CN101104006A - 一种冬虫夏草菌提取浓缩液的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于冬虫夏草的医药、加工、保健食品技术领域，特别涉及从冬虫夏草无性型菌——中国被毛孢加工得到的冬虫夏草菌提取浓缩液的制备方法，及其在制备各种剂型的免疫增强和免疫调节药物或保健品的应用，可用于治疗肺肾两虚、癌症、化疗后辅助增强免疫力等疾病。本发明的制备方法为：将冬虫夏草无性型菌发酵得到冬虫夏草菌丝，分别经过乙醇提取、水提取、酶解提取后浓缩提取液得到浓缩液，经过喷雾干燥制备成各种剂型，也直接将浓缩液经灭菌后制备成软胶囊，再经包装、检验后即为成品。成品不添加任何添加剂，由100％的冬虫夏草菌提取浓缩成分组成。冬虫夏草菌提取浓缩成分制备成的各种剂型均具有补肾肺两虚、提高免疫力和增强抵抗力等多重功能，对人体免疫系统具有调节稳定的作用，不但适合亚健康人群的常规保健用，尤其对器官移植、癌症放化疗、肺炎、肝炎、慢性肾病和体弱多病人群有明显的功效。
Description
技术领域
本发明属于冬虫夏草的医药、加工、保健食品技术领域，特别涉及冬虫夏草菌提取浓缩液，及其在制备各种剂型的免疫增强和免疫调节药物或保健品的应用，可用于治疗肺肾两虚、癌症、化疗后辅助增强免疫力等疾病。
背景技术
冬虫夏草是我国的一种名贵中药材，与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。所谓冬虫夏草，并非虫与草，而是虫与菌，即生长在我国高寒山地特有的昆虫，蝙蝠蛾(Hepialus spp.)幼虫躯体上的一种子囊真菌。这种真菌属于真菌界的子囊菌门(Ascomycota)和麦角菌科(Clavicipitaceae)等属之一种；其中中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是麦角菌科真菌冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc)的无性型(刘锡进等，1989，冬虫夏草无性阶段的分离和鉴定，真菌学报，8(1)：35-40)。
早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳萎遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。主要用于补肾润肺、益气生津、平衡阴阳、延缓衰老、对防癌抗癌、贫血虚弱、乙肝、提高人体的免疫力起固本作用。既能以食疗方式进补，也适宜当作药品来治疗某些慢性疾病。现代科学发现了冬虫夏草越来越多的神奇功效，冬虫夏草不但对人体各种脏器的功能具有调节作用，还存在某些直接抗病功能。冬虫夏草对免疫系统的具有双向调节作用，使其处于最佳状态。它既能增加免疫系统细胞、组织数量，促进抗体产生，增加吞噬、杀伤细胞数量、增强其功能，又可以调低某些处于异常水平的免疫细胞、免疫因子。免疫功能的异常(下降或过激)是各种疾病发病的根源之一。冬虫夏草发酵制剂在免疫功能方面的治疗已经有着十几年的经验，但是治疗效果显效较慢，服用剂量较大，很不方便。现有制备方法往往又局限于单成分或单方法的应用，导致最后的成品在临床上服用时间长、显效慢。
如专利申请号为93112049.7，发明名称为北冬虫夏草提取液及其制备方法的专利申请，公开了一种用于医药保健、饮食、化妆品原料的北冬虫夏草提取液及其制备方法。该提取液以水为溶剂，基本含有北冬虫夏草30～40％、95％的食用乙醇30～40％。将北冬虫夏草干品用乙醇或丙酮浸泡7～10天，过滤，滤液蒸馏至干，得醇溶液，滤渣经三次水煎出，滤液合并减压浓缩至原虫草重量的1.5～3倍，将醇液和水提取液合并即得北冬虫夏草提取液。上述发明周期长，同时没有真正的提取到冬虫夏草的精华，制剂含有乙醇，对酒精过敏的人群不适用。
又如专利申请号为200610050272.8，发明名称为一种冬虫夏草发酵菌粉的制备方法的专利申请，公开了一种冬虫夏草发酵菌粉的制备方法，该冬虫夏草来自中国农业微生物菌种保藏管理中心、保藏号为ACCC50560，包括以下步骤：1)配制固体培养基：先由重量含量为82～88％的米、8～12％的麸皮、3～4％的大豆粉和1～2％的硫酸铵组成固体原料；然后将固体原料粉碎后加入0.9～1.1重量比的水，再进行灭菌及冷却；2)发酵：在无菌条件下，将培养好的冬虫夏草液体种子按照1.5～2.5％的重量比接种至厚度为4.5～5.5cm的固体培养基上，在20～22℃条件培养7～10天；将所得的白色菌丝在40～50℃条件下干燥并粉碎即得冬虫夏草发酵菌粉。上述发明注重培养方面，而对后期加工用简单的干燥并粉碎，没有真正的发挥冬虫夏草的作用。
针对现有技术的不足，本发明采用多重提取方法，并浓缩了冬虫夏草菌丝的有效物质，少量服用即可对人体起到全面的免疫增强作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便捷、高效的冬虫夏草菌提取浓缩液的制备方法，得到的浓缩液可应用于免疫增强和免疫调节的药物或保健品，大大的提高了病患者或保健者对冬虫夏草菌使用的吸收利用，以及提高使用的方便性和依从性。
本发明的技术方案是：将冬虫夏草无性型菌发酵得到冬虫夏草菌丝，分别经过乙醇提取、水提取、酶解提取后浓缩提取液得到提取浓缩液。通过将三种方法的组合，出人意料的取得了良好的效果。
本发明提供的提取浓缩液的制备方法具体是：采用低温发酵技术，将冬虫夏草菌丝接种于发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉；将冬虫夏草菌丝菌粉分别经过乙醇提取、水提取、酶解提取并浓缩得到的液体合并后进行均质化处理，即得提取浓缩液。
其中所述的发酵方法是：从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草的无性型：中国被毛孢，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。上述分离菌种的方法是本领域公知的，可参考刘锡进等，1989，冬虫夏草无性阶段的分离和鉴定，真菌学报，8(1)：35-40。上述低温培养发酵、离心和干燥等方法参见《中国冬虫夏草研究》(柯传奎，中国科学技术出版社2005年)。
其中所述的提取浓缩方法是：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加6～1 5倍重量的药用乙醇，浸泡24～48小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入6～15倍重量的纯水，加热至90～98℃后维持2～6小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用3～7倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.5～1％的胰酶，在搅拌和控制温度为30～60℃下，酶解30～70分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。更具体的是：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加8～12倍重量的药用乙醇，浸泡28～40小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8～10倍重量的纯水，加热至92～96℃后维持3～5小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用3～7倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.5～1％的胰酶，在搅拌和控制温度为40～50℃下，酶解40～60分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
优选为：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加9～11倍重量的药用乙醇，浸泡32～40小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8～10倍重量的纯水，加热至93～96℃后维持3～5小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用4～6倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.6～0.9％的胰酶，在搅拌和控制温度为40～50℃下，酶解40～60分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
上述的冬虫夏草菌丝提取浓缩液在制备免疫增强和免疫调节药物或保健品中的应用。所述药物或保健品为片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、散剂、颗粒剂、钉剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂。
本发明的关键是采用特定的冬虫夏草菌提取工艺、制备工艺制备成药物或保健品，使其具有增强免疫和调节免疫功能的疗效。本发明提供的一种由冬虫夏草菌丝提取浓缩制备成的免疫增强和免疫调节药物或保健品，经中科院微生物研究所鉴定，其DNA指纹图谱与天然冬虫夏草的指纹图谱对比相似度为97％，各种理化指标和药理、药化性状与天然冬虫夏草几乎一致。
本发明制备方法采用三种提取方法，进行优化组合，采用最佳的工艺组合，通过大量的实验摸索出最佳的制备方法，得到的产物——冬虫夏草提取浓缩液与常规方法提取的浓缩液经过动物实验证明，其药效更加明确，活性物质含量更高。本发明产品一种由冬虫夏草菌丝提取浓缩制备成的免疫增强和免疫调节药物或保健品更加浓缩了冬虫夏草菌的有效成分，是天然冬虫夏草的最佳替代品。本发明一种由冬虫夏草菌丝提取浓缩制备成的免疫增强和免疫调节药物或保健品具有补肾肺两虚、提高免疫力和增强抵抗力等多重功能，对人体免疫系统具有调节稳定的作用，不但适合亚健康人群的常规保健用，尤其对器官移植、癌症放化疗、肺炎、肝炎、慢性肾病和体弱多病人群有明显的功效。
综上所述，本发明采用冬虫夏草菌提取浓缩制备成的免疫增强和免疫调节药物或保健品，对调节免疫功能具有显著的疗效。动物试验表明：冬虫夏草菌丝提取浓缩制备成的免疫增强和免疫调节药物或保健品具有显著增强免疫功能的作用。
具体实施方式
实施例一
冬虫夏草菌丝发酵：
从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草【Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc】的无性型：中国被毛孢【Hirsutellasinensis】，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
冬虫夏草菌提取浓缩液：
将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加6倍重量的药用乙醇(75％)，浸泡48小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入6倍重量的纯水，加热至90℃后维持6小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用3倍重量纯水混匀，调pH＝8，再加入干物质重量之0.5％的胰酶，在搅拌和控制温度为50℃下，酶解70分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
实施例二
冬虫夏草菌丝发酵：
从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草【Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc】的无性型：中国被毛孢【Hirsutellasinensis】，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
冬虫夏草菌提取浓缩液：
将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加8倍重量的药用乙醇(75％)，浸泡40小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8倍重量的纯水，加热至92℃后维持4小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用5倍重量纯水混匀，调pH＝7，再加入干物质重量之0.7％的胰酶，在搅拌和控制温度为40℃下，酶解50分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
实施例三
冬虫夏草菌丝发酵：
从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草【Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc】的无性型：中国被毛孢【Hirsutellasinensis】，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
冬虫夏草菌提取浓缩液：
将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加15倍重量的药用乙醇(75％)，浸泡24小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入15倍重量的纯水，加热至98℃后维持6小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用7倍重量纯水混匀，调pH＝6，再加入干物质重量之1.0％的胰酶，在搅拌和控制温度为50℃下，酶解40分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
实施例四
冬虫夏草菌丝发酵：
从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草【Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc】的无性型：中国被毛孢【Hirsutellasinensis】，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
冬虫夏草菌提取浓缩液：
将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加10倍重量的药用乙醇(75％)，浸泡32小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入9倍重量的纯水，加热至95℃后维持3小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用5倍重量纯水混匀，调pH＝7，再加入干物质重量之0.8％的胰酶，在搅拌和控制温度为45℃下，酶解60分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
实施例五
冬虫夏草菌丝发酵：
从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草【Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc】的无性型：中国被毛孢【Hirsutellasinensis】，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
冬虫夏草菌提取浓缩液：
将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加12倍重量的药用乙醇(75％)，浸泡24小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8倍重量的纯水，加热至96℃后维持4小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用6倍重量纯水混匀，调pH＝7.5，再加入干物质重量之0.6％的胰酶，在搅拌和控制温度为40℃下，酶解50分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
实验例一：小鼠体液免疫的影响试验
实验组：本发明实施例3得到的冬虫夏草菌提取浓缩液
对照组：采用常规方法得到的冬虫夏草菌水提和醇提浓缩液
选用昆明二级小鼠，雌性，18-22g，按体重随机分组，每组15只。冬虫夏草菌丝提取浓缩液(实施例3)的人体推荐剂量为0.02g/d·kg体重的定型产品。小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。采取灌胃法，每日灌胃一次，对照组。各组小鼠连续给予受试物30天后，测定各项指标。经口给予小鼠冬虫夏草菌丝提取浓缩液30天后，与对照组比较，实验组的淋巴细胞增殖能力提高77.8％(p＜0.05)，足趾肿胀度提高43.5％(p＜0.05)。HC50提高165.5％(p＜0.01)，巨噬细胞吞噬率和吞噬指数分别提高37.0％(p＜0.05)和40.3％(p＜0.05)，实验前后，胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、抗体生成细胞数量均无显著差异(p＞0.05)
表一、本品对小鼠体液免疫的影响
| 组别 | 剂量(g/d·kg体重) | PFC# | 半数溶血值 |
| 水提对照组 | 0 | 4.96±0.35 | 63.5±62.3 |
| 醇提对照组 | 0 | 4.99±0.51 | 83.5±55.8 |
| 实验组 | 0.0100 | 5.20±0.42 | 168.6±80.4* |
#空斑数/全脾。
*与对照组比较有非常显著差异(p＜0.01)。
由表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，实验组的HC50提高165.5％(p＜0.01)，各组的PFC无显著差异(p＞0.05)。
实验例二：小鼠细胞免疫的影响试验
表二、本品对小鼠细胞免疫的影响
| 组别 | 剂量(g/d·kg体重) | 淋巴细胞增殖能力# | 足趾肿胀差值(/mm) |
| 空白对照组 | 0 | 0.072±0.048 | 0.46±0.15 |
| 醇提对照组 | 0 | 0.086±0.022 | 0.48±0.20 |
| 实验组 | 0.0100 | 0.128±0.058* | 0.66±0.25* |
#单位为光密度值。
*与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)
由表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，实验组淋巴细胞增殖能力及足趾肿胀度分别提高77.8％(p＜0.05)和43.5％(p＜0.05)。
Claims (8)
1.一种冬虫夏草菌提取浓缩液的制备方法，其特征在于所述方法是：将冬虫夏草无性型菌发酵得到冬虫夏草菌丝，分别经过乙醇提取、水提取、酶解提取后浓缩提取液得到提取浓缩液。
2.根据权利要求1所述的提取浓缩液的制备方法，其特征在于所述方法是：采用低温发酵技术，将冬虫夏草菌丝接种于发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉；将冬虫夏草菌丝菌粉分别经过乙醇提取、水提取、酶解提取并浓缩得到的液体合并后进行均质化处理，即得提取浓缩液。
3.根据权利要求1或2所述的提取浓缩液的制备方法，其特征是：从青藏高原新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草的无性型：中国被毛孢，将得到的冬虫夏草菌接种于消毒后的发酵罐中，经低温培养基液体发酵培养得到冬虫夏草菌丝体，再离心过滤、干燥和粉碎得到发酵冬虫夏草菌菌粉。
4.根据权利要求1或2所述的提取浓缩液的制备方法，其特征是：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加6～15倍重量的药用乙醇，浸泡24～48小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入6～15倍重量的纯水，加热至90～98℃后维持2～6小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用3～7倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.5～1％的胰酶，在搅拌和控制温度为30～60℃下，酶解30～70分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
5.根据权利要求4所述的提取浓缩液的制备方法，其特征是：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加8～12倍重量的药用乙醇，浸泡28～40小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8～10倍重量的纯水，加热至92～96℃后维持3～5小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用3～7倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.5～1％的胰酶，在搅拌和控制温度为40～50℃下，酶解40～60分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
6.根据权利要求5所述的提取浓缩液的制备方法，其特征是：将冬虫夏草菌发酵得到冬虫夏草菌菌粉，添加9～11倍重量的药用乙醇，浸泡32～40小时，过滤得到乙醇提取液，减压浓缩，得到乙醇提取浓缩液；过滤得到的残渣加入8～10倍重量的纯水，加热至93～96℃后维持3～5小时，过滤得到水提液，减压浓缩，得到水提浓缩液；将残渣用4～6倍重量纯水混匀，调pH＝6～8，再加入干物质重量之0.6～0.9％的胰酶，在搅拌和控制温度为40～50℃下，酶解40～60分钟，经离心得到酶提液，减压浓缩得到酶提浓缩液；将上述三种提取浓缩液合并后进行均质化处理，即得冬虫夏草菌提取浓缩液。
7.权利要求1～6之任一所得的冬虫夏草菌丝提取浓缩液在制备免疫增强和免疫调节药物或保健品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述药物或保健品为片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、散剂、颗粒剂、钉剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂。
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