CN107858292B - 一种牛樟芝菌株及其保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物技术领域,涉及一种株牛樟芝菌株及其保藏方法。该牛樟芝菌株保藏方法是将牛樟芝菌株以5‑10%接种量接种到60‑100mL液体培养基中,在温度25‑30℃,湿度40‑80%的恒温摇床上以转速80‑150rpm培养5‑10天,获得牛樟芝活化菌液,将牛樟芝菌液涂布在斜面固体培养基上培养,在温度25‑30℃,湿度40‑80%的恒温恒湿培养箱内静止培养10‑15天,待菌丝长出孢子,以无菌20‑50%甘油倒入斜面试管内,用刮铲刮下孢子,并于甘油溶液均匀混合,置于无菌离心管中,盖好盖子后用封口膜密封后放入‑18℃冰箱预冷3‑5小时,然后转入‑80℃冰箱进行保藏。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝菌株及其保藏方法,属于微生物技术领域。
背景技术
牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus),又名樟芝或牛樟菇,属于担子菌纲、非褶菌目、多孔科、薄孔菌属真菌,是一种原产于我国台湾省的珍稀药用菌,樟芝子实体寄生于牛樟树树干腐朽的内壁或倒伏在地上靠近土表的无树皮表面,具有强烈的牛樟树香气,含有高含量精油,外形呈板形、钟形、马蹄形或是不规则形状,多年生、无柄,紧贴于木材表面生长,樟芝子实体内部有特征性的多孔状结构。樟芝子实体开始时呈鲜红色、桔褐色,质地柔软;成熟后颜色转为淡红褐色或是淡黄色,质地因木质化而变得坚硬。
牛樟芝具有多种生物学活性,例如保护肝脏、保护神经系统、抗乙肝病毒、抗肿瘤、抗氧化、消炎、增强免疫力等。近年来,牛樟芝得到了越来越多的关注和研究。尤其是其培养方法、生理活性、药理作用等成为热点。
目前,对于牛樟芝的人工培养集中于深层发酵培养,即将牛樟芝菌种接种于发酵罐内的液体培养基中,通入无菌空气,辅以搅拌,最终获得大量牛樟芝菌丝体及其代谢产物。但是,要保证生产的稳定运行,菌种的长期保藏成为关键。
发明内容
本发明为解决上述问题的不足,提供一种牛樟芝菌株及其保藏方法,该方法保存期长,菌株存活率高,遗传稳定。
本发明采用以下技术方案予以实现:
一种牛樟芝菌株,该菌株于2017年7月10日保藏于《中国普通微生物菌种保藏管理中心》,保藏号为:CGMCC NO.14351,该菌株命名为牛樟芝AC04,Taiwanofunguscamphoratus AC04。
所述的牛樟芝菌株的保藏方法,包括以下步骤:
a.将保藏号为CGMCC NO.14351的牛樟芝菌株以5-10%接种量接种到60-100mL液体培养基中,在温度25-33℃,湿度40-80%的恒温摇床上以转速80-150rpm培养5-10天,得到牛樟芝活化菌液;
b.将步骤a的牛樟芝活化菌液涂布在斜面试管固体培养基上培养,在温度25-33℃,湿度40-80%的恒温恒湿培养箱内静止培养10-15天,待菌丝在斜面试管内长出孢子;
c.以无菌20-50%甘油倒入步骤b中的斜面试管内,用刮铲刮下孢子,并与甘油溶液均匀混合,然后将斜面试管内的混合溶液置于无菌离心管中,盖好盖子后用封口膜密封,作为含有牛樟芝孢子的甘油管;
d.将步骤c中含有牛樟芝孢子的甘油管放入-18℃冰箱预冷3-5小时,然后转入-80℃冰箱进行保藏。
优选的,所述步骤a中的液体培养基为:包括可代谢碳源10-50g/L,可代谢蛋白氮源5-30g/L,磷酸氢二钾0.5-2.0g/L,七水合硫酸镁0.1-1.0g/L,氯化钠0.05-0.2g/L,七水合硫酸亚铁0.1-0.4g/L,并调整pH 5.0-8.0,在121℃灭菌30分钟。
优选的,所述步骤a中的固体培养基为:包括可代谢碳源10-50g/L,可代谢蛋白氮源5-30g/L,磷酸氢二钾0.5-2.0g/L,七水合硫酸镁0.1-1.0g/L,琼脂粉10-30g/L,并调整pH5.0-8.0,在121℃灭菌30分钟。
所述可代谢碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、淀粉中的一种或几种的复配。
所述可代谢蛋白氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉中的一种或几种的复配。
优选的,所述的牛樟芝菌株的保藏方法,所述液体培养基或固体培养基中的pH为6.5。
优选的,所述的牛樟芝菌株的保藏方法,所述步骤a中,将牛樟芝菌株以10%接种量接种到100mL液体培养基中,在温度28℃,湿度60%的恒温摇床上以转速110-130rpm培养6天,得到牛樟芝活化菌液。
优选的,所述的牛樟芝菌株的保藏方法,所述步骤b中,将步骤a的牛樟芝活化菌液涂布在斜面试管固体培养基上培养,在温度28℃,湿度70%的恒温恒湿培养箱内静止培养15天,待菌丝在斜面试管内长出孢子。
优选的,所述的牛樟芝菌株的保藏方法,包括以下具体步骤:
①按液体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸镁0.5g/L,氯化钠0.1g/L,七水合硫酸亚铁0.25g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟,得到液体培养基;
②按固体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖40g/L,酵母粉20g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,七水合硫酸镁0.6g/L,琼脂粉20g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟,得到固体培养基;
③将牛樟芝菌株CGMCC NO.14351以10%接种量接种到100mL液体培养基中,28℃恒温,摇床120rpm,培养6天,得到牛樟芝的活化菌液;
④将牛樟芝活化菌液涂布在斜面固体培养基上培养,在温度28℃,湿度70%的恒温、恒湿、培养箱内,静止培养15天,待菌丝长出孢子;
⑤以无菌20%甘油倒入斜面试管内,用刮铲刮下孢子,并于甘油溶液均匀混合,置于无菌离心管中,盖好盖子后用封口膜密封;
⑥将含有牛樟芝孢子的甘油管放入-18℃冰箱预冷5小时,然后转入-80℃冰箱进行保藏。
本发明从土壤中筛选得到牛樟芝菌株,通过液体培养基培养活化菌株,转入固体培养基培养获得孢子,以甘油溶液为孢子保护剂,对牛樟芝孢子进行长期低温保藏,获得较好的效果。
本发明与现有技术相比具有的显著优点为:
(1)该菌株可分泌一种或多种芳香化合物,使培养基或培养液呈特殊香味。
(2)该保藏方法可以最大限度的保证菌株的存活率,最大限度的保证遗传稳定性。
(3)该菌株的保藏方法成本低,投资少,利于大量生产。
(4)本发明不仅为牛樟芝菌株提供工业化的菌株保藏方法,而且该菌株的芳香化合物的应用前景广阔,具有较高的社会效益。
附图说明
图1为牛樟芝活化菌液图。
图2为在平皿上长出孢子的牛樟芝菌株图。
具体实施方式
下面参照附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。
参见图1至图2。
下面对本发明的技术方案作进一步说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围。
实施例1牛樟芝菌的筛选和鉴定
1)土样采集。本发明所涉及的牛樟芝菌株来自福建省福州市森林公园的牛樟木附近的土壤中,取距地面15cm深的土壤20g。
2)菌株富集。采用PDA培养基,pH调至4.5,121℃灭菌30分钟,此培养基适于真菌生长。将土壤按1%量添加至此培养基中,在恒温恒湿培养箱中静止培养,温度28℃,湿度70%,每天摇动2-3次。培养15天后,采用灭菌的纱布对菌液进行过滤,无菌水反复冲洗纱布,真菌的菌丝体在纱布上被截留,而细菌被过滤至滤液中。
3)菌株初筛。将真菌的菌丝体用少量无菌水洗至无菌试管内,作为初始菌液,按照梯度稀释平皿分离法,进行菌株初步分离筛选,培养基采用PDA固体培养基,pH调至4.5,将涂有稀释菌液的平皿置于恒温恒湿培养箱中培养,温度28℃,湿度70%,培养60天,在培养过程中,每天取出观察,重点观察白色单菌落,在白色单菌落长至直径5mm时,将该单菌落转移至另一无菌平皿上单独培养。
4)菌株复筛。各个白色单菌落单独培养的周期为60天,每天取出观察,有6个单菌落从白色变成橙红色,并且有微微橙子香味,将这些变色的单菌落逐一标记编号为AC01,AC02,AC03,AC04,AC05,AC06。
5)菌株鉴定。将菌株重新接种于液体PDA培养基中,置于摇床培养,培养温度28℃,转速120rpm,培养15天,培养基浑浊,可见球状菌团,有橙子香味,取出后装入无菌小离心管内,交于检测机构进行18S rRNA的序列鉴定,序列测序结果如图1所示,序列比对结果显示为,AC04菌株与牛樟芝菌亲缘关系最近。
实施例2牛樟芝菌的保藏方法
1)按照液体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸镁0.5g/L,氯化钠0.1g/L,七水合硫酸亚铁0.25g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟。
2)按照固体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖40g/L,酵母粉20g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,七水合硫酸镁0.6g/L,琼脂粉20g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟。
3)将牛樟芝菌株CGMCC NO.14351以10%接种量接种到100mL液体培养基中,28℃恒温摇床120rpm培养6天,得到牛樟芝的活化菌液,如图2所示。
4)将牛樟芝活化菌液涂布在斜面固体培养基上培养,在温度28℃,湿度70%的恒温恒湿培养箱内,静止培养15天,待菌丝长出孢子,如图2所示。
5)以无菌20%甘油倒入斜面试管内,用刮铲刮下孢子,并于甘油溶液均匀混合,置于无菌离心管中,盖好盖子后用封口膜密封。
6)将含有牛樟芝孢子的甘油管放入-18℃冰箱预冷5小时,然后转入-80℃冰箱进行保藏。
实施例3牛樟芝孢子甘油管的菌株活性检测
1)按照固体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖40g/L,酵母粉20g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,七水合硫酸镁0.6g/L,琼脂粉20g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟。
2)对于同一批次的孢子甘油管进行活性检测,将未冻存的孢子液作为对照,将冻存时间分别为1周,2周,1个月,3个月,6个月的孢子液分别在以上设定的保藏时间按时取出,分别记为实验组,经过梯度稀释平板分离法进行分离。共进行3批次实验。
3)将平皿在温度28℃,湿度70%的恒温恒湿培养箱内,静止培养15天,待平皿内长出单菌落。
4)挑选每个平皿有10-30个单菌落的平皿,对长出的单菌落进行计数,根据稀释倍数计算得到孢子甘油管内孢子数,这些孢子均是具有生长能力的活性孢子。将实验组的活性孢子数占对照组的活性孢子数的比例记为存活率,如表1所示。
5)由表1所示,经过冻存的孢子甘油管内孢子存活率均在95%左右,表明此方法可以使牛樟芝菌株CGMCC 14351长期保藏,并且能保证其较高的存活率,在未来的生产实践中,对于保证菌株的稳定性具有重大意义。
表1为菌株活力与保藏时间的关系
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明较优的实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应归属本发明的专利涵盖范围之内。
牛樟芝菌株的18S rRNA序列
AGTATGTCTAGTATAACAAGTTTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTGCTTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAATGAAGCCCCGACTCCTGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCGGTTAGCCGCTCCATTGGTGATTCATAATAACTTGTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGTGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATATAGGGCTCTTTCGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCTCTTAGCGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCAGACCTGGTCGGGTGGTCTGCCTCACGGTATGTACTGTCTGGCTGGGTCTTATCTCTTGGTGAGCCGGCATGCCCTTTGCTGGGTGTGTCGGGGAACCATGATGTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTCAAGCAGCCCTATGCCCGAATACATTAGCATGAATAATAAAATAGGACGTGCCGGCTCTATTTTGTTGGTTTCTGAGTCGCCGTAATGATTAATAGGGGATAGTTGGGGGGCATTAGCTAA
Claims (1)
1.一种牛樟芝菌株的保藏方法,其特征是包括以下具体步骤:
①按液体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸镁0.5g/L,氯化钠0.1g/L,七水合硫酸亚铁0.25g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟,得到液体培养基;
②按固体培养基中各组分的配比准确称取各组分,葡萄糖40g/L,酵母粉20g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,七水合硫酸镁0.6g/L,琼脂粉20g/L,调节pH至6.5,121℃灭菌30分钟,得到固体培养基;
③将保藏号为CGMCC NO.14351的牛樟芝菌株以10%接种量接种到100mL液体培养基中,28℃恒温,摇床120rpm,培养6天,得到牛樟芝的活化菌液;
④将牛樟芝活化菌液涂布在斜面固体培养基上培养,在温度28℃,湿度70%的恒温、恒湿、培养箱内,静止培养15天,待菌丝长出孢子;
⑤以无菌20%甘油倒入斜面试管内,用刮铲刮下孢子,并于甘油溶液均匀混合,置于无菌离心管中,盖好盖子后用封口膜密封;
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