JP2008099577A

JP2008099577A - 樟芝の培養方法とその応用

Info

Publication number: JP2008099577A
Application number: JP2006283229A
Authority: JP
Inventors: San-Bao Huang; 三保黄; Yu-Lung Wang; 玉龍王; Sheng-Yung Liu; 勝勇劉
Original assignee: Golden Biotechnology Corp
Current assignee: Golden Biotechnology Corp
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2008-05-01

Abstract

【課題】
樟芝の培養方法を提供する。
【解決手段】
最初に、樟芝を培地の傾斜表面に前保温する。前保温した樟芝の一部を保温のために液体培地に移動する。次に、液体培地で保温した樟芝を保温のために、個体培地に移動する。培養した樟芝は、ガン細胞発達の抑制、粥状動脈硬化発生の減少または肝機能障害の回復において、天然の樟芝と同等の効果を持つ。
【選択図】図１

Description

本発明は、基本的に菌糸の培養方法およびその応用に関する。さらに特定すると、本発明は、樟芝の培養方法およびその応用に関する。

樟芝は、「牛樟芝」または「牛樟茸」として知られ、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科に分類される多年生茸で、台湾でのみ生息する特別な茸である。台湾でみられる独特な植物である牛樟に寄生する。樟芝は、貴重で、おそらく存在する医療用茸の中で最も高価であろう。１９９０年に新種として発見され、１９９５年、第二の新種発表でＡｎｔｒｏｄｉａｃｉｎｎａｍｏｍｅａと名付けられ、１９９７年、第三の新種発表でＡｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａと名付けられた。

以前の研究で発見された、樟芝の子実体から抽出された三つの主なトリテルペノイド（アクチンＡ、アクチンＢおよびアクチンＣ）がある。後に、さらに新しいトリテルペノイドである、アントラキン、４、７−ジメトキシ−５−メチル−１、３−ベンゾジオキソールおよび２、２’、５、５’−テトラメトキシ−３、４、３’４’−ジメチレンジオキシ−６、６’−ジメチルビフェニルの三つが、樟芝の子実体エキスから発見された。アクチンＥ、アクチンＦ、メチルアントシンＧおよびメチルアントシンＨの他の四つの新しいトリテルペノイドが、１９９６年に発見された。また、１９９６年に、エルゴスタンの骨格構造を持つ化合物で、樟芝の子実体から抽出された新たな二つの化合物、ザンク酸Ｄおよびザンク酸Ｅが、ラノスタンの骨格構造を持つ新たな三つの化合物である１５α−アセチル−デヒドロ−サルフォニック酸、デヒドロエブリコイック酸およびデヒドロ−サルフォニック酸とともに発見された。

樟芝の成分の構成要素は、多数で複雑である。トリテルペノイドに加え、多糖類、ＳＯＤ、アデノシン、低分子タンパク質、ビタミン類、微量元素、クレアチン、ステロイド、血圧安定剤等などのその他多くの生物学的活性物質がある。樟芝から得られた独特のトリテルペノイド化合物は、ガン細胞発達の抑制および神経細胞の活性に効果的であることが証明されている。しかし、上述の活性メカニズムをさらに調査するために、さらなる研究が必要とされる。

海抜中低の暗く、湿気のある環境で栽培されると、天然樟芝はゆっくり成長（約６〜１０ヶ月）する。従って、子実体は、成熟に達するのに長い時間がかかる。牛樟芝および樟芝は、国内保護植物であり、人口培養による樟芝の大量生産は、まだ成功していない。不法採集のため、樟芝は絶滅に近い。

米国特許第６，５５８，９４３号で、Ｌｉらは、トウチュウカソウの固体培地を開示した。米国公開公報第２００３／０１３８４０８号で、Ｌａｎらは、特定のビニール袋での樟芝の培養を開示した。米国特許第６，３９１，６１５号、第６，３９５，２７１号および第６，３５５，４７５号で、Ｈｕａｎｇらは、培地からの樟芝の分離を開示した。米国公開公報第２００３／００８６９０８号で、Ｗｕらは、樟芝の最高条件を調整するために刺激および異なるＰＨｓの使用を開示した。米国公開公報第２００３／０１４８５１７号で、Ｃｈｅｎらは、樟芝の生物学的試験を開示した。米国公開公報第２００３／０１１３２９７号で、Ｃｈｅｎらは、肝臓ガンに対する樟芝の生理学的試験を開示した。

「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ」で、Ｓｏｎｇらは、樟芝の肝臓ガン治療の応用効果をテストするためのモデルを開示した（ＴＹＳｏｎｇおよびＧＣＹｅｎ、「ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＦｅｒｍｅｎｔｅｄＦｉｌｔｒａｔｅｆｒｏｍＡｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａｉｎｓｕｂｍｅｒｇｅｄＣｕｌｔｕｒｅａｇａｉｎｓｔＣＣｌ_４−ｉｎｄｕｃｅｄＨｅｐａｔｉｃＴｏｘｉｃｉｔｙｉｎＲａｔｓ（ラットにおけるＣＣｌ_４誘発性肝毒性に対する液内培養樟芝からの発酵濾液の保護作用）」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ、２００３、５１、１５７１−１５７７）。樟芝の抗酸化の性質をテストするためのモデルも展開された（Ｔ−ＹＳｏｎｇおよびＧＣＹｅｎ、「ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＡｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａｉｎＳｕｂｍｅｒｇｅｄＣｕｌｔｕｒｅ（液内培養樟芝の抗酸化作用）」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ、２００２、５０、３３２２−３３２７）。中国医学大学、栄養学部のＹａｎｇＨｓｉｎ−Ｌｉｎｇ教授による健康食品に対する研究の最終報告で、「ＴｈｅｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａｏｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｔｉｓｓｕｅｉｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ（樟芝の内皮細胞における心臓血管保護が調査される）」と発表された。

概して、本発明は、天然樟芝の採集の代わりに樟芝の培養方法を提供する。さらに、本発明は、天然樟芝と類似した生物学的作用をもつ樟芝の菌糸体生産のための大量生産の方法を提供する。

本発明の一側面において、本発明は、本発明の方法で培養された樟芝からなる食品成分に関する。

本発明の他の側面において、本発明は、本発明の方法で培養された樟芝からなる医薬成分に関する。

さらに本発明の他の側面において、本発明は、本発明の方法で培養された樟芝からなる化粧品に関する。

また本発明の他の側面において、本発明は、本発明の方法で培養された樟芝からなる清涼飲料に関する。

またさらに本発明の他の側面において、培養された樟芝からアルコール産物を生産する発酵方法に関する。培養された樟芝から抽出したアルコールの抗酸化作用は、培養された樟芝からの非発酵産物（アルコールなし）に対して２．５〜４．０倍である。

本発明によって、固体培養方法を提案する。傾斜表面での樟芝の前培養工程を実行し、次に前培養した樟芝の一部を液体培地に移動する。その後、液体培地で培養された樟芝を固体培地に移動する。

本発明の好適な実施例において、上述の固体培地は、基質、炭素源、窒素源および少なくとも一つの無機塩を含む。上述の基質は、米、寒天、または米および寒天の混合物からなるグループから選択される。一実施例において、米は、もち米、日本米、インド米または真菰（水稲またはワイルドライスとも呼ばれる）からなるグループから選択される。

本発明の好適な実施例において、基質が米および寒天の混合物からなる場合、米の重量比は０％から６０％、寒天の重量比は０％から３％の範囲で、固体培地の合計重量は１００％である。

本発明の好適な実施例において、上述の炭素源は、グルコース（ブドウ糖ともいう）、果糖、ガラクトース、乳糖、澱粉、セルロースおよびショ糖からなるグループから選択される。

本発明の好適な実施例において、上述の窒素源は、ペプトン、トリペプトン、牛肉エキス、麦芽エキスまたは酵母エキスから選択される。

本発明の好適な実施例において、上述の無機塩は、リン酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）、および塩化カリウム（ＫＣｌ）からなるグループから選択される。無機塩の濃度は０．０１％から２．５％の範囲で、リン酸は、リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_３）、リン酸三カリウム（Ｋ_３ＰＯ_３）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_３）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_３）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_３）からなるグループから選択され、リン酸の濃度は０．０１％から１．０％の範囲である。

本発明の好適な実施例において、上述の固体培地から培養された樟芝は、ヒトガン細胞発達の抑制に応用される。また、樟芝は、乳ガン細胞（ＭＣＦ−７など）、肝ガン細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）、前立腺ガン細胞（ＬＮＣａＰなど）およびその他のガン細胞などのヒトガン細胞発達を抑制する補助作用を持つ。さらに、培養された樟芝の可能な用途として、ヒト低密度リポタンパク質の酸化抑制、粥状動脈硬化の減少および肝障害の回復を含む。

上述の食品成分は、本発明の方法で培養された樟芝を含み、好適な実施例によれば、食品成分の形状は、粉末、ゲル、固体または液体である。また、上述の食品成分は、さらに、漢方薬（または薬草）、健康食品および食品材料からなるグループから選択された食品添加物を含む。

上述の医薬成分は、本発明の方法で培養された樟芝を含み、好適な実施例によれば、医薬成分の形状は、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、急速（経口一体）錠剤、注射、凍結乾燥注射、懸濁液、乳濁液、シロップ、チンキまたは溶液からなるグループから選択される。第二治療薬剤は、同時に添加可能で、第二治療薬剤は、抗ウイルス薬、抗ガン剤、消炎剤および免疫改善剤からなるグループから選択される。第二薬剤は、本発明の医薬成分の投与前、同時または投与後に服用可能である。

本発明の方法で培養された樟芝を含む上述の化粧品は、美白、抗老化および抗シワのスキンケアに応用可能である。本発明の好適な実施例によれば、上述の化粧品は、さらに担体を含む。担体は、カラーメークアップ、（ファンデーション、頬紅および口紅など）、毛髪製品（染髪料、シャンプーおよびコンディショナーなど）、脇下消臭剤、女性用香水、男性用化粧水、ローションおよびその他のスキンケア製品からなるグループから選択される。そのうえ、上述の化粧品は、さらに香料または着色添加剤を含む。着色添加剤は、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．４０、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．２、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．６またはＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．５からなるグループから選択される。

上述のように、本発明の方法で培養された樟芝を含む清涼飲料は、好適な実施例によれば、さらにクエン酸、タウリン、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、パントテン酸、パントテナート、ニコチン酸、ニコチネート、イノシトール、カロテン、リジンおよびその組み合わせからなるグループから選択される健康食品材料を含む。また、清涼飲料は、さらに食品添加物を含み、前記添加物は、炭酸水、グラニュー糖、果糖、天然香辛料、食品色素およびその組み合わせからなるグループから選択される。そのうえ、清涼飲料は、さらに調味料を含んでもよい。

上述の培養された樟芝からアルコール産物を生産する発酵方法によれば、培養された樟芝からのアルコール産物の抗酸化能力は、培養された樟芝からの非発酵製品に対して、２．５〜４．０倍である。

好適な実施例において、発酵方法は、傾斜表面での樟芝の前培養工程後、前培養した樟芝の一部の液体培地への移動を含む。その後、液体培地で培養された樟芝を固体培地に移動する。酵素を発酵のため添加し、培養が４〜６週間行われる。発酵させた樟芝のアルコール産物を濾過する。樟芝から発酵させたアルコール産物は、ヒトガン細胞の発達を効果的に抑制することを証明した。また、乳ガン細胞（ＭＣＦ−７など）、肝ガン細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）、前立腺ガン細胞（ＬＮＣａＰなど）およびその他のガン細胞といったヒトガン細胞の発達を抑制する補助作用も証明された。さらに、ヒトの低密度リポタンパク質の酸化抑制、粥状動脈硬化の減少および肝障害の回復も発見された。

低温殺菌後、発酵させた樟芝から得たアルコールエキスは、３．５％〜１６％のアルコールを含む。蒸留工程を実行した場合、エキスのアルコール濃度は、約２０％〜４０％に増加しうる。

本発明の樟芝の培養方法は、樟芝の大量生産のための培養期間を減少させる。さらに、培養された樟芝による抗酸化、抗増殖作用および肝細胞障害の回復が、天然の樟芝と類似していることが証明された。従って、培養された樟芝は、医療製品、消費製品、化粧品、健康医療製品および発酵用途に応用される。例えば、培養された樟芝は、前立腺ガンおよび異常増殖の抑制、低密度リポタンパク質の抗酸化、粥状動脈硬化の予防および肝機能の回復に応用される。培養された樟芝は、薬品、食品、スキンケアおよび化粧メークアップ、毛髪製品、飲酒および飲料の添加物として扱われる。

上述の概要および以下の詳細記述は、当然のことながら、例示的および説明的であり、請求項のとおり、本発明に制限されるものではない。

添付の図は、本発明のさらなる理解を提供するために記載し、本明細書に引用し、その一部とする。図は、本発明の実施例を示し、説明とともに本発明の基本原理の説明に使用される。

詳細な説明を、本発明の実施例に記載する。本発明は、実施例とともに説明されるが、本発明は、これらの実施例に制限されるものではない。反対に、本発明は、添付の請求項により定義される本発明の精神および範囲に含まれる代替、変更および同等のものを扱うものである。さらに、以下の本発明の詳細な説明において、多数の具体的な詳細を本発明の完全な理解の提供のために記載する。しかし、当該技術に精通する者にとって明らかなように、本発明は、これらの具体的な詳細なしに、実施され得る。他に、本発明の側面が曖昧にならないよう、周知の方法、手順、成分および回路は、詳細に記載されていない。

［培養方法］
図１は、本発明の樟芝培養方法の概略図を示す好適な実施例である。図１を参照に、樟芝の前培養工程（ステップ１００）が実行される。菌株は、天然樟芝菌株、または例えば、樟芝の子実体または牛樟の心材からコロニー形成された樟芝の一部を採集して採集または培養された樟芝菌株のいずれかである。樟芝の子実体または牛樟樹の心材からコロニー形成された樟芝の一部から採集された菌株を、３％の素寒天に寄生させ、２５℃の恒温噐に保管する。菌糸体が成長したら、ポテトデキストローズ寒天培地（ＰＤＡ）または他の適切な培地の傾斜表面に菌糸を分けて移動するために、各菌糸を分けるための切断工程を実行する。この前培養目的は、菌株を保存するためであり、認容されるあらゆる当該技術が適用される。

分けた胞子、菌糸およびコロニータイプの菌株を確認した後、確認した菌株を液体培地（ステップ１０２）に移動する。当該工程は、ステップ１００で前培養された樟芝の一部を、さらなる培養のために液体培地に収集することにより実行される。このステップは、米国特許第６，３５５，４７５に開示された液体培地のように、当該技術分野で樟芝に使用される一切の培地を適用することができる。好適な実施例の一つとして、液体培養工程のｐＨは、例えば、ｐＨ４〜７で、培養期間が７〜２８日間の範囲である。

次の工程（ステップ１０４）は、液体培地樟芝をさらなる培養のために固体培地に移動することである。好適な実施例の一つとして、液体培地および個体培地の割合は、１：１から３：１の範囲である。

特に、個体培地は、基質、炭素源、窒素源および少なくとも一つの無機塩を含む。上述の基質は、米、寒天、または米および寒天の混合物からなるグループから選択される。一実施例において、米は、もち米、日本米、インド米または真菰（水稲またはワイルドライスとも呼ばれる）からなるグループから選択される。

他の好適な実施例において、基質は米および寒天からなり、米の重量比は０％から３％の範囲で、固体培地の合計重量は１００％である。

さらに、上述の固体培地の炭素源は、グルコース（ブドウ糖ともいう）、果糖、ガラクトース、乳糖、澱粉、セルロース、ショ糖およびその組み合わせからなるグループから選択される。上述の固体培地の窒素源は、ペプトン、トリペプトン、牛肉エキス、麦芽エキス、酵母エキスおよびその組み合わせからなるグループから選択される。

好適な実施例の一つとして、炭素源および窒素源の割合は１：１から５：１の範囲である。炭素源の好ましい重量比は０．５％から１０％の範囲で、固体培地の合計重量は１００％である。

窒素源の好ましい重量比は０．０５％から５％の範囲で、固体培地の合計重量は１００％である。

さらに、上述の無機塩は、リン酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）および塩化カリウム（ＫＣｌ）からなるグループから選択され、リン酸は、リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_３）、リン酸三カリウム（Ｋ_３ＰＯ_３）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_３）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_３）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_３）からなるグループから選択される。合計１００％の重量比に対して、無機塩の濃度は０．０１％から２．５％の範囲である。

樟芝の固体培地の温度は、１８℃から２８℃（時には最高３０℃）の範囲である。さらに、太陽光および振動は、固体培養中は避ける。固体培地の培養期間は、例として、２０〜９０日である。

上述の方法は、樟芝の菌糸体の培養に使用される。培養された樟芝の菌糸体は、天然の子実体と類似した生物学的作用を提供する。同様に、ヒトガン細胞発達の抑制、ヒトＬＤＬの酸化抑制による粥状動脈硬化の可能性の低減、および肝機能障害の回復に対して使用することが可能である。

樟芝の菌糸体が、ガン細胞発達の抑制およびＬＤＬの酸化阻止に対して効果的であることを示すため、以下の項は、本発明により培養された樟芝菌糸体のテスト結果を記述する。

［抗酸化作用テスト］
抗酸化作用テストは、高速遠心分離によりヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を得、１０μＭで銅イオン（Ｃｕ^２＋）によりヒトＬＤＬの酸化を誘発することにより実行される。ＬＤＬ酸化テストを実行するために、テストサンプルを同時に添加した。２３４ｎｍ吸収での紫外線スペクトルの継続的観察により酸化プロセスを監視するために、ＬＤＬ中の共役ジエンがマーカーとして使用された。また、抗ＬＤＬ酸化テストの比較基準は、陽性対照として２μＭでビタミンＥ誘導体（トロロクス）である。

表１は、異なる培養期間で培養された樟芝エキスの抗ＬＤＬ酸化作用の一覧で、ＬＤＬの酸化は銅イオンで誘発した。表１の最初の行は、日数で培養期間を示す。図２は、表１に基づいた、培養期間および抗ＬＤＬ酸化能力の関係を示す。

ＰＳ：トロロクスは、ビタミンＥ誘導体で、効果的な濃度を「１．００」と定義したトロロクス効力に基づき、２．００μＭの濃度で、比較標準として扱われる。

表１および図２によると、培養期間が長いほど、本発明により培養された樟芝の抗ＬＤＬ酸化効力がよい。

また、さらなるテストが、異なる炭素源で培養された樟芝エキスの抗ＬＤＬ酸化効力に対して実行された。表２は、樟芝培養に使用された炭素源の一覧である。

表２は、異なる炭素源の固体培地で培養された樟芝エキスによる抗ＬＤＬ酸化効力の結果の一覧である。図３は、表２に基づいた、異なる炭素源および対応する樟芝の抗ＬＤＬ酸化効力の関係を示す。

表１および表２に示した結果によると、樟芝の培養された菌糸体は、ヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に対して抗酸化作用を確かに示す。

［ヒトガンの抑制テスト］
抗ガン薬物スクリーニングのために、国立ガン研究所（ＮＣＩ）により考案されたテストモデルをここで使用した。ヒト前立腺ガン細胞（ＬＮＣａＰなど）、ヒト肝ガン細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）およびヒト乳ガン細胞（ＭＣＦ−７）などのヒト細胞株が、試験管内試験で監視のため使用された。テストでは、ヒト肝ガン細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）および乳ガン細胞（ＭＣＦ−７）の細胞株を、子ウシ血清からなる培地で２４時間培養してから新しい培地に移動した。サンプルを添加してから、細胞株を４８時間培養した。細胞生残率を、ＭＴＴ染色分析により評価した。また、ヒト前立腺ガン細胞株（ＬＮＣａＰ）を、子ウシ血清からなる培地で２４時間培養してから、新しい培地に移動した。そして、サンプルを添加して、細胞株を７２時間培養した。細胞生残率をＭＴＴ染色分析により評価した。

表３は、固体培地で異なる培養期間で培養された樟芝エキスのガン細胞抑制作用の一覧である。また図４は、異なる培養期間により培養されたエキスと表３に基づいたガン細胞の生残率の関係を示す。

ＰＳ：
１．テストは、ＭＴＴ染色分析を介してガンの生残率を評価するために９６ウェル培養プレートで実行された。
２．ＭＴＴ染色分析：テトラゾリウム塩の一種であるＭＴＴは、３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドである。黄色の色素で、生細胞に吸収され、ミトコンドリアでコハク酸テトラゾリウムレラクダーゼにより青色のホルマザンに還元される、細胞の発達および増殖の評価のための一般スクリーニング方法である。

表３および図４の結果によると、培養期間が長ければ、ヒト前立腺ガン細胞の発達に対してより優良な抑制効果が提供される。

また、テストは、異なる炭素源で培養された樟芝エキスで、ヒトガン細胞発達の抑制のために実行された。表４は、ヒトガン細胞の生残率を示すための、固体培地（培養期間は４０日である）での異なる炭素源により培養された樟芝エキス効果の一覧である。図５は、図および表４に基づいた、異なる炭素源の樟芝エキスとガン細胞の生残率の関係を示す。

表４および図５によると、炭素源からの全三エキスは、ガン細胞において発達抑制効果をもつ。特に、果糖により培養された樟芝エキスは、最良の抗ガン作用をもつ。

［肝細胞の保護］
ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ誌掲載に基づく本テストモデルは、肝細胞保護薬（Ｊ−ＫＬｉｎおよびＣ−ＫＣｈｏｕ、「ＩｎＶｉｔｒｏＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｔｈｅＨｕｍａｎＨｅｐａｔｏｍａＣｅｌｌＬｉｎｅＩｎｄｕｃｅｄｂｙＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ β１（変換成長因子β１誘発性のヒト肝細胞株における試験管内アポトーシス）」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９２、５２、３８５−３８８）をスクリーニングするために使用された。本テスト方法は、試験管内試験でスクリーニングモデルとしてアポトーシスを刺激するために変換成長因子β（ＴＧＦ−β）を適用した。ヒト肝細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）を、子ウシ血清からなる培地で２４時間培養してから、新しい培地に移動した。２ｎｇ／ｍＬの変換成長因子β（ＴＧＦ−β）を添加して、サンプルをテストし、細胞株をさらに４８時間培養する。最後に、生残率を評価するためにＭＴＴ染色分析を実行し、生残率を回復率に変換した。

表５は、変換成長因子β（ＴＧＦ−β）により刺激されたＨｅｐ３Ｂ細胞のアポトーシスに対する、異なる培養期間により培養された樟芝エキスの保護効果の一覧である。結果は、２０〜４０日の間の培養期間の樟芝エキスがＨｅｐ３Ｂ細胞株のＴＧＦ−βにより刺激されたアポトーシスまたは障害に対して、回復作用を提供することを示す。

［アルコール産物（ワインおよび蒸留酒））における樟芝の培養および発酵］
好適な実施例によると、アルコールエキスにおける樟芝の培養および発酵は、上述の類似した方法に従う。図１を参照に、樟芝の前培養工程を傾斜表面（ステップ１００）で実行し、前培養された樟芝の一部を収集し、さらなる培養（ステップ１０２）のため液体培地に移動する。液体培地で培養された樟芝を、さらなる培養のため個体培地（ステップ１０４）に移動する。発酵は、（ステップ１０４）に酵素を添加し、さらに４〜６週間培養することにより培養と同時に行われる。その後、アルコールを含む発酵させた樟芝を濾過して低温殺菌する。発酵させた樟芝の濾過物（アルコール産物）は、約３．５％〜１６％のアルコールを含む。蒸留工程が実行された場合、発酵させた樟芝の蒸留物は、２０％〜４０％のアルコールを含み、蒸留酒として実用化される。

表６によると、樟芝の非発酵エキスの抗酸化作用、発酵させた樟芝の濾過物（１）、発酵させた樟芝の蒸留物（２）をテストし、データは、発酵させた樟芝エキスの抗酸化効力は、非発酵エキスに対して２．５〜４．０倍であることを示す。発酵させた樟芝からの蒸留アルコール産物（２）の甘みは、６で、ｐＨ値は３．７５である。

ＰＳ：
１．トロロクスは、ビタミンＥ誘導体で、比較標準として扱われ、トロロクス効力は、２．００μＭのトロロクス濃度で「１．０」と定義される。
２．サンプル濃度は、２．０μＬ／ｍＬである。

本発明の方法により培養された樟芝のアルコール産物は、乳ガン細胞（ＭＣＦ−７など）、肝ガン細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）、前立腺ガン細胞（ＬＮＣａＰなど）およびその他のガン細胞を含むヒトガン細胞発達の抑制作用を提供する医薬成分として使用されうる。樟芝のアルコール産物は、粥状動脈硬化発生減少のために、ヒト低密度リポタンパク質において抗酸化作用を提供できる。

［培養された樟芝の適用］
上述によると、本発明は、樟芝の菌糸体の培養に成功した。従来の人口培養方法と比較して、本発明の方法は、液体培地後、固体培地を実行し、樟芝菌糸体の大量生産に適している。また、テスト結果は、本発明の培養された樟芝菌糸体が、天然樟芝と類似した生物学的作用、つまり、ガン細胞発達の抑制および抗酸化作用の類似した生物学的効力をもつことを証明する。従って、本発明で培養された樟芝菌糸体は、医薬、食品、化粧品および予防目的に適用することができる。適用の詳細を以下に示す。

一実施例において、樟芝の菌糸体は、食品産業に適用された。ゆえに、本発明は、本発明の方法により培養された樟芝を含む食品成分に使用される。食品成分の形状は、粉末、ゲル、固体または液体として適用される。好適な一実施例として、食品成分は、さらに添加物を含み、当添加物は、漢方薬草、健康食品材料、または食品材料からなるグループから選択される。上述の健康食品は、クエン酸、タウリン、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、パントテン酸、パントテナート、ニコチン酸、ニコチネート、イノシトール、カロテン、リジンおよびその組み合わせからなるグループから選択される。上述の食品材料は、野菜、果物、肉類およびその組み合わせからなるグループから選択される。各材料の混合比率は、関連規定を満たすよう考案されおり、調整が可能である。本発明の樟芝を食品成分に直接混合することも可能である。従って、食品成分の混合比率は、本発明により制限されるものではない。

培養された樟芝菌糸体は、抗酸化および抗ガン発達作用をもつため、本発明の培養された樟芝からなる食品成分は、健康食品に分類される。

他の実施例において、本発明により培養された樟芝の菌糸体は、さらに医薬製品に適用される。よって、本発明は、本発明の方法により培養された樟芝からなる医薬成分に使用される。医薬成分の形状は、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、急速（経口一体）錠剤、注射、凍結乾燥注射、懸濁液、乳濁液、シロップ、チンキまたは溶液からなるグループから選択される。各材料の混合比率は、関連規定を満たすよう考案されており、調整が可能である。本発明の培養された樟芝を医薬成分に直接混合することも可能である。従って、医薬成分の混合比率は、本発明により制限されるものではない。

培養された樟芝の菌糸体は、抗ガン発達作用をもつため、本発明の培養された樟芝からなる医薬成分は、ガン治療に適用可能である。培養された樟芝の菌糸体は、抗酸化作用をもつため、本発明の医薬成分は、粥状動脈硬化の治療に適用可能である。

他の実施例において、本発明により培養された樟芝の菌糸体は、さらに美白、抗老化および抗シワ目的の化粧品に適用される。従って、本発明は、本発明の方法により培養された樟芝からなる化粧品に使用される。好適な一実施例において、化粧品は、さらに担体を含み、当担体は、カラーメークアップ、毛髪製品、脇下消臭剤、女性用香水、男性用化粧水、ローションおよびその他のスキンケア製品からなるグループから選択される。上述のカラー製品は、例えば、ファンデーション、頬紅および口紅である。上述の毛髪製品は、例えば、染髪料、シャンプーおよびコンディショナー等である。好適な一実施例において、上述の化粧品は、さらに着色添加剤を含む。着色添加剤は、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．４０、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．２、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．６またはＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．５からなるグループから選択される。好適な一実施例において、化粧品は、さらに香料を含む。各材料の混合比率は、関連規定を満たすよう考案されており、調整が可能である。本発明の樟芝を化粧品に直接混合することも可能である。ゆえに、化粧品の混合比率は、本発明により制限されない。

培養された樟芝の菌糸体は、抗酸化作用をもつため、本発明の化粧品は、抗老化目的に適用可能である。

他の実施例において、本発明により培養された樟芝の菌糸体は、さらに清涼飲料に適用される。従って、本発明は、本発明の方法により培養された樟芝からなる清涼飲料に使用される。好適な一実施例において、清涼飲料は、さらに担体を含み、当担体は、水、炭酸水、アルコール、乳製品、ジュースおよびその組み合わせからなるグループから選択される。一実施例において、清涼飲料は、さらに、少なくとも一つの健康食品材料を含む。上述の健康食品材料は、クエン酸、タウリン、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、パントテン酸、パントテナート、ニコチン酸、ニコチネート、イノシトール、カロテン、リジンおよびその組み合わせからなるグループから選択される。好適な一実施例において、清涼飲料の成分は、さらに少なくとも一つの食品添加物を含む。上述の食品添加物は、炭酸水、グラニュー糖、果糖、天然香料および食品色素からなるグループから選択される。好適な一実施例において、清涼飲料の成分は、さらに香辛料を含む。各材料の混合比率は、関連規定を満たすよう考案されており、調整が可能である。本発明の樟芝を直接混合することも可能である。従って、清涼飲料成分の混合比率は、本発明により制限されるものではない。

抗酸化および抗ガン発達作用のため、本発明により培養された樟芝の菌糸体は、健康飲料として清涼飲料に添加される。

上記の本発明の特定の実施例は、例示および説明目的のために記載したものである。これらは、全てを網羅するものではなく、開示された厳密な形態に本発明を制限するものではない。明らかに、上記説明の観点から、多くの変形および修正が可能である。本発明の基本原理および応用の説明のために、実施例を選択し、記載した。よって、考えられる特定の用途による多様な実施例および修正において、当該分野に精通した者に、本発明の利用を可能にする。本発明の範囲は、添付の請求項およびその等価物により定義される。

本発明の樟芝培養方法の概略図を示す好適な一実施例である。抗ＬＤＬ酸化モデルに基づいた、異なる培養期間の樟芝エキスの抗酸化作用を示す。抗ＬＤＬ酸化モデルに基づいた、培養における異なる炭素源の樟芝エキスの抗酸化作用を示す。ヒトガン細胞株モデルに基づいた、異なる培養期間の樟芝エキスの抗酸化作用を示す。ヒト細胞株モデルに基づいた、培養における異なる炭素源の樟芝エキスの抗酸化作用を示す。

Claims

樟芝の培養方法であり、樟芝を培地の傾斜表面で前培養するステップと、前培養の樟芝の一部を収集し、液体培地に移動するステップと、前記液体培地で培養した樟芝を固体培地に移動し、前記固体培地で樟芝を培養するステップとを有する樟芝の培養方法。
前記固体培地が、基質、炭素源、窒素源、および少なくとも１つの無機塩からなる、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記基質が米である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記米が、もち米、日本米、インド米、真菰（水稲またはワイルドライスとも呼ばれる）およびこれらの組み合わせである請求項３に記載の樟芝の培養方法。
前記基質が寒天である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記基質が、米および寒天の混合物である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記混合物の米重量比が０％から６０％、前記混合物の寒天重量比が０％から３％の範囲、および前記固体培地の合計重量が１００％である、請求項６に記載の樟芝培養方法。
前記炭素源は、グルコース、果糖、ガラクトース、乳糖、澱粉、セルロースおよびショ糖からなるグループから選択される、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記窒素源は、ペプトン、トリペプトン、牛肉エキス、麦芽エキスおよび酵母エキスからなるグループから選択される、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記炭素源および前記窒素源の比率が、１：１から５：１の範囲である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記炭素源重量比が０．５％から１０％の範囲で、前記固体培地の合計重量が１００％である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記窒素源重量比が０．０５％から５％の範囲で、固体培地の合計重量が１００％である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記無機塩は、リン酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）および塩化カリウム（ＫＣｌ）からなるグループから選択される、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記無機塩の濃度が０．０１％から２．５％の範囲で、固体培地の合計重量が１００％である、請求項２に記載の樟芝の培養方法。
前記リン酸は、リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_３）、リン酸三カリウム（Ｋ_３ＰＯ_３）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_３）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_３）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_３）からなるグループから選択される、請求項１３に記載の樟芝の培養方法。
前記リン酸の濃度が０．０１％から１．０％の範囲で、固体培地の合計重量が１００％である、請求項１３に記載の樟芝の培養方法。
固体培地の培養温度が１８℃から２８℃である、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記固体培地での前記樟芝培養ステップが太陽光にあたらない、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記固体培地での前記樟芝培養ステップが振動しない、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記固体培地での前記培養ステップの培養期間が２０〜９０日の範囲である、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記液体培地での前記培養ステップの培養期間が７〜２８日の範囲である、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記液体培地のｐＨ値が４〜７の範囲である、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記液体培地および前記固体培地の重量比が１：１０から１：５０の範囲である、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記固体培地での前記培養ステップ後に樟芝菌糸が得られる、請求項１に記載の樟芝の培養方法。
前記培養された樟芝がガン細胞発達の抑制に応用される、請求項２４に記載の樟芝の培養方法。
前記培養された樟芝は、前記ガン細胞の発達を抑制する補助作用を含む、請求項２４に記載の樟芝の培養方法。
前記ガン細胞は、ヒト乳ガン細胞、肝ガン細胞、前立腺ガン細胞およびその他のガン細胞からなるグループから選択される、請求項２４に記載の樟芝の培養方法。
前記培養された樟芝は抗酸化作用を含み、粥状動脈硬化の発生率の減少に応用される、請求項２４に記載の樟芝の培養方法。
前記培養された樟芝が、肝機能障害の回復に応用される、請求項２４に記載の樟芝の培養方法。
少なくとも請求項１に記載の方法で培養された樟芝を含む食品成分。
食品成分の形が、粉末、ゲル、固体または液体である、請求項３０に記載の食品成分。
前記食品成分はさらに添加物を含み、該添加物が、漢方薬草、健康食品材料およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される、請求項３０に記載の食品成分。
少なくとも請求項１に記載の方法で培養された樟芝を含む医薬成分。
前記医薬成分の形が、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、急速（経口一体）錠剤、注射、凍結乾燥注射、懸濁液、乳濁液、シロップ、チンキまたは溶液からなるグループから選択される、請求項３３に記載の医薬成分。
前記医薬成分が、第二治療用薬剤とともに投与される、請求項３３に記載の医薬成分。
前記第二治療用薬剤が、抗ウイルス薬、抗ガン剤、消炎剤および免疫改善剤からなるグループから選択される、請求項３５に記載の医薬成分。
前記第二治療用薬剤が、医薬成分の投与前、同時または投与後に服用される、請求項３６に記載の医薬成分。
少なくとも請求項１に記載の方法で培養された樟芝を含む化粧品。
前記化粧品が、美白、抗老化または抗シワに応用される、請求項３８に記載の化粧品。
前記化粧品はさらに担体を含み、前記担体が、カラーメークアップ、毛髪製品、脇下消臭剤、女性用香水、男性用化粧水、ローションおよびその他のスキンケア製品からなるグループから選択される、請求項３８に記載の化粧品。
前記メークアップは、ファンデーション、頬紅および口紅からなるグループから選択される、請求項４０に記載の化粧品。
前記毛髪製品は、染髪料、シャンプーおよびコンディショナーからなるグループから選択される、請求項４０に記載の化粧品。
前記メークアップは、さらに着色添加剤を含む、請求項３８に記載の化粧品。
前記着色添加剤は、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．４０、ＦＤ＆Ｃ赤Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．２、ＦＤ＆Ｃ青Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．６またはＦＤ＆Ｃ黄Ｎｏ．５からなるグループから選択される、請求項３８に記載の化粧品。
前記化粧品は、さらに香料を含む、請求項３８に記載の化粧品。
少なくとも請求項１に記載の方法で培養された樟芝を含む清涼飲料成分。
前記清涼飲料製品は、さらに担体を含み、前記担体は、水、炭酸水、アルコール、乳製品、ジュースおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される、請求項４６に記載の清涼飲料製品。
前記清涼飲料製品は、さらに健康食品材料を含む、請求項４６に記載の清涼飲料製品。
健康食品材料は、クエン酸、タウリン、ビタミンＣ、ビタミンＢグループ、パントテン酸、パントテナート、ニコチン酸、ニコチネート、イノシトール、カロテン、リジンおよびその組み合わせからなるグループから選択される、請求項４８に記載の清涼飲料製品。
前記清涼飲料製品は、さらに食品添加物を含む、請求項４６に記載の清涼飲料製品。
前記食品添加物は、炭酸水、グラニュー糖、果糖、天然香料、および食品色素からなるグループから選択される、請求項５０に記載の清涼飲料製品。
前記清涼飲料製品は、さらに香辛料を含む、請求項４６に記載の清涼飲料製品。
前記ガン細胞は、ヒト乳ガン細胞、肝ガン細胞、前立腺ガン細胞およびその他のガン細胞からなるグループから選択される、請求項２５に記載の樟芝の培養方法。
樟芝のアルコール製品の発酵方法であり、培地の傾斜表面で樟芝を前培養するステップと、前培養した樟芝の一部を収集し、液体培地に移動するステップと、液体培地で培養した樟芝を固体培地に移動し、酵素を添加し、４〜６週間発酵を実施するステップと、濾過して樟芝のアルコールエキスを収集するステップとを有する樟芝のアルコール製品の発酵方法。
前記アルコール製品は、ガン細胞発達の抑制に応用される、請求項５４に記載の方法。
前記アルコール製品は、ガン細胞発達を抑制する補助作用を含む、請求項５４に記載の方法。
前記ガン細胞は、ヒト乳ガン細胞、肝ガン細胞、前立腺ガン細胞およびその他のガン細胞からなるグループから選択される、請求項５４に記載の方法。
前記アルコール製品は、抗酸化作用を含み、粥状動脈硬化発生の減少に応用される、請求項５４に記載の方法。
前記アルコール製品は、肝機能障害の回復に応用される、請求項５４に記載の方法。
濾過されたアルコールエキスは、低温殺菌され、アルコール度が、３．５％〜１６％の範囲である、請求項５４に記載の方法。
前記濾過されたアルコール製品はさらに蒸留され、前記蒸留エキスは２０％〜４０％の範囲のアルコール度を含む、請求項５４に記載の方法。
アルコール製品の抗酸化作用が、非発酵エキスに対して２．５〜４．０倍である、請求項５４に記載の方法。