CN104739919A - 一种发酵黄芪复合制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵黄芪复合制剂，由以下重量份的原料制成：发酵黄芪粉200-300份、板蓝根20-30份、紫锥菊15-25份、维生素C3-8份、酵母硒80-120份、酵母多糖40-60份、辅美粉500-600份；所述发酵黄芪粉是将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35在黄芪水溶液中混合发酵培养，发酵产物经冷冻干燥制备而成。本发明还公开了该发酵黄芪复合制剂的制备方法。本发明的发酵黄芪复合制剂能全面启动动物自身免疫机制，提高免疫力和抗应激能力，缩短患病动物恢复周期，降低动物死淘率，提高动物生产性能，并且绿色、安全、高效、无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵黄芪复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术
黄芪是中医药学中的一味重要药材，始载于《神农百草经》。《中国药典》(2010年版)规定药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。
黄芪多糖为黄芪的有效成分之一，具有免疫调节作用，能提高对抗原的免疫应答能力及淋巴细胞的转化率，并增强巨噬细胞的吞噬能力。但现有的黄芪加工的方法，黄芪多糖的提取率相对较低，已成为制约黄芪药材进一步应用的技术瓶颈。
在免疫应答过程中无论是对自身固有成分的耐受，还是对异己抗原的排斥都是在机体免疫调节机制的控制下进行的。如果免疫调节发生异常：当免疫应答过强，容易导致机体对异己抗原产生高度免疫应答，从而导致超敏反应；而当免疫应答较弱时，机体对外来入侵物质不能正常反应、清除，便会降低机体的抗感染能力，导致免疫抑制。免疫调节机制对于机体内环境的稳定性至关重要，对于机体各项生理功能的正常发挥有着重要的意义。然而，在现实养殖过程中，往往存在免疫抑制，单一的疫苗、化学药物防治不能够将其解除，且欧盟1999年立法铭文禁止使用除黄霉素、阿维拉霉素、莫能菌素和杆菌清之外的所有抗菌性和抗球虫药饲料添加剂，因此，寻找一种新型安全、无公害、绿色的提高动物免疫力的饲料添加剂是目前的热点和难点。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种发酵黄芪复合制剂及其制备方法，该复合制剂能全面启动动物自身免疫机制，提高免疫力和抗应激能力，缩短患病动物恢复周期，降低动物死淘率，提高动物生产性能，并且绿色、安全、高效、无毒副作用。
本发明的另一目的是提供该发酵黄芪复合制剂在制备提高动物免疫力的饲料添加剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种发酵黄芪复合制剂，由以下重量份的原料制成：
发酵黄芪粉 200-300份、板蓝根 20-30份、紫锥菊 15-25份、维生素C 3-8份、酵母硒 80-120份、酵母多糖 40-60份、辅美粉 500-600份。
所述发酵黄芪粉是将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35在黄芪水溶液中混合发酵培养，得到的发酵产物经冷冻干燥制备而成。
所述枯草芽孢杆菌B7348(Bacillus subtilis B7348)，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102120975B)中。
所述枯草芽孢杆菌N9-1-35(Bacillus subtilis N9-1-35)，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011301；记载在申请人的另一项专利“一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102329749B)中。
优选的，该发酵黄芪复合制剂，由以下重量份的原料制成：
发酵黄芪粉 250份、板蓝根 25份、紫锥菊 20份、维生素C 5份、酵母硒 100份、酵母多糖 50份、辅美粉 550份。
该发酵黄芪复合制剂的制备方法，步骤为：
(1)发酵黄芪粉的制备：
将黄芪粉碎后，过80目筛，加水制成质量浓度为5-7％的黄芪水溶液，灭菌，冷却，按体积比为2％的接种量分别接种枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的种子液，进行发酵培养，发酵完成后，发酵产物采用真空冷冻干燥法制成发酵黄芪粉；
(2)将板蓝根、紫锥菊粉碎，过80目筛，混合均匀，制成复合中药粉末；
(3)将步骤(1)制备的发酵黄芪粉、步骤(2)制备的复合中药粉末、维生素C、酵母硒、酵母多糖和辅美粉混合均匀，即得。
步骤(1)中，枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35种子液的制备方法为：分别将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35接种于芽孢杆菌斜面上，之后用接种环挑取少许到100mL锥形瓶中，置于37℃，220rpm摇床上，震荡培养24h；之后将锥形瓶内的枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的菌液分别按照体积比为2％的接种量接种到3L大锥形瓶中于摇床上震荡培养24h，分别得到枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35种子液。
优选的，步骤(1)中，黄芪水溶液的质量浓度为6％。
优选的，步骤(1)中，发酵培养的条件为：发酵时间为25-30h，发酵温度为37℃，pH为5.0-5.5。
优选的，发酵时间为28h。
本发明的发酵黄芪复合制剂的活菌总数大于或者等于1×108cfu/g。
本发明的发酵黄芪复合制剂可用于制备提高动物免疫力的饲料添加剂，具体方法为：在基础饲料中按质量分数为1-3‰加入本发明的发酵黄芪复合制剂，混匀，即得。
本发明的发酵黄芪复合制剂中，各成分的功效作用如下：
黄芪：归肺、脾、肝、肾经。味甘、性温、有补气升阳、固表止汗、托脓排毒和生肌的功效。现代医学发现其药理作用甚广，具有增加机体免疫功能、抗肿瘤、固肾降压、保肝抗炎、治疗心血管疾病等功能。
枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35：自身发酵后能产生多种有益代谢产物，如酶、有机酸、细菌素、维生素、多肽抗生素等，且进入肠道后，短期内形成优势菌群，建立微生态平衡，促进有益菌繁殖，抑制有害菌生长，有效提高动物免疫力。
发酵黄芪：中药黄芪经过枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35发酵后，能将黄芪的有效成分转化成利于吸收的小分子物质，利于吸收和利用，并且还能改善黄芪的适口性，利于饲喂。
板蓝根：归肝、胃经，性苦、寒，具有清热、解毒、凉血、利咽之功效。药理作用广泛：抗菌抗病毒、解毒、提高机体免疫，板蓝根多糖能明显增强抗体形成细胞功能，解除免疫抑制。
紫锥菊：国际上流行的免疫调节剂，以其免疫刺激作用闻名于世，被广泛用于感冒、咳嗽、支气管炎的预防以及病毒感染等导致的功能失调的治疗。其活性成分为多糖、酰胺类化合物，可刺激人粒细胞吞噬功能、增强小鼠的碳粒廓清能力、刺激巨噬细胞的吞噬功能，显著增强体液免疫。
酵母硒：安全高效，更容易在组织器官中存留，对动物生产性能有益，可有效提高动物免疫力，也可提高机体的抗氧化能力。
酵母多糖：广泛存在于酵母和真菌的细胞壁中，是其重要的组成部分，占酵母细胞壁干重的40％，由甘露聚糖及糖蛋白组成的复合物，研究表明其对脾淋巴细胞的增殖、细胞因子的分泌有促进作用，显著提高细胞免疫和体液免疫水平。
维生素C：又称抗坏血酸，为6个碳原子的酸性多羟基化合物。维生素C通过调节与机体抗应激作用相关激素(主要是肾上腺皮质酮和甲状腺激素)的浓度，增强机体的免疫机能，提高抗应激能力，也可直接参与细胞和体液免疫应答。
发酵黄芪复合制剂的组方中，以发酵黄芪为主要成分，酵母硒、酵母多糖次之，辅以板蓝根、紫锥菊、维生素C，其中，酵母硒、酵母多糖与发酵黄芪配合使用，能够增强机体免疫能力，解除免疫抑制，而且几种主要成分之间不存在功能拮抗作用，组分之间能够共同作用，从而达到提高抗病力、降低死淘率的目的。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备的发酵黄芪复合制剂能全面启动动物自身免疫机制，提高免疫力和抗应激能力，缩短患病动物恢复周期，降低动物死淘率，提高动物生产性能；复合制剂中的黄芪粉通过优选的芽孢杆菌进行发酵，显著提高了黄芪中有效成分的含量。
(2)本发明制备的发酵黄芪复合制剂绿色、安全、高效、无毒副作用。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：发酵黄芪条件优化
1试验材料
1.1中药：黄芪、板蓝根、紫锥菊，购于山东省泰安市龙潭大药房。
1.2供试菌株：枯草芽孢杆菌B7348(Bacillus subtilis B7348)，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102120975 B)中。枯草芽孢杆菌N9-1-35(Bacillus subtilis N9-1-35)，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011301；记载在申请人的另一项专利“一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102329749B)中。
1.3培养基 芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖2g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、酵母膏5g/L、pH 7.0-7.4，在115℃条件下灭菌20min。芽孢杆菌固体培养基：在芽孢杆菌液体培养基的基础上加15g/L琼脂粉。
2试验方法
2.1芽孢杆菌种子液的制备
将上述1.2中已低温保藏的供试菌株进行斜面培养，挑取新的枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35分别接种于100mL芽孢杆菌液体培养基中活化，制备新鲜活化的种子液，4℃冷藏备用。
2.2黄芪水溶液的制备黄芪药材烘干，用小型粉碎机磨成粉末状，过80目筛，之后用水配成一定质量浓度的黄芪水溶液，灭菌备用，作为中药基础培养基。
2.3芽孢杆菌发酵黄芪条件的优化
菌株发酵条件的摸索，包括最佳黄芪质量浓度摸索、最佳培养时间摸索、最佳培养温度摸索、最佳培养pH摸索。
2.3.1最佳黄芪质量浓度摸索：在无菌条件下，将2.1制备的芽孢杆菌种子液分别按照体积比2％的接种量，分别接入质量分数为4％、6％、8％、10％的黄芪水溶液中，37℃，220rpm震荡培养24h。采用平板计数的方法进行活菌计数。
2.3.2最佳培养时间摸索：在无菌条件下，将2.1制备的芽孢杆菌种子液分别按照体积比2％的接种量，分别接入到由2.3.1得出的最佳黄芪质量浓度培养基中，37℃，220rpm震荡培养20h、24h、28h、32h、36h、40h。采用平板计数的方法进行活菌计数。
2.3.3最佳培养温度摸索：在无菌条件下，将2.1制备的芽孢杆菌种子液分别按照体积比2％的接种量，分别接入到由2.3.1得出的最佳黄芪质量浓度培养基中，按照2.3.2得出的最佳培养时间，分别置于30℃、33℃、37℃、40℃、43℃，220rpm震荡培养。采用平板计数的方法进行活菌计数。
2.3.4最佳培养pH摸索：在无菌条件下，将2.1制备的芽孢杆菌种子液分别按照体积比2％的接种量，分别接入到2.3.1得出的最佳黄芪质量浓度培养基中，用0.5N NaOH和0.5N HCL将培养基pH值分别调为5、5.5、6、6.5、7，按照2.3.2得出的最佳培养时间、
2.3.3得出的最佳培养温度，220rpm震荡培养。采用平板计数的方法进行活菌计数。
3试验结果
3.1最佳黄芪质量浓度的摸索
表1黄芪浓度对芽孢杆菌B7348、N9-1-35活菌数的影响(108cfu·mL-1)
由表1可知：在黄芪质量浓度为6％时，枯草芽孢杆菌B7348、N9-1-35的活菌数最高，菌株生长性能最好。
3.2最佳培养时间的摸索
表2培养时间对芽孢杆菌B7348、N9-1-35活菌数的影响(108cfu·mL-1)
由表2可知；在黄芪质量浓度6％条件下，培养28h时，枯草芽孢杆菌B7348、N9-1-35的活菌数最高，菌株生长性能最好。
3.3最佳培养温度摸索
表3培养温度对芽孢杆菌B7348、N9-1-35活菌数的影响(108cfu·mL-1)
由表3可知：在黄芪质量浓度为6％、培养时间为28h条件下，培养温度为37℃时，枯草芽孢杆菌B7348、N9-1-35的活菌数最高，菌株生长性能最好。
3.4最佳培养pH摸索
表4pH对芽孢杆菌B7348、N9-1-35活菌数的影响(108cfu·mL-1)
由表4可知：在黄芪质量浓度为6％、培养时间为28h，培养温度为37℃条件下，pH5.0-5.5时，枯草芽孢杆菌B7348、N9-1-35的活菌数最高，菌株生长性能最好。
4小结 在黄芪质量浓度6％、培养时间28h、培养温度37℃、pH5.0-5.5时，枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35的活菌数最高，菌株生长性能最好。
实施例2：发酵黄芪复合制剂的制备
1.配方：
发酵黄芪粉250克、板蓝根25克、紫锥菊20克、维生素C 5克、酵母硒100克、酵母多糖50克、辅美粉550克。
黄芪、板蓝根、紫锥菊，购于山东省泰安市龙潭大药房；维生素C、酵母硒、酵母多糖和辅美粉为常规市售产品。
2.制备方法：
(1)发酵黄芪粉的制备：
分别将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35接种于芽孢杆菌斜面上，之后用接种环挑取少许到100mL锥形瓶中，置于37℃，220rpm摇床上，震荡培养24h；之后将锥形瓶内的枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的菌液分别按照体积比为2％的接种量接种到3L大锥形瓶中于摇床上震荡培养24h，分别得到枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35种子液。
将黄芪粉碎后，过80目筛，加水制成质量浓度为6％的黄芪水溶液，灭菌，冷却，按照体积比为2％的接种量分别接种枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的种子液，进行发酵培养，发酵时间为28h，发酵温度为37℃，pH为5.0-5.5，发酵完成后，发酵产物采用真空冷冻干燥法制成发酵黄芪粉；
(2)将板蓝根、紫锥菊粉碎，过80目筛，混合均匀，制成复合中药粉末；
(3)将步骤(1)制备的发酵黄芪粉、步骤(2)制备的复合中药粉末、维生素C、酵母硒、酵母多糖和辅美粉混合均匀，即得。
本实施例制备的发酵黄芪复合制剂的活菌总数为2×108cfu/g。
实施例3：发酵黄芪复合制剂的制备
1.配方：发酵黄芪粉 200克、板蓝根 30克、紫锥菊 15克、维生素C 8克、酵母硒 80克、酵母多糖 60克、辅美粉 500克。
2.制备方法：同实施例2。
实施例4：发酵黄芪复合制剂的制备
1.配方：发酵黄芪粉 300克、板蓝根 20克、紫锥菊 25克、维生素C 3克、酵母硒 120克、酵母多糖 40克、辅美粉 600克。
2.制备方法：同实施例2。
实施例5：发酵黄芪复合制剂的安全性试验
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物：70只清洁级雄性昆明小鼠及鼠粮，购于山东泰邦生物工程有限公司实验动物中心。
1.1.2饲料：将实施例2制备的发酵黄芪复合制剂分别按照0.1‰、1‰、5‰(质量分数)的添加量与磨碎后的鼠粮混合后，重新制粒，备用。
1.2试验方法
1.2.1试验分组
选取状态良好的60只小鼠，适应期3天后，随机分成对照组(CK)、试验组A、试验组B、试验组C共4个组，每组各15只。试验分组如表5所示。
表5试验分组
1.2.2小鼠生长状况及增重率的检测
在饲喂相应饲料的前1天及饲喂饲料的第1天、第3天、第6天、第8天测量小鼠的体重。观察小鼠体毛、神志、饮食及活动情况。
1.2.3小鼠免疫器官指数的测定
在试验开始后第8天，脱颈处死小鼠，取出肝、脾、肾分别称湿重，然后计算肝、脾、肾指数。肝或脾或肾指数＝肝或脾或肾重(mg)/体重(g)。
2结果
2.1发酵黄芪复合制剂对小鼠体重情况的影响
表6小鼠体重情况
注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著
(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。下同。
从表6可以看出，饲喂发酵黄芪复合制剂后，试验各组小鼠食欲正常，饮水正常，毛色光洁不潮湿，精神方面无异常，各组小鼠在饲喂发酵黄芪复合制剂前后均正常增长，各试验组与对照组相比，差异均不显著(P>0.05)。
2.2发酵黄芪复合制剂对小鼠脏器指数的影响
表7小鼠脏器指数
从上表7可以看出，小鼠在饲喂发酵黄芪复合制剂后的第8天，断颈处死，解剖观察其内脏器官，发现试验各组小鼠肝、肾、脾均无异常，各试验组脏器指数与对照组相比，差异均不显著(P>0.05)。
3结论
从上述试验结果可知，饲喂0.1-5‰添加量的本发明的发酵黄芪复合制剂的鼠粮后，各试验组的小鼠体重、脏器指数与对照组相比，差异均不显著，且脏器均无异常，说明5‰添加量的发酵黄芪复合制剂对小鼠是安全的剂量，可以放心使用。
实施例6：发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫特性的研究
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1实验动物：84只雌性小鼠体重18-22g，购于山东泰邦生物工程有限公司实验动物中心。
1.1.2饲喂饲料：将实施例2制备的发酵黄芪复合制剂分别按照0.1‰、0.5‰、1‰、3‰(质量分数)的添加量与磨碎后的鼠粮混合后，重新制粒，制备成试验组小鼠的饲料。将芪黄素按照1‰(质量分数)添加量加入到磨碎的鼠粮中重新制粒，制备成相关产品组小鼠的饲料。芪黄素购于北京生泰尔生物科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1试验分组：84只雌性小鼠，自由饮食1周后，称重后随机分成6组，每组14只，分别为对照组、4个试验组、相关产品组。试验分组如表8。
表8试验分组
1.2.2饲喂管理分组后预饲7d，连续饲喂相关饲料30d，自由饮水。
1.2.3脏器/体重比值测定小鼠颈椎脱臼处死称重后，立即取出胸腺和脾脏，用滤纸吸干血液后称重，胸腺(脾脏)指数(mg/g)＝胸腺(脾脏)重量/小鼠体重。
1.2.4免疫因子的检测将小鼠用乙醚麻醉以后，摘眼球取血。将血液静置离心后，获得血清，测定IgG、sIgA等指标，具体按照鸡免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒、鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA试剂盒说明书中的操作步骤进行。
1.2.5数据统计学分析数据统计学分析试验结果均以平均值±标准差表示，应用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较。
2结果
2.1发酵黄芪复合制剂对小鼠体重的影响
发酵黄芪复合制剂饲喂小鼠30d后，受试小鼠饲喂前后体重变化见表9。由表9可以看出，饲喂前，各处理组之间无显著性差异(P＞0.05)，饲喂后，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组、相关产品组与对照组相比，差异显著(P＜0.05)。其中试验Ⅲ组小鼠体重比对照组显著提高约17.5％(P＜0.05)，比相关产品组提高约5％(P>0.05)。
表9饲喂前后小鼠体重的变化
2.2发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫器官指数的影响
发酵黄芪复合制剂饲喂小鼠30d后，处死小鼠摘取胸腺、脾脏，测定免疫器官指数，结果如下表10所示。由表10可以看出，试验Ⅲ组的胸腺指数比对照组显著提高约19.3％，比相关产品组显著提高约46.2％(P＜0.05)；试验Ⅲ组的脾脏指数比对照组显著提高约23.7％，比相关产品组显著提高约21.8％(P＜0.05)。结果表明，该发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫器官的发育能起到促进作用。
表10发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫器官指数的影响
2.3发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫因子的影响
发酵黄芪复合制剂饲喂小鼠30d后，免疫因子测定结果如下表11所示。由表11可以看出，试验Ⅲ组的IgG分别比对照组、相关产品组显著提高约71.3％、87.7％(P＜0.05)；试验Ⅲ组的sIgA分别比对照组、相关产品组显著提高约64.5％、87.5％(P＜0.05)。
表11复合制剂对小鼠免疫因子的影响
3讨论
本试验结果表明，发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫力的提高有很好的效果。
3.1发酵黄芪复合制剂对小鼠体重的影响黄芪经过益生菌发酵后，有效成分含量有所提高，利于动物的生长和发育，体重自然随之增高。试验结果显示，试验Ⅲ组小鼠体重比对照组显著提高约17.5％、比相关产品组提高约5％，说明1‰添加量的发酵黄芪复合制剂在小鼠促生长方面效果较优。
3.2发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫器官指数的影响胸腺、脾脏质量可用来评价小鼠的免疫状况。胸腺是机体的重要淋巴器官，其功能与免疫紧密相关，脾脏是体内最大的外周免疫器官，参与全身的体液免疫和细胞免疫。研究发现，发酵黄芪复合制剂对小鼠免疫器官的发育起到明显促进作用，其中，试验Ⅲ组的胸腺指数分别比对照组、相关产品组显著提高约19.3％、46.2％；试验Ⅲ组的脾脏指数分别比对照组、相关产品组显著提高约23.7％、21.8％。胸腺指数和脾脏指数的增加，说明发酵黄芪复合制剂能促进免疫器官的发育，进而影响了小鼠的免疫功能，1‰添加量的发酵黄芪复合制剂效果较优。
3.3发酵黄芪复合制剂对小鼠血清中IgG、sIgA的影响IgG属于体液内主要的免疫球蛋白，约占血液中免疫球蛋白总量的70％～75％。在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素方面，具有重要作用。分泌型IgA即sIgA是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，故又称粘膜局部抗体。本研究发现，发酵黄芪复合制剂能提高小鼠的免疫力，增强体质。试验Ⅲ组IgG、sIgA分别比对照组显著提高约71.3％、64.5％。试验Ⅲ组IgG、sIgA分别比相关产品显著提高约87.7％、87.5％，说明在提高小鼠免疫能力方面，1‰添加量的发酵黄芪复合制剂效果优良。
4小结
上述试验结果可以明显的看出，发酵黄芪复合制剂作为饲料添加剂饲喂小鼠，提高了小鼠的免疫器官重量，增强了机体免疫力，其中以1‰添加量的发酵黄芪复合制剂效果最优。
实施例7发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡免疫机能的影响
1材料与方法
1.1发酵黄芪复合制剂：本发明实施例2制备的发酵黄芪复合制剂。
1.2试验动物
海兰褐蛋公鸡，购自泰安市东岳种禽场，按照常规程序免疫后进行试验。试验用饲料为蛋鸡饲料，购于山东省泰安市上高兽医站。150只1日龄海兰褐蛋公鸡随机分成5组，每组3个平行，预饲一周后，连续7天饲喂添加相应添加剂的饲料。试验分组如下表12所示。
表12试验分组
注：1相关产品组为芪黄素，购于北京生泰尔生物科技有限公司。
2饲料制备：购买成品蛋鸡饲料后磨碎，分别加入相应剂量添加剂后重新制粒。
1.3免疫器官指数测定分别于14、21、28、35、42日龄称重后处死鸡只，立即取出脾脏和法氏囊，用滤纸吸干血液后称重，脾脏(法氏囊)指数(mg/g)＝脾脏(法氏囊)重量/鸡体重。
1.4免疫因子的检测杀鸡后取血，将血液静置离心后，获得血清，测IgG等指标，具体按照鸡免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行，试剂盒购于北京鑫方程生物科技有限公司。
1.5数据统计学分析数据统计学分析试验结果均以平均值±标准差表示，应用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较。
2结果
2.1发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡脾脏指数的影响
表13发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡脾脏指数的影响
从表13可以看出，试验Ⅲ组在试验后期28、35、42日龄显著提高了脾脏指数(P＜0.05)，其中35日龄时，试验Ⅲ组的脾脏指数分别比对照组、相关产品组显著提高约40.7％、24.5％；42日龄时，试验Ⅲ组的脾脏指数分别比对照组、相关产品组显著提高约36.7％、15.1％。
2.2发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡法氏囊指数的影响
表14发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡法氏囊指数的影响
从表14可以看出，试验Ⅲ组在试验后期35、42日龄显著提高了法氏囊指数(P＜0.05)，其中35日龄时，试验Ⅲ组的法氏囊指数分别比对照组、相关产品组显著提高约24.8％、15.8％。
2.3发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡血清IgG的影响
表15发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡血清IgG的影响(ng/mL)
从表15可以看出，试验Ⅲ组可显著提高蛋鸡血清中免疫球蛋白的含量(P＜0.05)，其中35日龄时，试验Ⅲ组的IgG含量分别比对照组、相关产品组显著提高约12.3％、10.8％；42日龄时，试验Ⅲ组的IgG含量分别比对照组、相关产品组显著提高约14.5％、11.5％。
3讨论
3.1发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡免疫器官指数影响
脾脏是鸡体内最大的外周免疫器官，法氏囊是禽类B淋巴细胞发育成熟的器官，两者参与全身的体液免疫和细胞免疫，器官指数的增加表明机体的免疫机能的提高。脾脏、法氏囊指数可以用来评价雏鸡的免疫水平和状况。本试验结果发现，试验Ⅲ组显著提高了海兰褐蛋公鸡脾脏、法氏囊指数，其中35日龄时，试验Ⅲ组的脾脏指数分别比对照组、相关产品组显著提高约40.7％、24.5％；试验Ⅲ组的法氏囊指数分别比对照组、相关产品组显著提高约24.8％、15.8％。这说明，3‰添加量的发酵黄芪复合制剂能提高海兰褐蛋公鸡的免疫水平。
3.2发酵黄芪复合制剂对海兰褐蛋公鸡血清IgG的影响
IgG为体液内主要的免疫球蛋白，约占血液中免疫球蛋白总量的70～75％，在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物中和细菌毒素方面，具有重要作用。本研究中，在蛋鸡35、42日龄时，试验Ⅲ组蛋鸡血清中免疫球蛋白与对照组、相关产品组相比均显著增加，表明3‰添加量的发酵黄芪复合制剂显著提高了蛋鸡的免疫水平，增强了动物疾病抵抗力。
4小结
通过对脾脏、法氏囊指数及血清中IgG的测定，可以明显的看出，应用本发明的发酵黄芪复合制剂饲喂蛋鸡后，能够显著提高蛋鸡的免疫器官重量，对体液免疫也起到了一定的促进作用，其中以3‰添加量的发酵黄芪复合制剂组效果最优。
Claims (10)
1.一种发酵黄芪复合制剂，其特征在于，由以下重量份的原料制成：
发酵黄芪粉200-300份、板蓝根20-30份、紫锥菊15-25份、维生素C 3-8份、酵母硒80-120份、酵母多糖40-60份、辅美粉500-600份；
所述发酵黄芪粉是将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35在黄芪水溶液中混合发酵培养，得到的发酵产物经冷冻干燥制备而成。
2.如权利要求1所述的发酵黄芪复合制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌B7348为保藏编号为CCTCC M 2010260的菌株；所述枯草芽孢杆菌N9-1-35为保藏编号为CCTCC M2011301的菌株。
3.如权利要求1所述的发酵黄芪复合制剂，其特征在于，由以下重量份的原料制成：
发酵黄芪粉250份、板蓝根25份、紫锥菊20份、维生素C 5份、酵母硒100份、酵母多糖50份、辅美粉550份。
4.如权利要求1所述的发酵黄芪复合制剂，其特征在于，发酵黄芪复合制剂中的活菌总数大于或者等于1×108cfu/g。
5.权利要求1所述的发酵黄芪复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)发酵黄芪粉的制备：
将黄芪粉碎后，过筛，加水制成质量浓度为5-7％的黄芪水溶液，灭菌，冷却，分别接种枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的种子液，接种量按体积比均为2％，进行发酵培养，发酵完成后，发酵产物采用真空冷冻干燥法制成发酵黄芪粉；
(2)将板蓝根、紫锥菊粉碎，过80目筛，混合均匀，制成复合中药粉末；
(3)将步骤(1)制备的发酵黄芪粉、步骤(2)制备的复合中药粉末、维生素C、酵母硒、酵母多糖和辅美粉混合均匀，即得。
6.如权利要求5所述的发酵黄芪复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35种子液的制备方法为：分别将枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35接种于芽孢杆菌斜面上，之后用接种环挑取少许到100mL锥形瓶中，置于37℃，220rpm摇床上，震荡培养24h；之后将锥形瓶内的枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35的菌液分别按照体积比为2％的接种量接种到3L大锥形瓶中于摇床上震荡培养24h，分别得到枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌N9-1-35种子液。
7.如权利要求5所述的发酵黄芪复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，黄芪水溶液的质量浓度为6％。
8.如权利要求5所述的发酵黄芪复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养的条件为：发酵时间为25-30h，发酵温度为37℃，pH为5.0-5.5。
9.如权利要求8所述的发酵黄芪复合制剂的制备方法，其特征在于，发酵时间为28h。
10.权利要求1至4任一项所述的发酵黄芪复合制剂在制备提高动物免疫力的饲料添加剂中的应用。
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