CN113773985A - 提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌，属于发酵工程领域。此发明以中药原料为唯一碳源，添加了增殖因子和有利于促进枯草芽孢杆菌增殖的微量元素，使枯草芽孢杆菌能够在石斛或黄芪原料发酵液中快速增殖，以此方式发酵一定时间，发酵液中的枯草芽孢杆菌增殖超过109cfu/mL，发酵后提取中药多糖含量较未发酵提取中药多糖提取率提升1.13～1.72倍，且在皮肤屏障修复和免疫调节方面均较未发酵多糖具有显著提高，显著提高SDS诱导的HaCaT的细胞存活率，降低LPS诱导的细胞中NO含量。

Description

提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌，属于发酵工程领域。
背景技术
石斛是我国一味传统的名贵中药，素有“药中黄金”的美誉。石斛味甘，性微寒，具有益胃生津，滋阴清热的功效。研究表明，石斛中含有的主要活性成分为石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分，多糖是其最主要的有效成分，多糖含量的高低决定石斛生物活性的强弱，其具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等作用。
黄芪为豆科植物膜夹黄芪或者内蒙古黄芪的干燥根，始载于《神农本草经》。黄芪性甘,微温,具有益气养阳、益肺健脾、保肝利尿等功效。研究表明，黄芪含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮及微量元素等多种活性物质。黄芪多糖是黄芪主要的活性成分，多糖含量的高低决定黄芪生物活性的强弱，其具有增强免疫、抗疲劳、抗衰老、降血糖、抗肿瘤和抗病毒等作用。
中药多糖在化妆品原料开发中具有很好的应用前景，目前主要通过酶提法、酸提法、碱提法、水提法、超声提取等提取多糖并应用于化妆品。通过微生物法发酵中药提高多糖的提取量近几年亦有研究，微生物在生长代谢过程中分泌大量的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖苷酶、淀粉酶、果胶酶等胞外酶，可使植物细胞破裂，细胞间隙增大，加快中药有效成分的溶出，有效提高中药有效成分的提取率。通过微生物发酵不仅可以提高多糖的提取率，而且通过微生物的生物转化作用，可以将原有的植物多糖转化成活性更高的新型发酵多糖；另，部分微生物在发酵过程中，可利用小分子碳水化合物自身合成胞外多糖，尤其一些乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌，利用该微生物发酵中药不仅可以纯化中药多糖，而且产生的菌体胞外多糖与中药多糖起到协同增效作用。但微生物的上述作用依赖于菌株的代谢酶系，具有很强的菌株特异性，有的菌株无法利用中药原料进行发酵增殖，有的菌株即使能利用中药原料增殖亦无法进行多糖的生物转化，有的菌株甚至会降低多糖的活性，能够产胞外多糖的菌株亦具有很强的特异性。
皮肤作为人体的第一道防线，对抵御外界有害因素以及维持人体内环境的稳态有着至关重要的作用。皮肤是抵御外界物质进入人体和防止体内水分丢失的主要屏障，往往皮肤屏障受损和皮肤免疫应答反应同时发生。皮肤屏障受损导致皮肤免疫应答失调，而皮肤免疫应答失调会加重皮肤屏障受损，形成恶性循环。只有在维持皮肤屏障完整性的同时促使皮肤免疫应答正常化，才是保证皮肤健康。而石斛多糖和黄芪多糖既可以修复皮肤屏障功能，又能用于调节皮肤免疫。
目前尚无能够利用石斛原料和黄芪原料进行有效发酵的菌株和发酵工艺，更没有菌株或发酵工艺在提高发酵多糖得率的同时，提高发酵多糖在皮肤屏障修复和皮肤免疫调节方面的功效。因此，利用现代发酵工程技术使发酵过程中限制性因素得到解决，使中药原料得到充分的开发利用，提高其有效成分多糖得率，筛选出一株益生菌能够发酵中药原料，且发酵后提取多糖在屏障修复和免疫调节功效方面均提高，具有重要价值。
发明内容
[技术问题]
目前尚无能够利用石斛原料和黄芪原料进行有效发酵的菌株和发酵工艺，更没有菌株或发酵工艺在提高发酵多糖得率的同时，提高发酵多糖在皮肤屏障修复和皮肤免疫调节方面的功效。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵多种中药原料与发酵后提取多糖的方法，及发酵中药多糖在皮肤屏障修复和皮肤免疫调节方面的应用。
本发明提供一种枯草芽孢杆菌CCFM1162(Bacillus subtilis)，于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61715，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供上述枯草芽孢杆菌CCFM1162在提取中药多糖方面的应用。
本发明的第三个目的提供一种发酵中药原料及提取发酵多糖的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)将上述枯草芽孢杆菌CCFM1162接种至以中药原料为唯一碳源的培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)超声处理步骤(1)中的发酵液，离心并收集发酵上清液；在发酵上清液中加入三氯乙酸，孵育后离心并收集上清液；在上清液中加入乙醇混合，孵育后离心获得沉淀；
(3)用超纯水复溶步骤(2)中的沉淀后，真空冷冻干燥，获得发酵多糖粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述培养基的组成包括干重40～80g/L的中药原料，10～40g/L的增殖因子和10～40g/L的无机盐。
在本发明的一种实施方式中，所述中药原料的制备方法为将新鲜或干燥的中药原料粉碎至60目以下。
在本发明的一种实施方式中，所述增殖因子选自酵母浸粉、酵母提取物、酵母蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述无机盐选自氯化钠、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的初始pH值为5.5～7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述中药原料包括石斛或黄芪。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1.0×106～1.0×107cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述发酵的条件为：温度为32～38℃，pH为5.5～7.0，发酵时间为15～24h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述离心的条件为：6000～10000g，时间为5～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述超声处理的条件为：温度25～80℃，超声功率200～500w，时间为10～30min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述三氯乙酸浓度为750～850g/L，以质量比2％～5％的添加量添加至发酵上清液中，孵育时间为30～60min，温度为0～4℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述乙醇的浓度为90～95％，以体积比1:4的比例添加至发酵上清液中。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述真空冷冻干燥条件为预冻温度为-60～-55℃，时间为3～5h；一次干燥温度为-25～-35℃，压力为180～220μbar，时间为22～26h；二次干燥温度为20～30℃，压力为0μbar，时间为15～20h。
利用上述方法制备得到的含石斛多糖的组合物或含黄芪多糖的组合物。
本发明还提供含石斛多糖的组合物在制备预防和/或治疗皮肤屏障修护的产品中的应用。
本发明还提供含黄芪多糖的组合物在制备预防和/或治疗皮肤免疫调节的产品中的应用。
有益效果：
(1)利用枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵中药原料，并结合超声法，提高了中药原料的多糖提取率，发酵后中药多糖提取率是未发酵中药多糖提取率的1.13～1.72倍。
(2)本发明考察了枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛提取多糖对皮肤屏障修复的影响，结果显示，发酵石斛多糖提高了SDS诱导的HaCaT的细胞存活率，是未发酵石斛粗多糖的1.38倍，显著提高HaCaT的细胞存活率。
(3)本发明考察了枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵黄芪提取多糖对皮肤免疫调节的影响，结果显示，发酵黄芪多糖降低了LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量，是未发酵黄芪粗多糖的0.76倍，较未发酵黄芪粗多糖更有效的降低NO含量。
(4)本发明考察了枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛和黄芪提取多糖的分子量分布，结果显示，发酵后石斛和黄芪多糖中的较大分子量多糖较未发酵石斛和黄芪多糖中的较大分子量多糖有所减小。
(5)本发明考察了枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛和黄芪提取多糖的单糖组成，结果显示，发酵后石斛多糖的单糖组份较未发酵石斛多糖的单糖组份有所增加或减少，且各单糖组分含量也有所差别。
生物保藏证明：
枯草芽孢杆菌CCFM1162(Bacillus subtilis)，于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61715，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛提取多糖图片。
图2是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵黄芪提取多糖图片。
图3是枯草芽孢杆菌CCFM1162、植物乳杆菌X2发酵石斛提取多糖和未发酵石斛多糖提取率图。
图4是枯草芽孢杆菌CCFM1162、植物乳杆菌X2发酵黄芪提取多糖和未发酵黄芪提取多糖提取率图。
图5是枯草芽孢杆菌CCFM1162、植物乳杆菌X2发酵石斛提取多糖在屏障修复的应用。
图6是枯草芽孢杆菌CCFM1162、植物乳杆菌X2发酵黄芪提取多糖免疫方面的应用。
图7是石斛未发酵多糖分子量分布图。
图8是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛多糖分子量分布图。
图9是石斛未发酵多糖分子量分布图。
图10是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛多糖分子量分布图。
图11是石斛未发酵多糖单糖组成图。
图12是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛多糖单糖组成图。
图13是石斛未发酵多糖单糖组成图。
图14是枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛多糖单糖组成图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。
1)提取率计算方法：按照以下公式计算发酵中药提取多糖的提取率：
提取率＝(发酵后提取多糖含量/未发酵中药原料含量)×100％
2)活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
3)细胞存活率＝(给药组OD～空白组OD)/(阴性组OD～空白组OD)*100％。
4)细胞抑制率＝1-细胞存活率。
5)LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。使用时加入1000ml水，高压灭菌。
6)LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加15g的琼脂。
下述实例中涉及的人永生化皮质形成细胞(HaCaT细胞)购自中国典型培养物保藏中心；下述实例中涉及的DMEM培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；下述实例中涉及的胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的MTT工作液购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
样本来源于云南丽江的泡菜，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5mL样本加到4.5mL生理盐水中，以含有9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在LB固体培养基上，于37℃培养48h，挑取枯草芽孢杆菌的典型菌落至LB固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至LB液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株，命名为CCFM1162；其中，枯草芽孢杆菌的典型菌落呈现表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
2、鉴定
提取菌株CCFM1162的基因组，将菌株CCFM1162的16S rDNA进行扩增和测序，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示该菌株CCFM1162为枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2石斛粗多糖的提取
具体步骤如下：
(1)配制石斛原料发酵培养基：40g/L石斛原料、10g/L的酵母浸粉和10g/LNaCl混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备石斛原料发酵液：将步骤(1)中的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在石斛原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入枯草芽孢杆菌CCFM1162，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15～16h，此时，活菌数达到≥109cfu/mL；继续发酵至24h，达到发酵终点，获得石斛原料发酵液。
(3)提取石斛多糖：将步骤(2)中的石斛原料发酵液在超声清洗机中以500w，80℃，超声10min，而后8000g离心5min，除掉菌体和石斛原料发酵液残渣，得到石斛原料发酵液上清；将浓度为800g/L的三氯乙酸以质量体积比5％的添加量加入石斛原料发酵液上清中，在4℃冰箱中放置30min，然后8000g离心5min，以除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质；将去除蛋白质的石斛原料发酵液上清与95％的乙醇以体积比1:4的比例混合均匀后，在4℃冰箱中放置过夜，8000g离心5min，得到石斛粗多糖。用超纯水以体积比1:1的比例复溶石斛粗多糖至无明显固体沉淀，放置在平板中，在真空冷冻干燥机中干燥46h，得到石斛粗多糖粉末。(发酵石斛提取粗多糖图片可见图1)
未发酵多糖的提取方法为不发酵直接使用超声法，具体步骤同步骤(3)。
根据图3，可见发酵后超声法提取石斛粗多糖较未发酵提取石斛粗多糖提取率提高，发酵后石斛多糖的提取率是未发酵石斛多糖提取的1.13倍。
实施例3黄芪粗多糖的提取
具体步骤如下：
(1)配制黄芪原料发酵培养基：80g/L黄芪原料、10g/L的酵母浸粉和10g/LNaCl混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄芪原料发酵液：将步骤(1)中的灭过菌的黄芪原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄芪原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入枯草芽孢杆菌CCFM1162，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15～16h，此时，活菌数达到≥109cfu/mL；继续发酵至24h，达到发酵终点，获得黄芪原料发酵液。
(3)提取黄芪多糖：将步骤(2)中的黄芪原料发酵液在超声清洗机中以500w，25℃，超声10min，而后8000g离心5min，除掉菌体和黄芪原料发酵液残渣，得到黄芪原料发酵液上清；将浓度为800g/L的三氯乙酸以质量比5％的添加量加入黄芪原料发酵液上清中，在4℃冰箱中放置30min，然后8000g离心5min，以除掉黄芪原料发酵液上清中的蛋白质。将去除蛋白质的黄芪原料发酵液上清与95％的乙醇以体积比1:4的比例混合均匀后，在4℃冰箱中放置过夜，8000g离心5min，得到黄芪粗多糖，用超纯水以体积比1:1的比例复溶黄芪粗多糖至无明显固体沉淀，放置在平板中，在真空冷冻干燥机中干燥46h，得到黄芪粗多糖粉末。(发酵黄芪提取粗多糖图片可见图2)
未发酵多糖的提取方法为不发酵直接使用超声法，具体步骤同步骤(3)。
根据图4，可见发酵后超声法提取黄芪粗多糖较未发酵提取黄芪粗多糖提取率显著提高，发酵后黄芪多糖的提取率是未发酵黄芪多糖提取率的1.72倍。
在已有研究中，温浸法提取多糖利用“相似相溶”原理，将原料中大分子多糖通过加热，利用溶剂水将多糖有效溶解出，其工艺安全，成本低廉，适宜大规模生产。而超声法提取多糖，可将菌体表面的多糖通过超声波萃取下来，将原料中的粗多糖通过超声波空化作用，形成高温和高压的环境，增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力，从而将中药原料中大分子多糖分解成可以利用的小分子多糖，加速目标成分多糖进入溶剂，提高多糖的提取率。利用超声法提取中药粗多糖，不但提高了多糖提取率，而且节约溶剂、时间，避免高温对中药多糖活性产生影响。而本发明中将二者相结合，将菌体表面产生的多糖剥离，将原料中的多糖有效溶解出来，既节约了成本，又节约了时间，且将发酵液中的多糖充分提取出，极大提高了发酵后多糖的提取率，而且利于大规模工业化生产，有很好的的应用价值。
实施例4石斛发酵多糖在皮肤屏障修复的应用
具体步骤如下：
(1)细胞培养：于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养人角质形成细胞HaCaT细胞，待细胞达到90％融合时传代培养。弃去培养基，PBS洗去残余培养基，经浓度为2.5g/L的胰酶消化，添加完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％胎牛血清+100U/mL青链霉素)终止消化，吹打并收集细胞悬液，1000rpm离心5min，完全培养基重悬细胞，传代培养。取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)MTT法检测细胞活率：实验分组为空白组、阴性对照组、SDS模型组和多糖干预组，除空白组不含细胞外其它3组均接种细胞，每组设3个重复孔。将步骤(1)中的HaCaT细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中培养24h；阴性对照组更换新鲜完全培养基，SDS模型组和多糖干预组弃去原培养液并更换含50μg/mL SDS的完全培养基继续培养24h；阴性对照组和SDS模型组更换完全培养基，多糖干预组更换含有1000μg/mL的实施例2制备的石斛粗多糖的完全培养基继续孵育24h。弃去培养液，PBS洗去残余培养液，每孔添加100μLMTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液，过滤除菌后，于-20℃冰箱避光保存。使用时，将MTT储存液按1：9的比例添加到无血清培养基中配制MTT工作液)，于培养箱中继续孵育3～4h，弃去MTT工作液，每孔加入150μLDMSO溶液，于振荡器上中速震荡5min后，酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值)。
表1发酵石斛粗多糖和未发酵石斛粗多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率的影响
分组 细胞存活率
阴性对照组 100.00％
SDS模型组 63.43％
1000μg/mL未发酵石斛粗多糖 63.20％
1000μg/mL枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛粗多糖 87.68％
根据图5、表1，发酵后石斛粗多糖对HaCaT细胞皮肤屏障的修复效果比未发酵石斛粗多糖对HaCaT细胞皮肤屏障的修复效果有显著提升。表明本发明枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛提取多糖在屏障修复的方面有潜在的价值。
实施例5黄芪发酵多糖在皮肤免疫调节的应用
具体步骤如下：
(1)细胞培养：于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞，待细胞达到90％融合时传代培养。弃去培养基，PBS洗去残余培养基，加入2mL完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％胎牛血清+100U/mL青链霉素)，用细胞刮刀将细胞刮打下来，吹打均匀收集至离心管，1200rpm离心3min，收集细胞沉淀，完全培养基重悬细胞，传代培养。取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)NO含量评价发酵多糖的效果：实验分组为阴性对照组、LPS模型组和多糖干预组。将步骤(1)中培养的RAW264.7细胞接种于6孔板中培养，每孔1×105个细胞，培养24h。阴性对照组更换新鲜完全培养基，LPS模型组和多糖干预组更换含5μg/mL LPS的完全培养基，继续培养24h。阴性对照组和LPS模型组更换新鲜完全培养基，多糖干预组更换含有1000μg/mL的实施例3中的黄芪多糖的完全培养基，继续培养24h。细胞处理后，分别取各组培养上清50μL于96板中，加入格里斯试剂检测NO含量。酶标仪检测540nm波长吸光度(OD)，制作标准曲线，计算NO含量。
表2发酵黄芪粗多糖和未发酵黄芪粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
Figure BDA0003222965730000081
Figure BDA0003222965730000091
根据图6、表2，发酵后黄芪粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的免疫效果比未发酵黄芪粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的免疫效果好。表明本发明枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵黄芪提取多糖在皮肤免疫调节的应用。
实施例6石斛多糖分子量分布
具体步骤如下：
(1)准确称取50mg不同分子量的葡聚糖标准品，分别为Dextran T-2000(Mw2000000)、Dextran T-300(Mw 300600)、Dextran T-150(Mw 135030)、Dextran T-10(Mw9750)、Dextran T-5(Mw 2700)和葡萄糖(Mw 180)，将标准品置于10mL容量瓶中，以0.1MNaNO3溶解并定容至10mL，随后使用0.22μm的滤膜过滤。
(2)采用高效液相色谱仪和2410示差折光检测器，进样量为5μL，色谱柱(UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2)与保护柱(Agilent，PL aquagel-OH Guard8μm，50mm×7.5mm)串联，流动相为0.1M硝酸钠溶液，流速0.8mL/min，柱温箱40℃。根据标准样品的保留时间以及峰面积，积分计算未发酵石斛多糖和实施例2中的石斛多糖样品的分子量分布范围。
表3石斛未发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 13.750 185905 993907 531228 443436 100.00
表4石斛发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 15.974 18906 80141 34853 452593 79.35
2 18.754 1042 1305 1156 117764 20.65
根据图7、图8、表3、表4，发酵后石斛多糖中的较大分子量多糖较未发酵石斛中的较大分子量多糖减小，表明枯草芽孢杆菌CCFM1162可以将石斛原料中大分子多糖分解成小分子多糖。
实施例7黄芪多糖分子量分布
具体步骤如下：
(1)准确称取50mg不同分子量的葡聚糖标准品，分别为Dextran T-2000(Mw2000000)、Dextran T-300(Mw 300600)、Dextran T-150(Mw 135030)、Dextran T-10(Mw9750)、Dextran T-5(Mw 2700)、葡萄糖(Mw 180)，将上述标准品置于10mL容量瓶中，以0.1MNaNO3溶解并定容至10mL，随后使用0.22μm的滤膜过滤。
(2)采用高效液相色谱仪和2410示差折光检测器，进样量为5μL，色谱柱(UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2)与保护柱(Agilent，PL aquagel-OH Guard8μm，50mm×7.5mm)串联，流动相为0.1M硝酸钠溶液，流速0.8mL/min，柱温箱40℃。根据标准样品的保留时间以及峰面积，积分计算未发酵黄芪多糖和实施例3中的黄芪多糖样品的分子量分布范围。
表5黄芪未发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 14.883 6548 415790 132532 210530 100.00
表6黄芪发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 13.814 53581 577788 491236 226540 64.94
2 19.000 1047 2066 855 122315 35.06
根据图9、图10、表5、表6，发酵后黄芪多糖中的较大分子量多糖较未发酵黄芪中的较大分子量多糖减小，表明枯草芽孢杆菌CCFM1162可以将黄芪原料中大分子多糖分解成小分子多糖。
实施例8石斛多糖的单糖组分
具体步骤如下：
(1)准确称取10mg实施例2中的石斛多糖样品于安瓿管中，加入浓度4mol/L的三氟乙酸(TFA)1mL，真空封管。在120℃高温条件下水解反应2h，氮气吹干，水解后的溶液分别加入0.3mol/LNaOH和0.5mol/LPMP(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮，甲醇溶解)各0.5mL，70℃水浴1h，冷却至室温，加0.3mol/LHCl 0.5mL后，加0.5mL氯仿，振荡摇匀后静置20min，弃去下层氯仿层，萃取三次，水层过膜上机。
(3)Agilent 1200配紫外检测器，检测波长245nm；色谱柱：SHISEIDO C18(4.6mm*250mm*5urn)；流动相洗脱液：水，0.1M KH2PO4，乙腈。柱温：25℃；进样体积：10μL，流速：1mL/min。
表7石斛未发酵多糖单糖组成
Figure BDA0003222965730000101
Figure BDA0003222965730000111
表8石斛发酵多糖单糖组成
组别 名称 保留时间 相对面积 面积 浓度
No. min ％ nC*min Mg/L
1 鼠李糖 6.692 0.09 0.0462 1.8915
2 阿拉伯糖 7.209 1.96 0.9692 26.6495
3 半乳糖 9.267 6.43 3.183 78.6919
4 葡萄糖 10.525 46.19 22.8559 16.9615
5 木糖 12.625 1.77 0.8738 21.0610
6 甘露糖 13.1 42.47 21.0158 632.7350
7 半乳糖醛酸 22.284 0.65 0.3196 17.4965
8 葡萄糖醛酸 23.025 0.44 0.2163 9.5765
总和 49.4789
根据图11、图12、表7、表8，发酵后石斛多糖中的单糖组份较未发酵石斛中的单糖组份组分增加，且各单糖组份含量也有所差别，表明本发明枯草芽孢杆菌CCFM1162可以将石斛原料中的多糖转变成更新型多糖。
实施例9黄芪多糖的单糖组份
具体步骤如下：
(1)准确称取10mg实施例3中的黄芪多糖样品于安瓿管中，加入浓度4mol/L的三氟乙酸(TFA)1mL，真空封管。在120℃高温条件下水解反应2h，氮气吹干，水解后的溶液分别加入0.3mol/LNaOH和0.5mol/LPMP(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮，甲醇溶解)各0.5mL，70℃水浴1h，冷却至室温，加0.3mol/LHCl 0.5mL后，加0.5mL氯仿，振荡摇匀后静置20min，弃去下层氯仿层，萃取三次，水层过膜上机。
(3)Agilent 1200配紫外检测器，检测波长245nm；色谱柱：SHISEIDO C18(4.6mm*250mm*5urn)；流动相洗脱液：水，0.1M KH2PO4，乙腈。柱温：25℃；进样体积：10μL，流速：1mL/min。
表9黄芪未发酵多糖单糖组成
Figure BDA0003222965730000112
Figure BDA0003222965730000121
表10黄芪发酵多糖单糖组成
组别 名称 保留时间 相对面积 面积 浓度
min ％ nC*min Mg/L
1 岩藻糖 3.15 0.17 0.135 3.6555
2 鼠李糖 6.65 1.42 1.1195 45.8352
3 阿拉伯糖 7.1 20.27 15.9255 437.8934
4 半乳糖 9.009 8.48 6.6656 164.7905
5 葡萄糖 10.159 59.19 46.5147 1553.3435
6 木糖 12.742 10.46 8.2233 4.4045
总和 100 78.5837
根据图13、图14、表9、表10，发酵后黄芪多糖中的单糖组份较未发酵黄芪中的单糖组份组分减少，且各单糖组份含量也有所差别，表明本发明枯草芽孢杆菌CCFM1162可以将黄芪原料中的多糖转变成更新型多糖。
对比例1
具体步骤如下：
(1)配制石斛原料发酵培养基：40g/L石斛原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL的吐温80混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备石斛原料发酵液：将步骤(1)中的灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在石斛原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入同批次筛选到的瑞士乳杆菌M10，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15～16h，此时，活菌数达到2.1×107cfu/mL；
表11发酵中药原料菌株增殖活菌数
菌株 活菌数(cfu/mL)
初始接种活菌数 1.0×10<sup>6</sup>
枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵石斛原料 ≥10<sup>9</sup>
枯草芽孢杆菌CCFM1162发酵黄芪原料 ≥10<sup>9</sup>
瑞士乳杆菌M10发酵石斛原料 2.1×10<sup>7</sup>
保加利亚乳杆菌13-1发酵黄芪原料 ND
植物乳杆菌X2发酵石斛原料 1.6×10<sup>8</sup>
植物乳杆菌X2发酵黄芪原料 1.9×10<sup>9</sup>
根据表11，以同样条件接入瑞士乳杆菌M10，但是却未有明显增殖，可见瑞士乳杆菌M10未能发酵石斛原料。
对比例2
具体步骤如下：
(1)配制黄芪原料发酵培养基：80g/L黄芪原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL的吐温80混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄芪原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄芪原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄芪原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入保加利亚乳杆菌13-1，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15-16h，此时，未发现有菌株存活；
根据表11，以同样条件接入保加利亚乳杆菌13-1，但是却未有增殖，可见保加利亚乳杆菌13-1未能发酵黄芪原料。
对比例3
具体步骤如下：
(1)配制石斛原料发酵培养基：40g/L石斛原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL的吐温80混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备石斛原料发酵液：将步骤(1)中的灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在石斛原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入植物乳杆菌X2，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15～16h，此时，活菌数达到1.6×108cfu/mL；
(3)提取石斛多糖的方法同实施例2，得到石斛粗多糖粉末；
(4)检测步骤(3)的石斛粗多糖在皮肤屏障修护的应用，具体实施方式同实施例4。
表12发酵石斛粗多糖和未发酵石斛粗多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率的影响
Figure BDA0003222965730000141
根据图3，可见利用植物乳杆菌X2发酵的石斛原料发酵后多糖较未发酵前提取率显著提高，发酵后石斛粗多糖提取率是未发酵石斛粗多糖提取率的1.76倍。但是，根据图5、表12，发酵后石斛粗多糖对HaCaT细胞在皮肤屏障的修复效果和未发酵石斛粗多糖对皮肤屏障的修复效果未有显著提升。表明本发明植物乳杆菌X2发酵石斛提取多糖在屏障修复方面未有明显效果。
对比例4
(1)配制黄芪原料发酵培养基：80g/L黄芪原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL的吐温80混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄芪原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄芪原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄芪原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入植物乳杆菌X2，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15-16h，此时，活菌数达到1.9×109cfu/mL；
(3)提取黄芪多糖的方法同实施例3，得到黄芪粗多糖粉末；
(4)检测步骤(3)的黄芪粗多糖在免疫的应用，具体实施方式同实施例5。
表13发酵黄芪粗多糖和未发酵黄芪粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
Figure BDA0003222965730000142
根据图4，可见利用植物乳杆菌X2的黄芪原料发酵后多糖较未发酵前提取率明显降低，是未发酵黄芪粗多糖的0.69倍。但是根据图6、表13，发酵后黄芪粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量在各浓度下对皮肤免疫的调节效果比未发酵黄芪粗多糖对皮肤免疫的调节效果有显著提升。表明植物乳杆菌X2发酵黄芪提取多糖在调节皮肤免疫的应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌CCFM1162(Bacillus subtilis)，于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61715，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一种发酵中药原料及提取发酵多糖的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CCFM1162接种至以中药原料为唯一碳源的培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)超声处理步骤(1)中的发酵液，离心并收集发酵上清液；在发酵上清液中加入三氯乙酸，孵育后离心并收集上清液；在上清液中加入乙醇，孵育后离心获得沉淀；
(3)用超纯水复溶步骤(2)中的沉淀后，真空冷冻干燥，获得发酵多糖粉末。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养基的组成包括干重40～80g/L的中药原料，10～40g/L的增殖因子和10～40g/L的无机盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述中药原料的制备方法为将新鲜或干燥的中药原料粉碎至60目以下；所述增殖因子选自酵母浸粉、酵母提取物、酵母蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨中的一种或多种；所述无机盐选自氯化钠、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾中的一种或多种。
5.根据权利要求2～4任一所述的方法，其特征在于，所述中药原料包括石斛或黄芪。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，枯草芽孢杆菌的接种量为1.0×106～1.0×107cfu/mL；发酵的条件为：温度为32～38℃，pH为5.5～7.0，发酵时间为15～24h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，超声处理的条件为：温度25～80℃，超声功率200～500w，时间为10～30min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，三氯乙酸的浓度为750～850g/L，以质量比2％～5％的添加量添加至发酵上清液中，孵育时间为30～60min，温度为0～4℃；乙醇的浓度为90～95％，孵育时间为12～16min，温度为0～4℃。
9.利用权利要求2～8任一所述方法制备得到的含石斛多糖的组合物或含黄芪多糖的组合物。
10.权利要求9所述含石斛多糖的组合物或含黄芪多糖的组合物在制备预防或治疗皮肤屏障修护和/或皮肤免疫调节的产品中的应用。
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GR01 Patent grant
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