CN104940115B - 灵芝液体发酵物的新用途及由其制备的化妆品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及灵芝液体发酵物的新用途，具体涉及在制备化妆品中的应用，属于化妆品领域。本发明所解决的技术问题是，提供200610022184.7所公开的“灵芝液体发酵物”的新用途，具体应用于制备具有美白功效的化妆品的应用。具体是具有抑制酪氨酸酶的活性，以及抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，进而起到美白的效果。

Description

灵芝液体发酵物的新用途及由其制备的化妆品

技术领域

本发明涉及灵芝液体发酵物的新用途，具体涉及在制备化妆品中的应用，属于化妆品领域。

背景技术

《中国药典》记载，灵芝性甘，平。归心、肺、肝、肾经。补气安神，止咳平喘。用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食。《本草纲目》记载：“灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙。”据现代药理学研究表明，灵芝具有抗肿瘤、增强免疫、抗衰老、保肝等作用。灵芝作为传统中药材，临床上对多种疾病的治疗都具有较好的疗效。近年来，灵芝多用于具有预防作用的药物或是保健食品，以增强人体免疫能力。灵芝也作为日化的原料，目前市场中有各种类型的灵芝产品，功能都不为美白。迄今为止，还未见灵芝具有美白作用的文献报道。

《中国药典》记载，黄芪性甘，微温。归肺、脾经。补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，性滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌。现代药理学研究证明，黄芪具有抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抑菌、抗病毒等作用。临床黄芪应用较多，多用于益气补气。以黄芪为原料的化妆品具有代表性的为“春娟黄芪霜”，但此产品的主要功能也并无美白功效今为止，还未见黄芪具有美白作用的文献报道。

发明人于2006年申请的中国专利申请灵芝液体发酵物、含该发酵物的组合物及制备方法和用途，申请号为200610022184.7，该灵芝液体发酵物是在培养基中加入重量百分比为1.0～1.2％黄芪制备而得，具有抗疲劳的功效，尚未见其具有美白作用的文献报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，提供200610022184.7所公开的“灵芝液体发酵物”的新用途，具体应用于制备具有美白功效的化妆品的应用。

具体的，所述具有美白功效是指具有抑制酪氨酸酶的活性，以及抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，进而起到美白的效果。

本发明所述的“灵芝液体发酵物”是采用在培养基中加入黄芪制备而得。

进一步地，培养基中加入重量百分比为1.0～1.2％黄芪，更进一步地优选，培养基中加入黄芪重量百分比为1.2％黄芪。其中，黄芪用量是按黄芪的生药量计算。

其中加入的黄芪可以是黄芪原生药材或黄芪粉，也可以是黄芪提取液，优选黄芪水提取液（按常规方法制备而得）。以黄芪提取液为原料制备培养基时，所述黄芪为黄芪水提取液中所含黄芪的生药量。

进一步的，所述灵芝液体发酵物的培养基是采用常见原料提供灵芝生长所需的碳源、氮源等营养物质，具体的，发明人采用的培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1.0～2.0%，蔗糖1.5～2.5%，蛋白胨1.8～2.2%，酵母膏0.5～1%，磷酸氢二钾1.0～1.5%，硫酸镁0.5～0.8%，黄芪1.0～1.2％。

其中，优选培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1%，蔗糖2%、蛋白胨0.2%，酵母膏0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.05%、黄芪1.2%。

本发明所述的灵芝液体发酵物的灵芝来源为赤芝属或紫芝属中的一种或多种。根据《中国药典》（2000年版）规定灵芝包括赤芝（Ganoderma Luciducm）和紫芝（GanodermaSinensis）两个属的灵芝，其它属的虽也有使用但其药理作用有所差异。《中国药典》（2005版灵芝）中灵芝的质量标准制定方法：用水提醇沉法提取灵芝菌丝体粗多糖，采用酚－硫法测定，以葡萄糖作为对照。该灵芝液体发酵物质量指标以发酵物灵芝菌丝体多糖为质量控制标准。

优选灵芝来源为赤芝属。因选用赤芝属灵芝作为发酵菌株，主要有两点优势：其一，发酵过程简单，产量高；其二，发酵物药效较紫芝好。

本发明所述灵芝液体发酵物，其灵芝菌丝体多糖含量为6.0%～9.0%，较培养基中未添加黄芪制备而得的发酵物灵芝菌丝体多糖含量高。其中，该发酵物灵芝菌丝体多糖含量可达7.5%～9.0%。

所得发酵物经过浓缩、过滤后，取滤液得液体提取物，保存备用；或者将所得发酵物浓缩、烘干、粉碎后得粉末状固体提取物，保存备用。

本发明所述灵芝液体发酵物的制备方法，包括如下步骤：

a、制备培养基；取灵芝菌种斜面培养，得灵芝种子菌；

b、将步骤a所得灵芝种子菌接种于步骤a所得培养基中，发酵培养即得发酵物；发酵培养条件为：温度为25℃～29℃、pH值为5.5～6.0；培养时间5～7d。

其中，步骤a中的培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1.0～2.0%，蔗糖1.5～2.5%，蛋白胨1.8～2.2%，酵母膏0.5～1%，磷酸氢二钾1.0～1.5%，硫酸镁0.5～0.8%，黄芪1.0～1.2％。

其中，优选培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1%，蔗糖2%、蛋白胨0.2%，酵母膏0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.05%、黄芪1.2%。

利用本发明所述灵芝液体发酵物具有美白功效的活性，以本发明所述灵芝液体发酵物或其提取物为活性成分，加入化妆品上可接受的原料、辅料制备成化妆品。

本发明制备的化妆品可采用爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等常见的化妆品形式。

采用本发明所述灵芝液体发酵物用于肌肤的护理，通过抑制酪氨酸酶的活性，以及抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，进而起到美白的效果，具有明确的美白功效，由该灵芝液体发酵物按常规方法制备的化妆品也具有明确的美白功效。

附图说明

图1灵芝提取液和黄芪提取液配伍的酪氨酸酶抑制率

图2酪氨酸酶抑制活性

图3黑色素合成抑制率

具体实施方式

本发明灵芝液体发酵物应用于制备具有美白功效的化妆品的应用，其美白功效是指具有抑制酪氨酸酶的活性，以及抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，进而起到美白的效果。

本发明所述的“灵芝液体发酵物”是采用在培养基中加入黄芪制备而得。

灵芝液体发酵物的制备方法，包括如下步骤：

a、制备培养基；取灵芝菌种斜面培养，得灵芝种子菌；

b、将步骤a所得灵芝种子菌接种于步骤a所得培养基中，发酵培养即得发酵物；发酵培养条件为：温度为25℃～29℃、pH值为5.5～6.0；培养时间5～7d。

其中，步骤a中的培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1.0～2.0%，蔗糖1.5～2.5%，蛋白胨1.8～2.2%，酵母膏0.5～1%，磷酸氢二钾1.0～1.5%，硫酸镁0.5～0.8%，黄芪1.0～1.2％。

其中，优选培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1%，蔗糖2%、蛋白胨0.2%，酵母膏0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.05%、黄芪1.2%。

其中，黄芪用量是按黄芪的生药量计算。

其中加入的黄芪可以是黄芪原生药材或黄芪粉，也可以是黄芪提取液，优选黄芪水提取液（按常规方法制备而得）。以黄芪提取液为原料制备培养基时，所述黄芪为黄芪水提取液中所含黄芪的生药量。

灵芝来源为赤芝属或紫芝属中的一种或多种。优选灵芝来源为赤芝属。

本发明所述灵芝液体发酵物，其灵芝菌丝体多糖含量为6.0%～9.0%，较培养基中未添加黄芪制备而得的发酵物灵芝菌丝体多糖含量高。其中，该发酵物灵芝菌丝体多糖含量可达7.5%～9.0%。

所得发酵物经过浓缩、过滤后，取滤液得液体提取物，保存备用；或者将所得发酵物浓缩、烘干、粉碎后得粉末状固体提取物，保存备用。

利用本发明所述灵芝液体发酵物具有美白功效的活性，以本发明所述灵芝液体发酵物或其提取物为活性成分，加入化妆品上可接受的原料、辅料制备成化妆品。

以下为本发明灵芝液体发酵物的制备实例。

实施例1本发明发酵物的制备

原料：麦麸10g、玉米粉10、蔗糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材1g、水1000g。

发酵参数：温度27℃±2℃；pH值6.0；转速180r/min；培养时间6d。

发酵过程：培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。

实施例2本发明发酵物的制备

原料：麦麸10g、玉米粉10、蔗糖5g、豆粕10g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材1g、水1000g。

发酵参数：温度27℃±2℃；pH值6.0；转速150r/min；培养时间7d。

发酵过程：培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。

实施例3本发明发酵物的制备

原料：麦麸15g、蔗糖20g、豆粕10g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材12g、水1000g。

发酵参数：温度27℃±2℃；pH值6.0；转速180r/min；培养时间6d。

发酵过程：培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。

实施例4本发明发酵物的精制

1、本发明发酵物原液的制备：分别取实施例1～3所得的发酵物经搅拌的匀浆2.5L，95℃加热浓缩至1L，过滤，取滤液。

2、本发明发酵物粉的制备：分别取实施例1～3所得的发酵物经搅拌的匀浆30L，95℃加热浓缩至，烘干，粉碎成粉末状，得本发明发酵物粉100g。

以下为本发明所述灵芝液体发酵物的美白功效评价方法及结果

1、样品制备

灵芝提取液的制备：灵芝子实体500g，水提，浓缩，冷冻干燥，实验前将样品溶解成实验所需浓度。

黄芪提取液的制备：黄芪500g，水提，浓缩，冷冻干燥，实验前将样品溶解成实验所需浓度。

灵芝提取液+黄芪提取液混合物的制备：将灵芝提取液和黄芪提取液制备成不同比例（1:2、1:1、2:1），冷冻干燥，实验前将样品溶解成所需浓度。

灵芝液体发酵物制备：按照专利（专利号：200610022184.7）中的实施例1进行发酵物的制备，所得发酵物经搅拌的匀浆2.5L，95℃加热浓缩至1L，过滤，取滤液，得发酵物原液。

2、灵芝提取液与黄芪提取液比例的确定

（1）实验方法

将灵芝提取液和黄芪提取液按照1:2、1:1、2:1的比例混合后，冷冻干燥，将得到的三种样品制备成4mg/mL的浓度，以酪氨酸酶抑制实验为指标，确定灵芝提取液和黄芪提取液的最佳配比。

酪氨酸酶为黑色素合成过程中的关键酶，直接影响黑色素的含量。具有美白作用的物质抑制酪氨酸酶的活性，而抑制黑色素的合成，起到美白的效果。

在各试管中分别加入磷酸缓冲液（pH6.8，0.1mol/L）、样品液、酪氨酸溶液。置于37℃水浴10min，然后加入酪氨酸酶，再于37℃水浴中反应10min，在475nm下测吸光度值。实验体系见表1，C1为空白对照，C2用于空白调零，T1为样品管，T2用于样品调零。

表1酪氨酸酶抑制实验体系加样表

酪氨酸酶抑制率（%）=（A0-A1）/A0×100％

A0：空白对照吸光度值

A1：样品吸光度值

（2）实验结果，见图1。

由图1实验结果可以看出，当灵芝提取液和黄芪提取液配比为1:1时，对酪氨酸酶的抑制活性最强，与1:2和2:1的配比实验结果具有显著性差异。可知，以1:1作为后续试验的配比最好。

3、体外酪氨酸酶抑制实验

（1）实验方法

实验方法同“2、灵芝提取液与黄芪提取液比例的确定”中酪氨酸酶抑制实验的实验方法。

（2）实验结果，见图2和表2。

表2酪氨酸酶抑制率

从图2和表2实验结果可知，灵芝液体发酵物的酪氨酸酶抑制活性随着浓度的增加而增强，其IC₅₀为1.69mg/mL，作用强度与阳性对照熊果苷相当。而与灵芝、黄芪、灵芝与黄芪复配的样品相比，灵芝液体发酵物的作用明显强于前三者，揭示灵芝采用黄芪提取液培养发酵后得到的发酵产物，产生了具有较强酪氨酸酶抑制活性的物质，开发为具有美白作用的化妆品潜力巨大。

4、抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成

（1）实验方法

B16细胞按2.0×10⁴/400Μl/孔，加入24孔板中，培养24h后，加入受试样品，每个样品3个孔，样品终浓度为5、10、20、40、80、160μg/Ml。对照组以培养液代替受试样品。5%CO237℃孵育72h，弃去上清液。加入0.25%的胰酶进行消化，加入培养液终止消化，吹打成单细胞悬液，取部分细胞液进行细胞计数。其余细胞悬液离心后，弃去上清，加入1M NaOH，震荡5min，于490nm出测定吸光度值。

抑制率（%）=[1-（样品孔吸光度值/样品孔细胞密度）/（对照孔吸光度值/对照孔细胞密度）]×100％

（2）实验结果，见图3和表3。

表3黑色素合成抑制率

从实验结果可知，灵芝液体发酵物对黑色素合成的抑制作用随着浓度的增加而增强，其IC₅₀为69.78μg/mL，作用强度与阳性对照熊果苷相当，且高浓度时，对黑色素合成的抑制率高于氢醌。而与灵芝、黄芪、灵芝与黄芪复配的样品相比，灵芝液体发酵物的作用明显强于前三者，揭示灵芝采用黄芪提取液培养发酵后得到的发酵产物，产生了具有较强抑制黑色素合成的物质。说明灵芝液体发酵物具有很强的美白效果。由灵芝液体发酵物为原料，可以采用其发酵物原液或发酵物粉，按常规方法制备的爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等形式的化妆品也有明确的美白功效。

Claims (7)

1.灵芝液体发酵物用于制备具有美白功效的化妆品的用途，其特征在于：所述灵芝液体发酵物是在培养基中加入黄芪制备而得；

所述灵芝液体发酵物的培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、黄芪1.2％。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：灵芝来源为赤芝属或紫芝属中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：灵芝来源为赤芝属。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：所述灵芝液体发酵物是由下述方法制备，包括如下步骤：

a、制备培养基；取灵芝菌种斜面培养，得灵芝种子菌；

b、将步骤a所得灵芝种子菌接种于步骤a所得培养基中，发酵培养即得发酵物；

其中，步骤b所述发酵培养条件为：温度为25℃～29℃、pH值为5.5～6.0；培养时间5～7d。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：步骤a所述培养基含有下述重量百分比的原料：麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、黄芪1.2％。

6.具有美白功效的化妆品，其特征在于：它是以权利要求1～5任一项所述灵芝液体发酵物或其提取物为活性成分，加入化妆品上可接受的原料、辅料制备成化妆品。

7.根据权利要求6所述的具有美白功效的化妆品，所述化妆品为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜或眼膜。