CN106389477A - 一种土生戈登氏菌的全细胞植物油提取物的制备方法和应用 - Google Patents

一种土生戈登氏菌的全细胞植物油提取物的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种土生戈登氏菌的全细胞植物油提取物的制备方法和应用,步骤是:A、菌种培养:斜面种子培养基察氏培养基,将冻干种子接种于茄子瓶斜面;B、种子罐培养:将接种瓶种子转入种子罐,培养;C、发酵罐培养:将种子罐种子液打入发酵罐,培养,菌体单个球杆状,菌数108-1010个/ml,停止发酵;D、发酵液煮沸灭活后浓缩,烘干收集菌体,得到土生戈登氏菌全细胞菌粉;E、植物油浸提:将土生戈登氏菌全细胞菌粉用植物油浸提,浸提完后离心收集上清液获得全细胞植物油提取物。易于大规模生产,提取物具备促进伤口愈合、对疱疹性口炎具有显著疗效的作用。

Description

一种土生戈登氏菌的全细胞植物油提取物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域,具体涉及一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,同时还涉及一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的用途。
背景技术
目前在国内的促进伤口愈合的药物有限,且主要以抗炎、止血、保护创面为主,但这些作用只对创伤早期有效,而对真正体现伤口愈合速度的各种组织细胞的增殖作用较少,且大多都有副作用。开发一种多功能的安全、环保、副作用小且疗效显著的含有天然活性成分的新型药物具有深远的意义。
疱疹性口炎是由人类单纯疱疹病毒导致的急性炎症性皮肤黏膜病,由1型单纯疱疹病毒引起,感染该病毒的患者出现口腔黏膜、口腔周围、颜面部皮肤和咽喉部疱疹,还可能感染鼻翼、生殖器等部位,部分患者出现眼部疱疹性角膜炎。该病临床症状带来生活上不便,产生痛苦,且无特效方法治疗,容易复发,严重者可留色素和轻度疤痕,影响美观。
发明者从事分枝杆菌研究近30年,经研究发现:分枝杆菌,戈登氏菌的细胞壁有着特殊的结构,那就是分枝杆菌多糖(MSP)。它具有明显的免疫调节功能,尤其调节细胞的免疫应答。本发明即土生戈登氏菌的全细胞植物油提取物中其氨基酸含量丰富、类胡萝卜素特别是β-胡萝卜素含量高,还含有甲基萘醌、黄酮、多糖和丰富的维生素等天然生物活性物质,赋予了该提取物促进伤口愈合和抗氧化和免疫调节等多种功能。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,方法简单,易行,易于大规模生产,该细胞提取物具备促进伤口愈合、对疱疹性口炎具有显著疗效的作用。所述的土生戈登氏菌sq-5(Gordona terrae sq-5)保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心,编号为CCTCC NO:M2012390。该菌为专利菌种,专利号为:ZL201310016059.5。
本发明的最后一个目的在于提供了一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物在制备治疗或预防(促进)伤口愈合、烧伤、烫伤和/或治疗疱疹性口炎等药物中的应用,所述的应用包括但不限于用于制备促进伤口愈合和/或治疗疱疹性口炎等的药物。该提取物其氨基酸含量丰富、类胡萝卜素特别是β-胡萝卜素含量高,还含有甲基萘醌、黄酮、多糖和丰富的维生素等天然生物活性物质,能有效促进伤口愈合,对疱疹性口炎具有明显的治疗效果。本发明绿色环保,基本没有副作用。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物,包括以土生戈登氏菌sq-5为原料,利用本领域的常规方式,用植物油对土生戈登氏菌sq-5进行浸提获得的上清。
一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,其步骤是:
A、菌种培养:斜面种子培养基察氏培养基,将冻干种子sq-5(专利号为:ZL201310016059.5)接种于茄子瓶斜面,28-32℃培养3天。检查无杂菌,生长健壮,均匀,用无菌水转入接种瓶。
B、种子罐培养:将上述A中接种瓶种子转入种子罐,培养温度28-32℃,通气量1:0.6-0.8,自动流加泡敌,培养30-35h,取样镜检,合格后备用。
C、发酵罐培养:以5-10%的接种量将上述B中培养好的种子罐种子液打入发酵罐,通气量1:0.8,自动流加泡敌,28-32℃培养48-52h,菌体单个球杆状,菌数108-1010个/ml,停止发酵。
D、将上述C中培养好的发酵液100℃煮沸灭活后浓缩,浓缩物108-112℃烘干收集菌体,粉碎过筛(120目),得到土生戈登氏菌全细胞菌粉。
E、植物油浸提:将上述D中收集的土生戈登氏菌全细胞菌粉1-3份,植物油(大豆油或芝麻油)98-102份于80℃浸提4-5h,浸提完后于6500r/min离心10min收集上清液获得土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物。
所述的种子罐和发酵罐发酵用培养基配方:
一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物在制备治疗或预防(促进)伤口愈合、烧伤、烫伤和/或治疗疱疹性口炎等药物中的应用,其步骤是:
A、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物无菌罐装制成油剂用于治疗疱疹性口炎的药物。
B、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物无菌罐装制成油剂用于治疗创伤(包括手术伤口、烧伤和烫伤等)的药物。
C、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物作为药品原料用于制成包括但不限于治疗创伤和疱疹性口炎的药物。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
分枝杆菌,戈登氏菌的细胞壁有着特殊的结构,那就是分枝杆菌多糖(MSP),本发明涉及的土生戈登氏菌的脂多糖含有50个碳原子的不饱和脂肪酸使其生理活性更强,其包含有阿拉伯糖和半乳糖,二者以3:1形式连接,而阿拉伯糖的呋喃糖残基则是免疫决定簇,因而赋予了这类菌特殊的免疫调节功能和非特异性抗感染功能。
有资料证明氨基酸在伤口愈合中起着重要的作用;维生素A在伤口愈合的炎症期有积极的作用,促进或有助于胶原的形成、血管再生和上皮的形成,增强伤口和吻合口愈合的张力;黄酮类物质有抑制炎性生物酶的渗出,可以增进伤口愈合和止痛,由于具有强抗组织胺性,可用于各类敏感症。本发明为土生戈登氏菌全细胞植物油提取物,其提取物中含有丰富的脂溶性复合氨基酸和以β-胡萝卜素为主的类胡萝卜素,β-胡萝卜素为维生素A的前体物质,且提取物还含有黄酮、甲基萘醌、多糖、维生素等多种天然抗氧化因子赋予该提取物很好的皮肤营养、生肌、免疫调节和抗氧化等功能,而且脂溶性物质具有其自身的优点:1、脂溶性物质更容易透过皮肤被皮肤吸收而发挥生理作用。2、油脂不容易污染无需添加防腐剂更安全,无刺激性。3、油脂本身可以隔离空气可减少伤口及炎症的进一步感染。
土生戈登氏菌全细胞植物油提取物中营养全面,多种生理活性因子有机和谐地在一个生命体系之中通过协同作用有利于机体对营养物的吸收和生理效应的发挥,而培养物中维生素都以微量或超微量形式存在更加有效的发挥其生理活性而无副作用。
土生戈登氏菌全细胞培养物经急性毒性试验为无毒级类物质,三项致突变试验(小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验,小鼠精子畸形试验,Ames试验)结果均为阴性。
本发明的原料来源广泛,工艺简单易操作适合大规模生产,本发明产品原料安全性高且环保几乎无污染。
具体实施方式
本发明的实施例中的实验方法或条件,如未特别说明均为常规方案。
实施例1:
一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,其步骤是:
A、菌种培养:斜面种子培养基察氏培养基,将冻干种子sq-5(专利号为:ZL201310016059.5)接种于茄子瓶斜面,28或29或30或31或32℃培养3天。检查无杂菌,生长健壮,均匀,用无菌水转入接种瓶。
B、种子罐培养:将上述A中接种瓶种子转入种子罐,培养温度28或29或30或31或32℃,通气量1:0.6或0.7或0.8,自动流加泡敌,培养30或32或34或35h,取样镜检,合格后备用。
C、发酵罐培养:以5%或7%或9%或10%的接种量将上述B中培养好的种子罐种子液打入发酵罐,通气量1:0.8,自动流加泡敌,28或29或30或31或32℃培养48或50或52h,菌体单个球杆状,菌数108或109或1010个/ml,停止发酵。
D、将上述C中培养好的发酵液100℃煮沸灭活后浓缩,浓缩物108或109或110或111或112℃烘干收集菌体,粉碎过筛(120目),得到土生戈登氏菌全细胞菌粉。
E、植物油浸提:将上述D中收集的土生戈登氏菌全细胞菌粉1或2或3份,植物油(大豆油或芝麻油)98或99或100或101或102份于80℃浸提4或5h,浸提完后于6500r/min离心10min收集上清液获得土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物。
所述的土生戈登氏菌sq-5保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心,编号为CCTCC NO:M2012390。该菌为专利菌种,专利号为:ZL2013 1 0016059.5。
所述的种子罐和发酵罐发酵用培养基配方:
实施例2:
一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物在制备治疗或预防(促进)伤口愈合、烧伤、烫伤和/或治疗疱疹性口炎等药物中的应用,其步骤是:
A、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物无菌罐装制成油剂用于治疗疱疹性口炎的药物。
B、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物无菌罐装制成油剂用于治疗创伤(包括手术伤口、烧伤和烫伤等)的药物。
C、将上述土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物作为药品原料用于制成治疗但不限于创伤和疱疹性口炎的药物。
实施例3:
土生戈登氏菌sq-5全细胞菌粉抗氧化功能的实验:
实验动物:12月龄的昆明种雄性小鼠40只,体重为18-20g,对照组20只,实验组20只,CK组用蒸馏水灌胃,实验组用土生戈登氏菌sq-5全细胞菌粉0.01g/kg灌胃,连续喂养30日后用动物眼球取血分离血清,处死动物取肝脏作匀浆,制备1%肝匀浆作SOD酶的测定(每组有5个平行实验)采用羟胺法(试剂盒为南京建成生物工程公司)。实验结果见表1、表2。
表1土生戈登氏菌sq-5细胞菌粉显著增加小鼠血清SOD酶活性(u/ml)。
1 2 3 4 5
CK组 86.9 103.1 131.5 152.1 129.6
实验组 203.4 217.4 227.6 257.2 266.1
5个实验组与CK组比P<0.01,表明该菌粉具有明显的抗氧化功能。
表2土生戈登氏菌sq-5细胞菌粉显著增加小鼠1%肝匀浆SOD酶活性(u/ml)
1 2 3 4 5
CK组 138.0 160.1 196.7 210.9 233.5
实验组 331.6 369.5 389.7 432.2 483.8
5个实验组与CK组比P<0.01,表明该菌粉具有明显的抗氧化功能。
实施例4:
土生戈登氏菌sq-5全细胞培养物毒理学实验,其步骤是
1、小鼠急性毒性试验:
试验动物:昆明种小鼠18-20只,雌雄各10只。
实验方法:取受试物0.2ml/10g.BW经口灌胃,灌胃前停食16hr,连续观察一周,并记录动物中毒症状及死亡情况。结果见表3。
表3小鼠急性毒性试验结果
结论:一周内动物未见明显中毒症状及死亡发生,一次灌胃浓度达20ml/Kg.BW,按急性毒性分级标准规定,该受试物属于无毒级类物质。
2、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:
试验动物:昆明种小鼠25-27g,雌雄各30只。
试验方法:受试物配制同急性毒性试验,动物按体重随机分成6组,A组为阴性对照组;F组为环磷酰胺阳性对照组;B、C、D、E组为受试物组,受试物剂量分别为5.0、10.0、15.0、20.0g/Kg.BW。每只动物经口灌胃0.1ml/10g.BW,阴性对照组给予蒸馏水,两次灌胃间隔24hr,第二次灌胃6hr后,处死动物,取胸骨骨髓涂片,Giemsa染色。每只动物油镜下观察1000个嗜多染红细胞,记录出现微核的嗜多染红细胞数,结果见表4。
表4骨髓嗜多染红细胞微核试验结果
结论:受试物各剂量组雌雄性别微核率与阴性对照组比较,均在本实验室测定值正常范围内,且无显著性差异(P>0.05),表明该受试物骨髓微核试验结果为阴性。
3、小鼠精子畸形试验:
试验动物:昆明种雄性小鼠,23-25g,共30只。
试验方法:按体重随机分成5组,A组为阴性对照组;E组为环磷酰胺阳性对照组,B、C、D组为受试物组,受试物剂量分别为10.0、15.0、20.0ml/Kg.BW,阴性对照组给予蒸馏水,连续5天经口给予,再继续喂养30天,处死动物,取两侧副睾涂片,伊红染色。每只动物高倍镜下观察1000个精子,记录畸形精子数。结果见表5。
表5小鼠精子畸形试验结果
结论:受试物各剂量组与阴性对照组结果比较差异无显著性(P>0.05),表明该受试物精子畸形试验结果为阴性。
4、Ames试验:
试验菌株采用经鉴定符合生物要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株进行试验。采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆作为体外活化系统(+S9)。受试物分为三个剂量组,原液稀释1000倍为低剂量组,原液稀释100倍为中剂量组,原液稀释10倍为高剂量组,121℃、20min灭菌处理,每皿加入量为0.5ml。同时设置空白及阳性对照组。采用平板掺入法记录二次重复的平行样品结果。结果见表6。
表6 Ames试验结果(个/皿,)
注:-S9阳性对照组为2、4、7-TNFone加入量为0.3ug/皿
+S9阳性对照组为2-AF加入量为20ug/皿
结论:受试物各组回变菌落数均未超过自发回变数2倍,且无剂量反应关系,故Ames试验结果为阴性。
实施例5:
土生戈登氏菌sq-5全细胞菌粉对小鼠免疫功能影响,其步骤是:实验动物为昆明种雄性小鼠62只,体重为20±2g,随机分成四组,蒸馏水+饲料组(CK)20只,分别在饲料中加土生戈登氏菌粉0.0001g,0.001g,0.01g各14只,连续喂养14天,于第15天进行脾淋巴细胞转化,诱导产生IL-2、TNF及胸腺重量的实验,其结果见表7和表8。
表7土生戈登氏菌sq-5菌粉对脾淋巴细胞转化影响
组别 小鼠个数N 生理盐水 conA诱导
CK 20 3800±437 11258±1713
0.0001 14 8343±402 18307±3143
0.001 14 11286±2317 24532±4315
0.01 14 12688±1302 29563±2811
三个计量组与CK组比P<0.01,显著增加小鼠的脾淋巴细胞的转化。
表8土生戈登氏菌sq-5对小鼠IL-2、TNF及胸腺重量的影响
各剂量组与CK组比P<0.01
由此说明土生戈登氏菌粉明显提高脾淋巴细胞的转化并产生IL-2水平得以提高显著,并能显著提高腹腔巨噬细胞诱导TNF的能力,明显增加小鼠胸腺的重量,也就是说该药剂可以提高小鼠的免疫功能。
实施例6:
土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物治疗疱疹性口炎的实验,其步骤是:
采用上述实施的生物药油,在市级以上医院选出诊断为口腔疱疹的患者20例,其中男8例,女12例进行试验。给予对照组患者皮损处3%阿洛昔韦软膏每日6次涂抹,1次/2h,连续涂抹1周;给予实验组患者皮损处土生戈登氏菌全细胞植物油提取物涂抹,每日3次。连续涂抹1周。所有患者在治疗期间禁止内服或外敷任何其他抗病毒药物。其结果见表9.
表9两组口腔疱疹患者不同药物治疗疗效统计表
组别 例组 止疱/d 结痂/d 脱痂/d 总病程/d
试验组 10 1.5±0.35 2.5±0.5 5.5±0.35 5.8±0.5
对照组 10 3.03±0.25 5.10±1.13 6.22±1.20 6.7±1.35
试验组在止疱、结痂、脱痂、总病程都优于对照组。
实施例7:
土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物治疗手术伤口的实验,其步骤是:
采用上述实施的生物药油,在市级以上医院应用土生戈登氏菌全细胞植物油提取物进行促进伤口愈合试验,随机选取50例刚做完手术缝完针的手术患者,观察组25例,对照组25例。观察组:在常规缝合切口后应用土生戈登氏菌全细胞植物油提取物抹切口上,每日两次,隔天观察;对照组:常规治疗。观察结果见表10。
表10两组患者愈合不良率比较(例,%)
观察组愈合不良率4.00%少于对照组愈合不良率12.00%,且在试验过程中发现试验组的伤口愈合速度优于对照组。

Claims (4)

1.一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,其步骤是:
A、菌种培养:斜面种子培养基察氏培养基,将冻干种子土生戈登氏菌sq-5接种于茄子瓶斜面,28-32℃培养3天,检查无杂菌,用无菌水转入接种瓶;
B、种子罐培养:将步骤(A)中的接种瓶种子转入种子罐,培养温度28-32℃,通气量1:0.6-0.8,自动流加泡敌,培养30-35h,取样镜检,备用;
C、发酵罐培养:以5-10%的接种量将种子罐种子液打入发酵罐,通气量1:0.8,自动流加泡敌,28-32℃培养48-52h,菌体单个球杆状,菌数108-1010个/ml,停止发酵;
D、土生戈登氏菌全细胞菌粉制备:将步骤(C)中培养好的发酵液100℃煮沸灭活后浓缩,浓缩物108℃-112℃烘干收集菌体,粉碎过筛120目,得到土生戈登氏菌全细胞菌粉;
E、植物油浸提:将步骤(D)中收集的土生戈登氏菌全细胞菌粉1-3份,植物油98-102份于80℃浸提4-5h,浸提完后于6500r/min离心10min收集上清液获得土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物;
所述的植物油为大豆油或芝麻油。
2.根据权利要求1所述的一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物的制备方法,其特征在于:所述的种子罐和发酵罐发酵用培养基配方:
3.权利要求1所述的一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物在制备治疗或预防伤口愈合、烧伤、烫伤药物中的应用。
4.权利要求1所述的一种土生戈登氏菌sq-5的全细胞植物油提取物在制备治疗或预防疱疹性口炎药物中的应用。
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