CN104337746A

CN104337746A - 利用蘑菇的鲍鱼蘑菇发酵物,其制作方法及含有其的化妆品组合物

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Publication number: CN104337746A
Application number: CN201410222094.7A
Authority: CN
Inventors: 李忠佑; 金哲珉; 余炳国; 康荣基; 李王渊; 李民濬; 金美爱
Original assignee: EUROCOSTECH CO LTD
Current assignee: EUROCOSTECH CO LTD
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: KR101336804B1; CN104337746B

Abstract

本发明涉及一种利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得的鲍鱼蘑菇发酵物及以发酵物为有效成份含有的具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料组合物。所述发酵物是利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得；所述蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其中2种以上混合物构成的组中选择。

Description

利用蘑菇的鲍鱼蘑菇发酵物,其制作方法及含有其的化妆品组合物

技术领域

本发明涉及一种鲍鱼蘑菇发酵提取物，该发酵提取物的制作方法及含有该发酵提取物的化妆品组合物。具体讲，就是涉及一种利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得的鲍鱼蘑菇发酵物及以该发酵物作为有效成份含有的具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料组合物。

背景技术

发酵是指微生物利用自身带有的酶分解或合成有机物的过程，具有代表性的发酵微生物包括枯草菌、乳酸菌、曲霉菌、酵母菌、霉菌、醋酸菌、蘑菇菌丝体等。

最近，在化妆品领域对于利用天然材料制作发酵食品及化妆品越来越关注，正广泛开展美白、改善皮肤皱纹、抗氧化、保湿、增强弹性等方面的研究。

发酵物或发酵物的提取物不使用其它任何溶剂，通过发酵和熟成过程使天然材料中含有的糖分转化成酒精，可以提高天然材料中类黄酮、维生素C、维生素P、氨基酸、儿茶素等有效成份的提取效率。另外，有时对于具有刺激性或毒性的天然材料可以采用通过发酵提取法使天然材料稳定或降低毒性或者使其转化成稳定衍生物的方法，可以极大地提高美容功效。另外，在通过乳酸菌及酵母等的发酵工艺转化为容易吸收的低分子物质、从不稳定或惰性形态转化为活性形态的过程中，可以极大地提高天然材料的功效，强化保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹的效果。

鲍鱼(ear shell；Haliotis discus hannai)是归属原始腹足目鲍鱼科的软体动物的总称，它是一种栖息在海水洁净的暗礁周边，以海藻类为食物的水产生物，其钙、磷等无机质非常丰富，含有足量的维生素B1、B2及蛋白质，可用于皮肤美容、滋补身体及产后护理等。特别是，其牛黄酸成份比较丰富，对于保护肝脏、消除疲劳、心肌梗死等有很好的预防效果。可以保肝护肾、明目、开胃，对于滋补身体、治疗咳嗽、头痛、眩晕症等具有很好的功效。其胶原蛋白含量较高，可以促进细胞再生及皮肤新陈代谢，有助于皮肤美容。它作为一种高级鱼贝类，自古以来不论是在营养方面还是在口味方面都是其它海产品无法相提并论的。在韩国虽然人们喜欢将其作为一种保健膳食，但是由于其价格昂贵而不能成为大众消费。

现在市场上销售的鲍鱼大部分都是1至4年生，3年生以上常被用来制作生鱼片，2年生以下常被用来作鲍鱼粥等食品的材料。但是，通过对不同年龄鲍鱼肉与内脏物理化学特性的比较研究发现，随着鲍鱼生长年份的变化，其以牛黄酸等为主的氨基酸类、脂肪酸和硫酸软骨素等的营养成份及有效成份含量也不相同，因此在选择鲍鱼作原料时鲍鱼的年龄常被视作需要重点考虑的因素。

关于鲍鱼的研究，包括：对不同年龄鲍鱼肉与内脏的物理化学特性比较、以鲍鱼内脏提取物为有效成份的免疫强化组合物、以鲍鱼提取物为有效成份含有的具有改善皮肤皱纹功效的化妆料组合物、含有鲍鱼提取物的化妆品组合物及其制造方法、以鲍鱼内脏提取物为有效成份的强化免疫组合物、含有贝类提取物的肝病改善及预防用食品组合物、具有消除活性氧类的活性的鲍鱼消化水解物、含有鲍鱼汁的功能性饮料组合物及其制造方法、含有鲍鱼冻干肉的解酒饮料及其制造方法、利用天然材料制造功能性化妆品组合物、蒸干鲍鱼的制造方法及利用该方法制作的蒸干鲍鱼、利用乳酸和葡萄柚籽提取物制造抗菌剂组合物及利用该组合物加工鲍鱼的方法等，不仅涵盖了食品及饮料，而且还扩展到了化妆品领域。但是这些研究都还停留在初始阶段，而通过发酵工艺最大限度地获取有效成份的鲍鱼发酵提取物的研究还没有涉及。

鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)属于侧耳科(Pleurotaceae)，因其肉质与鲍鱼相似而得名，也被称作绒红铆钉菇(根据O.K.Miller命名为Pleurotuscystidiosus)、枫牡蛎蘑菇、台湾平菇等。普通平菇适合于在25℃以下的中、低温环境中栽培，而鲍鱼菇在25至30℃的高温环境中也能够生长。在我国最佳的栽培时机为平均温度20至28℃的时候，即从6中旬开始至9月上旬为止。从鲍鱼菇的形态特征来看，菌盖呈扁平状，大小为6.6至9.8cm，菌杆的长度为1.6至3.8cm。与普通平菇类植物相比，具有相当大的菌盖而菌杆较短的特征。另外，它并不像圆形平菇那样簇生而是单生,单体重量平均为12.8g左右。菌盖呈深褐色，菌杆呈米黄色，受温度和阳光影响其颜色会出现或浓或淡的差异。

现在，已经研发出与此相关的以鲍鱼菇菌丝体或子实体提取物为有效成份含有的具有抗老化及改善皮肤皱纹功效的组合物(专利申请第2010-0008638号)。

另外，最近正在研发多种化妆品原料，包括利用桑叶提取物(韩国专利公布第2008-0078371号中记载了桑叶提取物和冬虫夏草菌丝体)与冬虫夏草菌丝体培养液制造的具有皮肤美白功效的化妆品原料和利用以蘑菇菌丝体培养物(韩国专利公告第10-0848515号记载，以神仙草、鱼腥草及三白草构成的生药草为基质将蘑菇菌丝体接种到培养基中培养获得蘑菇菌丝体培养物)为有效成份的美白化妆品等天然培养基中培养蘑菇菌丝体获得的培养物制造的化妆品原料。

因此，本发明涉及探索鲍鱼提取物带有的生理活性物质，并通过蘑菇菌丝体发酵工艺制造出提高有效成份含量及增强功能性的化妆料组合物。通过本发明，可以研发出鲍鱼蘑菇发酵物及以该发酵物为有效成份含有的具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料组合物。

发明内容

技术问题本发明的目的在于，提供一种利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得的鲍鱼蘑菇发酵物及以该发酵物为有效成份含有的具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料组合物。

技术方案为了实现上述目的，本发明利用蘑菇菌丝体通过发酵工艺制作出鲍鱼蘑菇发酵物，并将这种鲍鱼蘑菇发酵物用于生产化妆品，从而提供了一种含有上述鲍鱼蘑菇发酵物且具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料。

依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物是利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得的。

上述鲍鱼可包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

上述蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其中2种以上混合物构成的组中选择。

依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法包括：(1)利用蘑菇菌丝体对鲍鱼进行接种的接种步骤；(2)对利用蘑菇菌丝体接种的鲍鱼进行发酵的发酵步骤。

上述接种步骤中的鲍鱼可包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

上述接种步骤中的蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其中2种以上混合物构成的组中选择。

在上述接种步骤之前，还可以先执行将上述鲍鱼进行速冻及冷冻干燥的预处理步骤。

在上述预处理步骤和接种步骤之间，还可以执行培养液制作步骤，即将通过上述预处理步骤获得的干燥鲍鱼粉碎并将其与水混合制作出可以培养菌丝体的培养液。

在上述发酵步骤之后，还可以执行使上述发酵步骤中获得的发酵液熟成的熟成步骤。

上述熟成步骤需要将上述发酵液在3至10℃的环境下储藏1至3天。

在上述发酵步骤或上述熟成步骤之后还可以执行将获得的发酵液进行减压浓缩及冷冻干燥使其含水率达到10％从而获得冻干发酵物的后处理步骤。

依据本发明含有利用蘑菇制作的鲍鱼蘑菇发酵物的化妆品组合物以化妆品组合物总重量为基准其有效成份即通过冷冻干燥获得的冻干发酵物的量在0.001至80重量％范围内。

有益效果

本发明提供了鲍鱼蘑菇发酵物、该发酵物的制造方法及以该发酵物为有效成份的化妆料组合物。上述鲍鱼蘑菇发酵物的有效成份含有硫酸软骨素,利用蘑菇菌丝体并通过发酵工艺生成的发酵液受发酵过程中生成的酶作用由高分子化合物转化为低分子化合物，增加了对皮肤有用的物质，其与菌丝体自身的有效成份结合后，可用于制造具有保湿、增强弹性、美白功效的化妆品等用途。

另外，含有上述鲍鱼蘑菇发酵物的化妆料组合物的抗氧化活性、胶原蛋白生成、MMP-1(Matrix metalloproteinase；促进胶原蛋白分解的酶)阻碍效果非常突出，可以发挥改善皮肤皱纹的功效。

具体实施方式

下面，将参照具体的实施例对本发明进行详细说明。

本发明利用蘑菇菌丝体通过发酵工艺制作出鲍鱼蘑菇发酵物，并将这种鲍鱼蘑菇发酵物用于生产化妆品，从而提供了一种含有上述鲍鱼蘑菇发酵物且具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆料。

依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物的特征在于，其为利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得。

上述鲍鱼可包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

上述蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其2种以上混合物构成的组中选择。

依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法包括：(1)利用蘑菇菌丝体对鲍鱼进行接种的接种步骤；(2)使利用蘑菇菌丝体接种的鲍鱼发酵的发酵步骤。

上述接种步骤中的鲍鱼可包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

上述接种步骤中的蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其2种以上混合物构成的组中选择。

在上述接种步骤之前，还可以执行将上述鲍鱼进行速冻及冷冻干燥的预处理步骤。

在上述预处理步骤和接种步骤之间，还可以执行培养液制作步骤，即将通过上述预处理步骤获得的干燥鲍鱼粉碎并将其与水混合制作出可以培养菌丝体的培养液。在上述发酵步骤之后，还可以执行将从上述发酵步骤中获得的发酵液熟成的熟成步骤。

依据本发明含有利用蘑菇制作的鲍鱼蘑菇发酵物的化妆品组合物，以化妆品组合物总重量为基准其有效成份即通过冷冻干燥获得的冻干发酵物的量在0.001至80重量％范围内。

优选地，依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法包括：(1)鲍鱼肉和内脏的速冻及冷冻干燥步骤；(2)将干燥鲍鱼肉与内脏的粉碎物与水混合制作能够培养菌丝体的培养液制作步骤；(3)将蘑菇菌丝体单独接种并发酵的步骤；(4)使发酵液熟成的步骤。通过上述步骤获得的鲍鱼蘑菇发酵物包含有发酵液、将发酵液部分或全部再次进行减压浓缩及冷冻干燥获得的浓缩物、发酵液及浓缩液中含有的发挥主要功效的化学物质本身。

上述鲍鱼将肉质与内脏分离后用水清洗，在-80℃的条件下速冻并进行干燥后将其粉碎制作成细小的粉末。因为将鲍鱼冷冻干燥并制成粉末后使用，不仅保留了鲍鱼的营养成份及功能性成份，而且还能够长期保存，保管也很方便。此外，在增加生理活性成份的同时，还能够充分确保占鲍鱼养殖产量中相当比例的3至4年产养殖鲍鱼的原料供应。

上述鲍鱼蘑菇发酵物经冷冻干燥并粉碎成粉末在稳定的温度环境下与水混合后单独接种蘑菇菌丝体并通过发酵工艺获得发酵液。发酵后，可将发酵液减压浓缩及冷冻干燥后使用。在执行发酵工序后，可以执行低温熟成或者高温熟成的工序。

用于制作上述鲍鱼蘑菇发酵的蘑菇菌丝体可以从由灵芝菇(Ganodermalucidum)的菌丝体、桑黄菇(Phellinuslinteus)的菌丝体、猴头菇(Hericiumerinaceum)的菌丝体、鲍鱼菇(Pleurotuscystidiosus)的菌丝体及其2种以上混合物构成的组中选择。上述蘑菇菌丝体可以向蘑菇菌株及DNA银行(CCDBM)的网站(http://www.wildmush.or.kr/sub/catalog.php？CatNo＝23&Sort＝)申请。

上述接种及发酵步骤就是将培养的蘑菇菌丝体(预培养液)接种到装有上述培养液的发酵槽中。在上述步骤中，按5至15重量％接种蘑菇菌丝体。发酵步骤就是将接种了预培养液的上述培养液在最佳条件(温度24至28℃)下发酵3至10天。接种到装有上述培养液的培养槽中的蘑菇菌丝体根据其菌种类别不同培养及发酵的温度与时间稍微会出现一定的差异。但是，对于该技术领域熟练技术人员来说，能够很容易地选择合适的发酵条件。

上述熟成步骤是使接种了蘑菇菌丝体的鲍鱼提取物发酵的步骤，和根据使用通过制作发酵物步骤获得的发酵物(发酵材料)的成品化方法而追加的步骤。该熟成步骤是将发酵材料在3至10℃的低温条件下进行1至3天的熟成。

依据本发明的化妆料组合物除了含有上述提取物之外，在不损伤本发明产品主要功效的前提下，还可以包含能够提升本发明产品主要功效的其它成份。上述鲍鱼发酵提取物相对于整体组合物而言，以冷冻干燥后的重量为基准，其在组合物中的比重为0.001至80重量％。

依据本发明的鲍鱼蘑菇发酵物可以采用该技术领域公开的技术按照纳米胶囊、微型胶囊、纳米微脂囊等剂型加工成溶液或者粉末形态，本领域技术人员可以在上述浓度范围内对本发明组合物内所含上述溶液或粉末的量进行调节，从而可以将具有保湿、增强弹性、美白及改善皮肤皱纹等功效的组合物用于化妆品、食品、药品等的生产。

本发明的鲍鱼发酵提取物作为皮肤外用剂，其剂型没有特别的限制，既可以用于生产柔软化妆水、营养乳液、营养霜、按摩膏、精油、洗面奶、卸妆水、面膜或者护肤油等基础化妆料，也可以用于生产粉底霜、唇膏、眉毛膏或者隔离霜等色调化妆料。如果将本发明的化妆料用作清洁剂，则可以用于生产洁面乳及沐浴露。

下面，将通过实施例和实验例对本发明的实施情况进行详细说明。所列举的实施例和实验例仅为了有助于对本发明的理解，并不意味着本发明仅限定于此。

实施例1

将购买的生鲍鱼去除粘在皮上的异物后整体进行清洗，将肉与内脏分离，准备好鲍鱼肉与鲍鱼内脏后再清洗一遍，在-80℃的条件下进行速冻，冷冻干燥后将其粉碎成粉末状。

加入相当于干燥后鲍鱼肉和鲍鱼内脏粉末重量10倍量的蒸馏水充分混匀后，将事先培养的蘑菇菌丝体(预培养液；是指为了将鲍鱼菇菌丝体接种到鲍鱼提取物中准备最佳的菌丝体进行培养，就是将鲍鱼菇菌丝体在温度为25℃，振荡速度(ShakingRate)为120RPM的条件下培养3天而得到的收获物)按照10重量％进行接种。然后，在最佳条件(温度为26℃)下发酵5天。为了完成发酵，在80℃条件下加热10分钟，诱导蘑菇菌丝体丧失功能。为了使发酵物熟成，在4℃的低温条件下熟成2天。利用离心分离器除去沉淀物，提取上清液或者将过滤后的上清液在低于60℃的条件下进行减压浓缩使其含水率达到10％以下，冷冻干燥后再使用。

比较例1:制造鲍鱼普通提取物

用作对照组的鲍鱼普通提取物在不采用发酵工艺的情况下通过热水提取工艺提取。即，加入相当于其干燥后重量10倍量的蒸馏水充分混匀后，在80℃的条件下加温3小时进行回流提取，将上清液和沉淀物分离，反复提取3次。将提取物进行冷浸处理后，用具有8μm过滤尺寸的过滤纸进行过滤。将过滤后的萃取液在低于60℃的条件下进行减压浓缩后，利用减压干燥器使其完全干燥，从而获得鲍鱼普通提取物。

比较例2:制造鲍鱼酵母发酵提取物

关于用作对照组的鲍鱼酵母发酵提取物，加入相当于干燥后鲍鱼肉与内脏粉末重量10倍量的蒸馏水充分混匀后，将pH值调节到4.0至5.0至6.5至7.5，添加事先培养的酵母(Bacillus subtilis)使其浓度达到10⁷～10⁸CFU/Ml。将酵母在50至60℃的条件下培养24至72小时，为了完成发酵，在80℃的条件下加热10分钟，诱导酵母丧失功能。利用离心分离器除去沉淀物，提取上清液或者将过滤后的上清液在低于60℃的条件下进行减压浓缩，冷冻干燥后再使用。

实验例1:测定鲍鱼发酵提取物中含有的成份及成份的含量

1-1:测定总苯酚含量及总类黄酮含量

总苯酚含量按如下方法测定。向样品200μl中加入1N福林--肖卡(FolinCiocalteau)试剂200μl，再加入10％碳酸钠溶液200μl，在常温条件下放置10分钟。将反应液150g进行离心分离10分钟，利用酶标仪(microplatereader；美国Chromate公司产品)测定上清液在540nm处的吸光度。在这种情况下，利用没食子酸(galic acid)按0.1％浓度稀释并绘制标准曲线，通过校准曲线计算出样品中总苯酚含量。

总类黄酮含量按如下方法测定。

将样品溶液1％100μl与乙醇300μl、10％硝酸铝溶液20μl、1M乙酸钾溶液20μl、水560μl混合充分搅拌，在室温条件下放置40分钟后，利用酶标仪(美国Chromate公司产品)测定液层在405nm处的吸光度。空白试验利用乙醇溶液代替样品溶液作相同的处理，对照样品(blank)用水代替硝酸铝溶液。在这种情况下，利用槲皮素(Quercetin)按0.05％浓度稀释并绘制标准曲线，通过校准曲线计算出样品中总类黄酮含量，其结果如表1(总苯酚含量及总类黄酮含量)所示。

【表1】

1-2:硫酸软骨素含量

硫酸软骨素依据健康功能食品公典进行测定。即，将样品3g加水稀释到100Ml，提取混合液4Ml加水稀释到20Ml，利用定量分析用滤纸(美国Adventec公司生产)产品5C过滤制作检液。另外再分别向两个比色管内加入硼酸钠试剂5Ml，用冰水充分冷却后，将检液与标准溶液1Ml加入试剂上面，放入冰水中冷却。分别加入咔唑试液0.2Ml进行混合后，利用水浴加热15分钟，用冰水冷却使其温度达到室温程度。将这些液体加水1Ml进行相同的处理制作对照液,利用酶标仪(美国Chromate公司产品)测定其在530nm处的吸光度，其结果如表2(硫酸软骨素含量)所示。

【表2】

样品名称	硫酸软骨素含量(％)
		实施例1	41
比较例1	14
		比较例2	40

实验例2:抗氧化活性

为了测定鲍鱼蘑菇发酵物的抗氧化活性，这里采用“二苯基苦基苯肼；DPPH，2.2-diphenyl-1-picryl hydrazyl”(以下简称“DPPH”)自由基清除能力分析法。将500μM DPPH溶液溶解于乙醇中过滤后马上使用。将制作的DPPH溶液和样品溶液按1：1的比例混合剧烈晃动充分混合后，在常温条件下放置于阴暗处静止20分钟，利用酶标仪(美国Chromate公司产品)测定其在540nm处的吸光度，并通过下述数学公式1计算出DPPH自由基清除率(％)。在这种情况下，作为清除自由基的阳性对照组(positive control)使用1mM的抗坏血酸(ascorbic acid)，其结果如表3(鲍鱼发酵提取物的抗氧化活性)所示。

[数学公式1]

DPPH自由基清除率(scavenging，％)＝((A B))/A*100

在上述公式中，A表示空白试验液的吸光度，B表示检液的吸光度。

【表3】

实验例3:皮肤皱纹改善效果

3-1:评估胶原蛋白生物合成

为了测定样品的成纤维细胞(Fibroblast)内新生成的胶原蛋白(collagen)量而进行原胶原分析(procollagen assay)。将参与胶原蛋白生成的细胞株之一即成纤维细胞利用包含1％抗生素-杀真菌剂(Antibiotic-Antimycotic；AA,大韩民国Welgene公司产品)和10％胎牛血清(FBS；Welgene公司产品)在内的杜尔贝科改良必备培养基(DMEM；Dulbecco's modified essential medium,Welgene公司产品)在37℃，5％二氧化碳培养器(CO₂incubator)中进行培养，将2×10⁵浓度的成纤维细胞接种到6孔板(6well plate)上培养24小时后，除去培养基，处理无血清培养基，饥饿处理(starvation)24小时。经过24小时后，除去无血清培养基，利用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗后，利用312nm波长的紫外线以12.5mJ标准照射。然后，将样品处理成不同的浓度在无酚红杜尔贝科改良必备培养基(phenolred free DMEM)中再培养48小时，将抗坏血酸50μM用作阳性对照，将UV(+)组用作阴性对照(Negative control)，将只处理培养基的组作为对照组(control)，与样品的结果进行比较。对发酵物进行处理后培养48小时，然后收集培养基。将收集的培养基利用原胶原I型C-肽(ProcollagenType-I C-Peptide；PIP)EIA试剂盒(Takara Bio Inc.公司产品MK101)测定其胶原蛋白量。向各个孔(well)中添加抗体-过氧化酶共轭溶液(Antibody-peroxidase conjugate solution)100μl，再加入账样品或标准物质20μl后充分混匀，在37℃的条件下放置3小时。反应结束后除去内容物，然后用磷酸盐缓冲生理盐水400μl清洗4次。清除内容物后，添加基质溶液100μl，在室温条件下使其反应15分钟，然后添加停止液(stop solution)100μl并柔和地混匀，利用酶标仪(Chromate公司产品)测定其在450nm处的吸光度，然后绘制标准浓度曲线并计算出胶原蛋白量，其结果如表4(鲍鱼发酵提取物受紫外线刺激产生胶原蛋白生物合成)所示。

【表4】

如上述表4所示，为了察看发酵物受紫外线刺激而产生的抗皱纹活性，将实施例1、比较例1及比较例2(80℃，3小时)一起进行比较。与比较例1及比较例2相比，可以确认按本发明实施例1处理时新生成的胶原蛋白量增加了。

3-2:MMP-1阻碍评估

分解胶原蛋白的酶种类多样，广为熟知的就是分解胶原蛋白I型(collagen type I)的MMP-1(Matrixmetalloproteinase I,collagenase)。为了对其进行测定，就对MMP-1进行分析。将参与胶原蛋白生成的细胞株之一即成纤维细胞利用包含1％抗生素-杀真菌剂(Welgene公司产品)和10％胎牛血清(Welgene公司产品)在内的杜尔贝科改良必备培养基(Welgene公司产品)在37℃，5％二氧化碳培养器中进行培养，将2×10⁵浓度的成纤维细胞接种到6孔板上培养24小时后，除去培养基，处理无血清培养基并禁食24小时。经过24小时后，除去无血清培养基，利用磷酸盐缓冲生理盐水清洗后，利用UV312nm波长的紫外线以12.5mJ标准照射。然后，将样品处理成不同的浓度在无酚红杜尔贝科改良必备培养基(phenolred freeDMEM)中再培养48小时，将抗坏血酸50μM用作阳性对照，将UV(+)组用作阴性对照，将只处理培养基的组作为对照组，与样品的结果进行比较。对提取物进行处理后培养48小时，然后收集培养基。将收集的培养基利用MMP-1测定试剂盒(英国Amersham Bioscience公司产品RPN2610)并通过酶标仪(ELISA reader)测定其在450nm处的吸光度，向用抗-MMP1抗体(anti-MMP1antibody)涂布的96孔板上的一个孔中添加缓冲剂(buffer)将其作为对照组(blank)，将培养基中游离的样品和标准液100μl注入各个孔中，在室温条件下无需搅拌(shaking)使其反应2小时。利用清洗缓冲剂(Washing buffer)将孔填满，反复清洗3次后，将水气清除干净，添加100μl过氧化酶共轭溶液，在室温条件下无需搅拌使其反应2小时。利用清洗缓冲剂将孔填满意，搅拌30分钟使其反应。利用100μl的1M硫酸(H₂SO₄)使反应终止后，利用酶标仪(Chromate产品)测定其在450nm处的吸光度并进行比较，其结果如表5(鲍鱼酵母发酵提取物受紫外线刺激产生的MMP-1活性阻碍率)所示。

【表5】

如上述表5所示，为了察看发酵物受紫外线刺激产生的抗皱纹活性，将按实施例1处理的情况与按比较例1及比较例2处理的情况一起进行比较(80℃,3小时)，与按比较例1处理的情况相比，可以确认按实施例1处理时MMP-1活性阻碍率更低，这显示了与上述表4中胶原蛋白生物合成相对应的结果。

实验例4:利用干燥器测定保湿力

根据上述实施例1及比较例1分别将5Ml放于孔板上，然后用完全干燥的氯化钙(CaCl₂)作为吸湿剂，在35℃干燥器中测定其重量。重量总共测定144小时，保湿力根据下述数学公式2计算。将作为化妆品搭配的保湿成份即通常使用的1,3-丁二醇(BG)作为对照组，进行比较的实验结果如表6(利用干燥器测定的鲍鱼蘑菇发酵物保湿力)所示。

[数学公式2]

保湿力(％)＝(1-ΔS/S)*100

在这里，S表示初始样本的重量，ΔS表示初始样本的重量减去最终样本的重量所得的值。

【表6】

如上述表6所示，与上述比较例1及1,3-丁二醇相比，本发明鲍鱼蘑菇发酵物的保湿力随着时间的延长而明显增强。

剂型例1:制造乳剂性基剂

制造包含带有上述实施例1中鲍鱼蘑菇发酵物化妆料的乳剂性基剂。用于本实验的化妆料是乳化型化妆液的形态，其组成如表7所示。首先，将表7中记录的鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)及其它含量按不同重量添加，然后对(一)项加热保持90℃，直至将纯净水(30％)加热至90℃为止。然后，将其向(一)项中缓慢添加，通过高速搅拌机使其均匀乳化。然后，将其冷却至室温状态，添加(二)项剩下的纯净水并均匀搅拌制造化妆液。下面，所谓“适量”是指根据制造商的指示或者具有该技术领域常识的人适当选择并容易实施的公认量。

【表7】

实验例5:皮肤保湿评价

5-1:皮肤水份增加效果

为了测定以本发明的鲍鱼蘑菇发酵物为有效成份的化妆品对皮肤的保湿效果，以感觉皮肤干燥的20至40岁女性40名为对象实施问卷调查。将上述剂型例1中制造的化妆料每天2次涂抹在脸上使用1个月，开始涂抹前在恒温恒湿条件(温度20至22℃，相对湿度40％)下利用水份测定仪(德国courageKhazaka electronic GmbH公司产品corneometer CM825)测定皮肤传导度将其作为基本值，经过1周、2周、4周后再测定皮肤传导度，评估保湿的增加率。在这种情况下，作为阳性对照组使用脂质混合物(神经酰胺：胆固醇：脂肪酸＝2：1：1)代替提取物，其结果如表8(皮肤水份增加率(％))所示，其结果值为平均值。

【表8】

试验组	经过1周	经过2周	经过4周
				比较例1	42	53	65
实施例1	53	60	73
				阳性对照组	38	46	62

如上述表8所示，以本发明鲍鱼蘑菇发酵物为有效成份的化妆品组合物的皮肤水份增加率与比较例1相比明显优越，即使与阳性对照组相比也优越。

5-2:皮肤干燥改善评价(问卷)

通过对上述实验例5-1的试验对象开展问卷调查进行主观功效评价，其结果如表9(皮肤干燥改善评价)所示。结果表明，受访对象的主观干燥感改善评价中鲍鱼普通提取物(比较例1)及鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)都表现优秀。

【表9】

实验例6:测定增强皮肤弹性效果

为了测定以本发明鲍鱼蘑菇发酵物为有效成份的化妆品增强皮肤弹性的效果，利用剂型例1中制造的化妆品以10名30至40岁左右的健康成年男女为对象进行考察。在恒温恒湿条件(温度20至22℃，相对湿度40至60％)下接受测试者洗脸后使皮肤稳定1小时再进行测定，需经过在试验初期(baseline)、2周、4周、6周。皮肤的弹性通过利用皮肤弹性测量仪(cutometer SEM474；德国courage Khazaka electronic GmbH公司产品)测定眼眶部位而确定。测定时，音压为500mbar，吸入时间为2秒，反复测定次数为5次，最后取其平均值。其结果如表10(皮肤弹性测定)所示。

【表10】

试验组	皮肤弹性(％)
		实施例1	37
比较例1	12

如上述表10所示，以本发明鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)为有效成份的化妆品与鲍鱼普通提取物(比较例1)相比，皮肤弹性是其3倍左右。

实验例7:皮肤安全度试验

为了测定以本发明鲍鱼蘑菇发酵物为有效成份的化妆品对皮肤的安全性，进行普通的皮肤过敏试验(patch test)。以15名30至40岁左右的健康成年男女为研究对象，将实验例5中制造的化妆品贴敷在胳膊及小臂内侧，经过48小时后，拆去贴布，观察皮肤的状态(刺激程度)。其结果如表11(皮肤安全度测定)所示。

【表11】

实验例8:对人体皮肤的美白效果试验

以10名30至40岁左右的健康成年男女为研究对象，在接受测试者的上臂部位贴上带有直径达到1.5㎝孔的不透明带子，利用相当于每名接受测试者最小红斑量(Minimal Erythema Dose)1.5至2倍左右的紫外线(UVB)进行照射，诱导皮肤变黑。照射后，试验物质各用1％(溶剂为1,3-丁二醇:乙醇＝7:3)，对照组只涂熊果苷2％和溶剂(vehicle),选一个地方什么也不涂，在10周内观察其状态变化。以1周为单位利用色差计(日本美能达(Minolta)公司产品CR2002)测定皮肤的颜色，并根据下述数学公式3计算出涂布开始时和结束时皮肤颜色的差异(ΔL*)。其结果如表12(对皮肤的美白效果)所示。美白效果通过将样品涂布部位与对照组部位的ΔL*进行比较判定，当ΔL*值为2左右时，就可以判定对沉着的色素美白效果显著，如果其值为1.5以上，就可以判定具有美白效果。

[数学公式3]

ΔL*＝涂布结束时的L*值-涂布开始时的L*值

【表12】

试验组	黑色素生成抑制率(％)
		实施例1	1.92±0.13
比较例1	1.16±0.25
		溶剂(Vehicle)	0.50±0.15
熊果苷	1.56±0.11

从上述表12所示结果可以看出，本发明的鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)比鲍鱼普通提取物(比较例1)和阳性对照组即熊果苷均具有更加良好的美白效果。

实验例9:弹性蛋白活性阻碍率试验

根据本发明产品的特性对阻碍皮肤弹性的弹性蛋白酶活性抑制效果进行试验。本试验采用了弹性蛋白酶(美国SIGMA公司产品Elastase)将合成基质即N-琥珀酰三丙氨酸-P-硝基苯胺(NSuccinylTrialanine P-Nitroanilide；SIGMA公司产品)分解使其变黄后利用吸光度测定仪测定其变黄程度并计算出阻碍率的方法。具体讲，首先将提取物溶解于蒸馏水中将其稀释到所需浓度制备好样品，调节0.26M Tris溶液的pH值使其达到8.0准备好缓冲溶液，将弹性蛋白酶基质即N-琥珀酰三丙氨酸-P-硝基苯胺8.8mM添加到缓冲溶液1Ml中制备出基质溶液。利用缓冲溶液使弹性蛋白酶(Elastase)浓度达到10μg/Ml浓度，从准备的样品中取样品25μl与酶25μl、缓冲溶液75μl混合后让其在25℃的条件下预反应10分钟。预反应结束后，添加基质溶液125μl使其在25℃的条件下反应30分钟，然后测定其在405nm处的吸光度。用缓冲溶液代替样品与空白试验液混合，并根据下述数学公式4计算出弹性蛋白酶活性抑制率，从而测定出实施例1、比较例1、比较例2及对照组中鲍鱼菇蘑菇菌丝体提取物的弹性蛋白活性阻碍率，其结果如表13所示。

[数学公式4]

弹性蛋白酶活性阻碍率(％)＝((A B))/A*100

【表13】

从上述表13所示结果可以看出，本发明的鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)比鲍鱼普通提取物(比较例1)和对照组即鲍鱼蘑菇菌丝体的提取物均具有更加良好的弹性蛋白酶阻碍效果。

化妆料组合物的处方例

下面，将根据化妆品剂型列举一些含有本发明鲍鱼蘑菇发酵物(实施例1)具有去除皮肤内活性氧、增强皮肤弹性、美白及改善皱纹等功效化妆料组合物的处方例，处方如下。

剂型例1:制造润肤液(柔软化妆水)

【表14】

原料名称	重量％
		实施例1	1.0
丁二醇	2.5
		油醇	1.5
乙醇	5.0
		聚山梨醇酯80	0.5
聚乙二醇12任烷基酚聚乙二醇醚	0.2
		聚羧乙烯	0.1
丙三醇	3.5
		三乙醇胺	0.1
防腐剂、色素、香料	适量
		纯净水	余量(100以下)

处方例2:制造营养乳液(营养化妆水)

【表15】

原料名称	重量％
		实施例1	1.5

角鲨烷	4.5
		蜜蜡	3.8
三油酸已六脂	1.5
		液态石蜡	0.5
聚山梨醇酯60	1.5
		丁二醇	3.2
三酸甘油脂	5.0
		丙二醇	3.0
丙三醇	3.0
		聚羧乙烯	0.1
三乙醇胺	0.1
		防腐剂、色素、香料	适量
纯净水	余量(100以下)

处方例3:制造精油

【表16】

原料名称	重量％
		实施例1	4.0
丁二醇	3.0
		丙三醇	3.0
尿囊素	0.7
		泛酰醇	0.2
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)	0.05

乙醇	4.0
		三乙醇胺	1.5
角鲨烷	2.0
		蜜蜡	2.0
聚山梨醇酯60	3.0
		聚羧乙烯	1.0
三油酸已六脂	2.8
		防腐剂、色素、香料	适量
纯净水	余量(100以下)

工业应用性

本发明可用于利用鲍鱼的发酵产业及化妆行业。

在上述说明中，仅对本发明记载的具体实施例进行了详细说明。通过上述说明，本领域熟练技术人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内进行多样的变更及修改，这种变更及修改均属于本发明的权利要求范围。

Claims

1.一种鲍鱼蘑菇发酵物，其特征在于：

利用蘑菇菌丝体使鲍鱼发酵而获得。

2.根据权利要求1所述的鲍鱼蘑菇发酵物，其特征在于：

上述鲍鱼包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

3.根据权利要求1所述的鲍鱼蘑菇发酵物，其特征在于：

上述蘑菇菌丝体是从由灵芝菇的菌丝体、桑黄菇的菌丝体、猴头菇的菌丝体、鲍鱼菇的菌丝体及其中2种以上混合物构成的组中选择。

4.一种鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

包括：(1)利用蘑菇菌丝体对鲍鱼进行接种的接种步骤；(2)使利用蘑菇菌丝体接种的鲍鱼发酵的发酵步骤。

5.根据权利要求4所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

上述接种步骤中的鲍鱼包括鲍鱼肉和鲍鱼内脏。

6.根据权利要求4所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

上述接种步骤中的蘑菇菌丝体是从由灵芝菇的菌丝体、桑黄菇的菌丝体、猴头菇的菌丝体、鲍鱼菇的菌丝体及其中2种以上混合物构成的组中选择。

7.根据权利要求4所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

在上述接种步骤之前，还执行将上述鲍鱼进行速冻及冷冻干燥的预处理步骤。

8.根据权利要求7所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

在上述预处理步骤和接种步骤之间，还执行培养液制作步骤，即将通过上述预处理步骤获得的干燥鲍鱼粉碎并将其与水混合制作出可培养菌丝体的培养液。

9.根据权利要求4所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

在上述发酵步骤之后，还执行使上述发酵步骤中获得的发酵液熟成的熟成步骤。

10.根据权利要求9所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

11.根据权利要求4所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

在上述发酵步骤之后，还执行将获得的发酵液进行减压浓缩及冷冻干燥，使其含水率达到10%从而获得冻干发酵物的后处理步骤。

12.根据权利要求9所述的鲍鱼蘑菇发酵物制造方法，其特征在于：

在上述熟成步骤之后，还执行将获得的发酵液进行减压浓缩及冷冻干燥，使其含水率达到10%从而获得冻干发酵物的后处理步骤。

13.一种具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆品组合物，其特征在于：

含有权利要求1至3中任意一项所述的鲍鱼蘑菇发酵物,以化妆品组合物总重量为基准，其有效成份即通过冷冻干燥获得的冻干发酵物的量在0.001 至80重量%范围内。

14.一种具有保湿、增强弹性、美白、改善皮肤皱纹等功效的化妆品组合物，其特征在于：

含有权利要求4至12中任意一项所述的鲍鱼蘑菇发酵物，以化妆品组合物总重量为基准，其有效成份即通过冷冻干燥获得的冻干发酵物的量在0.001 至80重量%范围内。