salt，全名为3-〔4，5-Dimenthylthialzol-2-yl〕2，5-diphenyltetrazolium bromide，为黄色染剂，可被活细胞吸收并在粒腺体中被succinate-tetrazolium reductase还原成蓝色的formazan，常用于筛检物质对细胞的生长及增生的影响。

由表3以及图4的结果显示，随培养天数的增加，所培养出的樟芝抑制人类前列腺细胞生长的能力越好。

另外，在此还针对以不同碳源所培养的樟芝对于抑制人类癌细胞生长进行测试。表4所列是在固态培养基中使用不同碳源培养樟芝(培养时间为40天)，其抽提物对人类癌细胞存活率的影响。图5绘示了不同碳源培养出的樟芝抽提物与人类癌细胞存活率的关系图，其是依照表4数据所绘示的图表。

表4：以10μL/mL浓度的樟芝抽提物进行抗癌活性测试

碳源	细胞存活率(％)
	细胞存活率(％)			Hep 3B	LN CaP	MCF-7
	葡萄糖(Dextrose)果糖(Fructose)半乳糖(Galactose)	323364	422.060	Hep 3B	LN CaP	MCF-7	300.021

由表4与图5可知，以三种碳源所培养出的樟芝皆有抑制癌细胞生长的效果。特别是，以果糖(Fructose)为碳源所培养的樟芝其抗癌活性最佳。

保肝活性测试

此保肝测试方法是根据Lin等人于Cancer Research发表的方法运用于保肝药物筛检(J-K Lin and C-K Chou，In Vitro Apoptosis in the HumanHepatoma Cell Line Induced by Transforming Growth Factor β₁，CancerRes.，1992，52，385-388)。此测试方法是以转移生长因子β(TGF-β)诱发人类肝癌细胞(Hep3B)凋亡作为筛检模式以进行离体测试。人类肝癌细胞株(Hep3B)是在含有胎牛血清的培养基中培养24小时之后再更换新的培养基，然后加入2ng/mL TGF-β及待测试样品后培养48小时。之后再以MTT呈色分析法评估细胞的存活率，换算成回复率。

表5：以10μL/mL浓度的樟芝抽提物进行保肝活性测试

樟芝培养时间(天数)	保肝回复率(％)
樟芝培养时间(天数)	保肝回复率(％)	20	147

25303540

12915812266.0

表5列示出不同培养天数的樟芝抽提物对TGF-β诱发Hep3B进行细胞凋亡的保护效果，结果显示培养20～40天的樟芝具有回复TGF-β诱发肝细胞凋亡或损伤的效果。

培养樟芝且同时酿造樟芝酒的方法

依照本发明一较佳实施例的培养樟芝且同时酿造樟芝酒的方法，此方法类似前述的樟芝培养方法，请参照图1，首先对樟芝进行预培养步骤(步骤100)，在一斜面培养基上预培养樟芝；取出一部分预培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中进行培养(步骤102)。将在液态培养基中培养出的樟芝接种至一固态培养基上(步骤104)。不同之处在于，在步骤104中还同时添加酒曲进行培养4-6周。之后，过滤取得樟芝含酒精的酿造液，且经过巴斯德灭菌法处理后，其酒精含量介于3.5％-16％。而若经过滤取得的樟芝含酒精的酿造液再经蒸馏处理，获得酒精含量介于20％-40％的烈酒。

由表6可知，以樟芝原料、樟芝酒一、与樟芝酒二所执行的抗氧化结果，资料显示樟芝经发酵后所得的樟芝酒，其抗氧化能力提升2.5～4.0倍。其中樟芝酒二的甜度(sweetness)为6，酸碱度pH值为3.75。

表6：以樟芝酒进行抗氧化活性测试

	相对有效度	活性相当于2.0μM Trolox所需浓度(μL/mL)
	相对有效度	活性相当于2.0μM Trolox所需浓度(μL/mL)	樟芝原料樟芝酒一樟芝酒二	2.3＞5.6＞5.6	0.980.240.38

注：

1.维生素E的衍生物(Trolox)作为对照组，其相对有效度是以Trolox浓度为2.0μM时，设有效度为1.0以作为基准。

2.样品处理浓度为2.0μL/mL

以本发明酿造的樟芝酒，可用于抑制人类癌细胞生长，具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性。并应用于药物组成份，其中这些人类癌细胞可以为乳癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(Hep3B)、前列腺癌细胞(LNCaP)、及其他癌细胞。同时可用于抗人类低密度脂蛋白氧化，可降低动脉粥状硬化的发生率。

以本发明的方法所培养出的樟芝的应用

由以上说明可知，本发明的方法可以成功的培养出菌丝体樟芝，而且相较于传统人工培养方法，本发明在液态培养步骤之后还继续在固态培养基上进行培养，所述的培养方法能够大量的培养出菌丝体樟芝。而且，由测试结果得知，以本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有与野生樟芝类似的功效，即同样具有抗氧化能力以及有效抑制癌细胞生长的能力。因此，利用本发明的方法培养出的菌丝体樟芝可以应用于医药、生活消费、美容、保健等用途，其详细说明如下：

在一实施例中，可将利用本发明的方法培养出的菌丝体樟芝应用在食品工业上。因此，本发明提供一种食品组成物，其包括了以上述的方法所培养出的樟芝。而此食品组成物形式可以是粉末、胶态、固态或是液态。在一较佳实施例中，所述的食品组成物中还可包括一添加物，且所述的添加物例如是一中草药成份、一保健食品成份、一食材成份及其组合其中之。上述的保健食品成份例如是选自柠檬酸、牛磺酸、维生素C、维生素B群、泛酸、泛酸盐、烟碱酸、烟碱酸盐、肌醇、胡萝卜素、赖氨酸、茶精等及其组合其中之一。上述的食材成份例如是蔬菜食材、水果食材、肉类食材及其组合其中之一。在此，食品组成物中各成分的比例可以视实际食品设计所需以及相关法令规范而加以调整，甚至可以将上述的樟芝直接混入现有的食品组成配方中。因此，本发明并非限定食品组成物中各成分的比例。

由于利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抗氧化能力以及有效抑制癌细胞生长的能力，因此若将其与其他食品成分制成食品组成物将可作为保健食品。

在另一实施例中，由于樟芝具有抗氧化以及抑制癌细胞生长的能力，因此还可将利用本发明的方法培养出的菌丝体樟芝应用在药品上。因此，本发明提供一种药品组成物，其包括了以上述的方法所培养出的樟芝。其中，所述的药物组成物的形式例如是锭剂、粉末、颗粒剂、胶囊、速溶锭、针剂、冻晶、悬浮剂、乳剂、糖浆、酊剂或是溶液剂所组成的剂型。在此，药品组成物中各成分的比例可以视实际药品设计所需以及相关法令规范而加以调整。因此，本发明并非限定药品组成物中各成分的比例。

由于利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抑制癌细胞生长的能力，因此若将其制成药物组成物将可应用在治疗癌症的疗程中。另外，由于利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抑制人类低密度脂蛋白氧化的能力，因此若将其制成药物组成物将可应用在治疗动脉粥状硬化的疗程中。

在另一实施例中，可将利用本发明的方法培养出的菌丝体樟芝应用在美容产品上，以用于美白、抗老化以及除皱。因此，本发明提供一种美容产品，其包括了以上述的方法所培养出的樟芝。在一较佳实施例中，所述的美容产品还包括一载体，且载体例如是选自色彩化妆品、头发产品、腋下除臭产品、女用香水产品、男用香水产品和乳液保养产品其中之一。上述的色彩化妆产品例如是粉底、腮红或是唇膏。头发产品例如是染发剂、洗发精或是润发乳。在一较佳实施例中，所述的美容产品还包括一色彩添加剂。其中所述的色彩添加剂例如是选自于由FD&C红色40号、FD&C红色3号、FD&C蓝色2号、FD&C蓝色1号、FD&C绿色1号、FD&C绿色3号、FD&C黄色6号或是FD&C黄色5号所组成的族群。在一较佳实施例中，所述的美容产品还包括一香料。在此，美容产品中各成分的比例可以视实际食品设计所需以及相关法令规范而加以调整，甚至可以将上述的樟芝直接混入现有的美容产品配方中。因此，本发明并非限定美容产品中各成分的比例。

由于利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抗氧化能力，因此若将其与其他美容成分制成美容产品，将可使所述的美容产品具有抗氧化功效，以抑制皮肤老化。

在另一实施例中，可将利用本发明的方法培养出菌丝体樟芝应用在饮料产品上。因此，本发明提供一种饮品组成物，其包括了以上述的方法所培养出的樟芝。在一较佳实施例中，所述的饮品组成物还包括一载体，且所述的载体是选自水、气泡水、酒精、乳制品和果汁及其组合其中之一。在一较佳实施例中，所述的饮品组成物还包括至少一种以上的保健食品成份。上述的保健食品成份例如是选自柠檬酸、牛磺酸、维生素C、维生素B群、泛酸、泛酸盐、烟碱酸、烟碱酸盐、肌醇、胡萝卜素、赖氨酸、茶精及其组合其中之一。在一较佳实施例中，所述的饮品组成物还包括至少一种以上的食品添加成份。上述的食品添加成份是选自碳酸水、砂糖、果糖、天然香料、食物色素等所组成的族群其中之一。在一较佳实施例中，所述的饮品组成物还包括一香料。在此，饮品组成物中各成分的比例可以视实际饮料产品设计所需以及相关法令规范而加以调整，甚至可以将上述的樟芝直接混入现有的饮品配方中。因此，本发明并非限定饮品组成物中各成分的比例。

由于利用本发明的方法所培养出的菌丝体樟芝具有抗氧化能力以及有效抑制癌细胞生长的能力，因此若将其与其他饮品成分制成饮品组成物将可作为保健饮品。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视后附的权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种培养樟芝的方法，包括：

在一斜面培养基上预培养樟芝；

取出一部分预培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中进行培养；以及

将在所述液态培养基中培养出的樟芝接种至一固态培养基上进行培养。

2.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中所述的固态培养基包括一基材、一碳源、一氮源以及一种以上的无机盐类。

3.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的基材是米。

4.如权利要求3所述的培养樟芝的方法，其中所述的基材的米品种是选自由糯米、蓬莱米、在来米、茭白及其组合其中之一。

5.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的基材是琼脂。

6.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的基材是由米及琼脂构成的一混合物。

7.如权利要求6所述的培养樟芝的方法，其中所述的混和物中的米的重量百分比是0％至60％，所述的混和物中的琼脂的重量百分比是0％至3％，其是以所述固态培养基总重量为100％计。

8.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的碳源是选自由葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、淀粉、纤维素、蔗糖所组成的族群其中之一。

9.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的氮源是选自由蛋白胨、三蛋白胨、牛肉抽提物、麦芽抽提物、酵母抽提物等所组成的族群其中之一。

10.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的碳源与所述的氮源的比例为1∶1至5∶1。

11.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的碳源的重量百分比是0.5％至10％，其是以所述的固态培养基的总重量为100％计。

12.如权利要求2所述的培养樟芝的方法，其中所述的氮源的重量百分比是0.05％至5％，其是以所述的固态培养基的总重量为100％计。

13.如权利要求2所述的樟芝固态培养方法，其中所述的无机盐选自由磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、氯化钾等所组成的族群。

14.如权利要求2所述的樟芝固态培养方法，其中所述的无机盐的浓度范围界于0.01％至2.5％，其是以所述的固态培养基的总重量为100％计。

15.如权利要求2所述的樟芝固态培养方法，其中所述的磷酸盐选自由K₂HPO₃、K₃PO₃、KH₂PO₃、NaH₂PO₃、Na₂HPO₃等所组成的族群。

16.如权利要求2所述的樟芝固态培养方法，其中所述的磷酸盐的浓度范围界于0.01％至1.0％，其是以所述的固态培养基的总重量为100％计。

17.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基上进行培养时的培养温度是18℃至28℃。

18.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基上进行培养时不给予日照。

19.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基上进行培养时的培养震荡条件为静止。

20.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基上进行培养的时间是20至90天。

21.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的液态培养基上进行培养的时间是7至28天。

22.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中所述的液态培养基的pH值是介于4-7。

23.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中所述的液态培养基与所述的固态培养基的重量比是1∶1至3∶1。

24.如权利要求1所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基所培养出的樟芝是菌丝体樟芝。

25.如权利要求24所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基所培养出的樟芝可用于抑制人类癌细胞生长。

26.如权利要求24所述的培养樟芝的方法，其中在所述的固态培养基所培养出的樟芝具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性。

27.如权利要求24与25所述的培养樟芝的方法，其中所述的人类癌细胞为乳癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、及其他癌细胞。

28.如权利要求24所述的培养樟芝的方法，可用于抗人类低密度脂蛋白氧化，可降低动脉粥状硬化的发生率。

29.如权利要求24所述的培养樟芝的方法，可用于受损肝脏功能的回复。

30.一种食品组成物，其至少包括以权利要求1所述的培养樟芝的方法所培养出的樟芝。

31.如权利要求30所述的食品组成物，其中所述的食品组成物形式包括粉末、胶态、固态或是液态。

32.如权利要求30所述的食品组成物，还包括一添加物，所述的添加物是选自一中草药成份、一保健食品成份、一食材成份及其组合其中之一。

33.一种药物组成物，其包括以权利要求1所述的培养樟芝的方法所培养出的樟芝。

34.如权利要求33所述的药物组成物，其中所述的药物组成物的形式是选自锭剂、粉末、颗粒剂、胶囊、速溶锭、针剂、冻晶、悬浮剂、乳剂、糖浆、酊剂或是溶液剂所组成的剂型。

35.如权利要求34所述的药物组成物，其中所述的药物组成物可同时合并一第二治疗药剂。

36.如权利要求35所述的药物组成物，其中所述的第二治疗药剂选自由抗病毒药物、抗癌药物、抗发炎药物、以及适合改善自体免疫的药剂所组成的族群。

37.如权利要求36所述的药物组成物，其中所述的第二治疗药剂服用顺序可以先于、同时、或后于所述的药物组成物。

38.一种美容产品，其包括以权利要求1所述的培养樟芝的方法所培养出的樟芝。

39.如权利要求38所述的美容产品，可用于美白、抗老化、以及除皱。

40.如权利要求38所述的美容产品，还包括一载体，所述的载体选自色彩化妆品、头发产品、腋下除臭产品、女用香水产品、男用香水产品或是乳液保养产品。

41.如权利要求40所述的美容产品，其中所述的色彩化妆产品选自粉底、腮红或是唇膏。

42.如权利要求40所述的美容产品，其中所述的头发产品选自染发剂、洗发精或润发乳。

43.如权利要求38所述的美容产品，还包括一色彩添加剂。

44.如权利要求43所述的美容产品，其中所述的色彩添加剂选自由FD&C红色40号、FD&C红色3号、FD&C蓝色2号、FD&C蓝色1号、FD&C绿色1号、FD&C绿色3号、FD&C黄色6号或是FD&C黄色5号所组成的族群。

45.如权利要求38所述的美容产品，还包括一香料。

46.一种饮品组成物，其包括以权利要求1所述的培养樟芝的方法所培养出的樟芝。

47.如权利要求46所述的饮品组成物，还包括一载体，所述的载体选自水、气泡水、酒精、乳制品、果汁及其组合其中之一。

48.如权利要求46所述的饮品组成物，还包括一保健食品成份。

49.如权利要求48所述的饮品组成物，其中所述的保健食品成份选自柠檬酸、牛磺酸、维生素C、维生素B群、泛酸、泛酸盐、烟碱酸、烟碱酸盐、肌醇、胡萝卜素、赖氨酸、茶精及其组合其中之一。

50.如权利要求46所述的饮品组成物，还包括一食品添加成份。

51.如权利要求50所述的饮品组成物，其中所述的食品添加成份选自碳酸水、砂糖、果糖、天然香料、食物色素及其组合其中之一。

52.如权利要求46所述的饮品组成物，还包括一香料。

53.一种酿造樟芝发酵酒的方法，包括：

在一斜面培养基上预培养樟芝；

取出一部分预培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中进行培养；

将在所述的液态培养基中培养出的樟芝接种至一固态培养基上，添加酒曲进行培养4-6周；

过滤取得樟芝含酒精的酿造液。

54.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，可用于抑制人类癌细胞生长。

55.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，具有辅助抑制人类癌细胞生长的活性。

56.如权利要求53所述的药物组成份，其中所述的人类癌细胞为乳癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞及其他癌细胞。

57.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，可用于抗人类低密度脂蛋白氧化，可降低动脉粥状硬化的发生率。

58.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，可用于受损肝脏功能的回复。

59.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，其中经过滤取得的所述的樟芝含酒精的酿造液经过巴斯德灭菌法处理，其酒精含量介于3.5％-16％。

60.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，其中经过滤取得的所述的樟芝含酒精的酿造液经蒸馏处理，其酒精含量介于20％-40％。

61.如权利要求53所述的樟芝发酵酒，其抗氧化能力是未发酵樟芝抽提物的2.5-4.0倍。