CN106491661A - 一种鲜虫草原浆的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种鲜虫草原浆的提取方法，通过发酵、干燥破碎、酶解、超声提取、离心分离、煎煮、浓缩干燥、纯化等步骤制得，大大提高了鲜虫草中虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、SOD等有效成分的含量，虫草素提取率为0.028％，虫草酸的提取率为2.14％，虫草多糖的提取率为10.78％，腺苷的提取率0.21％。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种鲜虫草原浆的提取方法。
背景技术
冬虫夏草，为蝙蝠蛾幼虫被虫草菌感染死后，尸体、组织与菌丝结成坚硬的假菌核，在冬季低温干燥土壤内保持虫形不变达数月之久(冬虫)，待夏季温湿适宜时从菌核长出棒状子实体(子囊座)并露出地面(夏草)，又名中华虫草，又称为夏草冬虫，简称虫草，是中国传统的名贵药材。真正的冬虫夏草均为野生，它主要产于中国青海、西藏、新疆、四川、云南、甘肃、冬虫夏草含水分10.84％，脂肪8.4％，粗蛋白25.32％，粗纤维18.53％，碳水化物28.90％，灰分4.10％。脂肪含饱和脂肪酸13.00％，不饱和脂肪酸82.2％。此外，还含虫草酸约7％，是奎宁酸的异构物，又含冬虫夏草素，是一种淡黄色结晶粉末，在试管内能抑制链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌及葡萄状球菌的生长。另含维生素B120.29微克/100克，尚含有麦角脂醇、六碳糖醇、生物碱等。是著名的滋补强壮药，常用肉类炖食，有补虚健体之效。适用于治疗肺气虚和肺肾两虚、肺结核等所致的咯血或痰中带血、咳嗽。气短、盗汗等，对肾虚阳痿、腰膝酸疼等亦有良好的疗效，也是老年体弱者的滋补佳品。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提出了一种鲜虫草原浆的提取方法，大大提高了鲜虫草中虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、SOD等有效成分的含量，虫草素提取率为0.028％，虫草酸的提取率为2.14％，虫草多糖的提取率为10.78％，腺苷的提取率0.21％。
为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案：
鲜虫草原浆的提取方法，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在24-27℃、pH值为5.8-6.5条件下，发酵处理60-72h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶10-15，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.3-1.5％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为50-70％，然后在50-80kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其3-5倍质量的50-70％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其5-6倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1-1.5h，进行离心分离并将两次的提取液合并得共混液；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.1-1.5g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，得结晶物即可。
优选的，步骤1)中发酵培养基的主要营养成分为：玉米粉1.5％、酵母膏1％、蛋白胨2％、蔗糖4％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.08％、柠檬酸铁胺0.005％、碳酸钙0.01％、真菌多糖0.002％。
优选的，所述真菌多糖为青霉多糖、曲霉多糖、疫霉多糖、灰霉多糖中的一种或两种及其以上的组合物。
优选的，步骤1)中鲜虫草菌株的接种量为5-8％。
优选的，步骤3)中复合酶包括木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶，所述木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为：(2-2.5)∶(1.5-2)∶1∶(1-2)。
优选的，步骤3)中酶解温度为45-55℃，酶解时间为5-8h，酶解pH值为5.6-5.8。
优选的，步骤4)中分段超声提取具体为先以70℃超声提取20min，再降温至65℃提取30min，最后回升至75℃提取20min。
优选的，步骤5)中两次离心分离均为离心转速3000-3500r/min，离心时间20-25min，二次分段超声提取的操作与步骤4)中的分段超声处理相同。
优选的，步骤6)中离心分离的离心转速为2500-2800r/min，离心时间为15-20min。
优选的，步骤7)中膜过滤压力为0.06-0.08MPa，使用的过滤膜孔径为400-600nm。
由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：本发明通过发酵、干燥破碎、酶解、超声提取、离心分离、煎煮、浓缩干燥、纯化等步骤制得，在获得虫草菌丝体之前先对虫草菌株进行发酵培养，优化营养成分，大大提高了鲜虫草中虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、SOD等有效成分的含量，如蛋白胨、酵母膏、玉米粉做为氮源的同时，虫草菌素的含量提高了32.5％，另外，以蔗糖为碳源也有利于虫草素的提高。柠檬酸铁胺相较无机铁更容易吸收，真菌多糖有利于促进虫草活性物质的积累。
提取浓缩前采用破碎、酶解，破坏了细胞壁等保护屏障，大大提高了虫草中活性物质的释放速率和释放量，提高了虫草有效成分的提取得率。
酶解后采用多次分段超声提取和离心分离处理，然后在进行高温煎煮，有效降低了对热敏物质的破坏，提取率高，制备过程中采用减压干燥、减压浓缩、冷冻干燥也有利于保留有效成分。另外，分离和浓缩间增加有膜过滤的步骤，大大提高了提取物的纯度。
本发明提取方法提取的虫草素提取率大于0.028％，虫草酸的提取率大于2.14％，虫草多糖的提取率大于10.78％，腺苷的提取率大于0.21％，各提取物纯度均大于96.4％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
鲜虫草原浆的提取方法，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在25℃、pH值为6.0条件下，发酵处理70h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；其中，接种量为6％，发酵培养基的真菌多糖为曲霉多糖和灰霉多糖的组合物；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体在压力为0.05MPa条件下进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶10，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.3％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为2∶1.8∶1∶1.5，酶解温度为50℃，酶解时间为7h，酶解pH值为5.8；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为65％，然后在75kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其5倍质量的65％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；其中，两次离心分离均为离心转速3000r/min，离心时间20min；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其5倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1h，进行离心分离，并将两次的提取液合并得共混液；其中，离心分离的离心转速为2800r/min，离心时间为18min；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.4g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；其中，膜过滤压力为0.065MPa，使用的过滤膜孔径为500nm；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，然后用无水乙醇洗涤2次，得结晶物即可。
本实施例提取的虫草素提取率为0.03％，虫草素纯度为98.7％，虫草酸的提取率为2.14％，虫草酸纯度为97.2％，虫草多糖的提取率为10.82％，虫草多糖纯度为96.5％，腺苷的提取率为0.23％，腺苷纯度为97.3％。
实施例2：
鲜虫草原浆的提取方法，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在24℃、pH值为5.8条件下，发酵处理72h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；其中，接种量为5％，发酵培养基的真菌多糖为曲霉多糖和疫霉多糖的组合物；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体在压力为0.06MPa条件下进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶12，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.5％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为2.3∶2∶1∶1，酶解温度为45℃，酶解时间为8h，酶解pH值为5.7；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为50％，然后在60kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其3倍质量的50％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；其中，两次离心分离均为离心转速3200r/min，离心时间25min；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其6倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1.2h，进行离心分离，并将两次的提取液合并得共混液；其中，离心分离的离心转速为2600r/min，离心时间为20min；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.3g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；其中，膜过滤压力为0.07MPa，使用的过滤膜孔径为450nm；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，然后用无水乙醇洗涤2次，得结晶物即可。
本实施例提取的虫草素提取率为0.032％，虫草素纯度为99.3％虫草酸的提取率为2.17％，虫草酸纯度为97.4％，虫草多糖的提取率为10.78％，虫草多糖纯度为98.4％，腺苷的提取率为0.21％，腺苷纯度为96.9％。
实施例3：
鲜虫草原浆的提取方法，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在27℃、pH值为6.2条件下，发酵处理65h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；其中，接种量为8％，发酵培养基的真菌多糖为曲霉多糖；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体在压力为0.035MPa条件下进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶15，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.4％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为2.5∶1.5∶1∶1.8，酶解温度为55℃，酶解时间为5h，酶解pH值为5.6；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为70％，然后在50kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其4倍质量的70％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；其中，两次离心分离均为离心转速3500r/min，离心时间22min；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其5倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1.5h，进行离心分离，并将两次的提取液合并得共混液；其中，离心分离的离心转速为2700r/min，离心时间为15min；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.5g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；其中，膜过滤压力为0.06MPa，使用的过滤膜孔径为400nm；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，然后用无水乙醇洗涤1次，得结晶物即可。
本实施例提取的虫草素提取率为0.028％，虫草素纯度为98.2％，虫草酸的提取率为2.19％，虫草酸纯度为98.1％，虫草多糖的提取率为10.79％，虫草多糖纯度为97.5％，腺苷的提取率为0.22％，腺苷纯度为96.4％。
实施例4：
鲜虫草原浆的提取方法，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在26℃、pH值为6.5条件下，发酵处理60h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；其中，接种量为6％，发酵培养基的真菌多糖为曲霉多糖、青霉多糖和灰霉多糖的组合物；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体在压力为0.04MPa条件下进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶10，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.45％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为2.2∶2∶1∶2，酶解温度为48℃，酶解时间为6h，酶解pH值为5.6；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为60％，然后在80kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其5倍质量的60％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；其中，两次离心分离均为离心转速3400r/min，离心时间20min；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其5.5倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1.2h，进行离心分离，并将两次的提取液合并得共混液；其中，离心分离的离心转速为2500r/min，离心时间为17min；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.1g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；其中，膜过滤压力为0.08MPa，使用的过滤膜孔径为600nm；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，然后用无水乙醇洗涤2次，得结晶物即可。
本实施例提取的虫草素提取率为0.029％，虫草素纯度为98.9％，虫草酸的提取率为2.18％，虫草酸纯度为98.1％，虫草多糖的提取率大于10.84％，虫草多糖纯度为98.2％，腺苷的提取率为0.25％，腺苷纯度为97.6％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.鲜虫草原浆的提取方法，其特征在于，提取步骤如下：
1)发酵：挑选鲜虫草菌株，接种到发酵培养基上，在24-27℃、pH值为5.8-6.5条件下，发酵处理60-72h，分离得发酵液和发酵虫草菌丝体；
2)干燥破碎：将步骤1)中的发酵虫草菌丝体在压力为0.035-0.06MPa条件下进行减压干燥至含水量小于6％，然后进行超微粉碎，过400目筛即可，得发酵虫草菌丝体粉末；
3)酶解：向步骤2)中的发酵虫草菌丝体粉末加入纯水，发酵虫草菌丝体粉末与纯水的体积比为1∶10-15，然后再加入发酵虫草菌丝体粉末质量1.3-1.5％的复合酶，进行酶解得虫草酶解液；
4)超声提取：向步骤3)中的虫草酶解液中加入无水乙醇至乙醇含量为50-70％，然后在50-80kHz条件下进行分段超声处理，得虫草提取混合物；
5)离心分离：将步骤4)中的虫草提取混合物进行离心分离处理，静置取上清液，并向沉降物中加入其3-5倍质量的50-70％的乙醇溶液，进行二次分段超声提取和离心分离，得二次上清液和二次沉降物；
6)煎煮：向步骤5)中的二次沉降物中加入其5-6倍质量的纯水，煎煮提取2次，每次1-1.5h，进行离心分离，并将两次的提取液合并得共混液；
7)浓缩干燥：将步骤5)中的上清液、二次上清液与步骤1)中的发酵液、步骤6)中的共混液合并，再进行膜过滤，并将过滤液减压浓缩至浓缩比重为1.1-1.5g/ml，再进行冷冻干燥得鲜虫草原浆粗品；
8)纯化：将步骤7)中鲜虫草原浆粗品用95％的乙醇重结晶3次，然后用无水乙醇洗涤1-2次，得结晶物即可。
2.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤1)中发酵培养基的主要营养成分为：玉米粉1.5％、酵母膏1％、蛋白胨2％、蔗糖4％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.08％、柠檬酸铁胺0.005％、碳酸钙0.01％、真菌多糖0.002％。
3.根据权利要求2所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：所述真菌多糖为青霉多糖、曲霉多糖、疫霉多糖、灰霉多糖中的一种或两种及其以上的组合物。
4.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤1)中鲜虫草菌株的接种量为5-8％。
5.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤3)中复合酶包括木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶，所述木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶之间的质量比为：(2-2.5)∶(1.5-2)∶1∶(1-2)。
6.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤3)中酶解温度为45-55℃，酶解时间为5-8h，酶解pH值为5.6-5.8。
7.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤4)中分段超声提取具体为先以70℃超声提取20min，再降温至65℃提取30min，最后回升至75℃提取20min。
8.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤5)中两次离心分离均为离心转速3000-3500r/min，离心时间20-25min，二次分段超声提取的操作与步骤4)中的分段超声处理相同。
9.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤6)中离心分离的离心转速为2500-2800r/min，离心时间为15-20min。
10.根据权利要求1所述的鲜虫草原浆提取方法，其特征在于：步骤7)中膜过滤压力为0.06-0.08MPa，使用的过滤膜孔径为400-600nm。
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