CN114231575B - 一种石斛多糖及其制备方法与应用 - Google Patents
一种石斛多糖及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114231575B CN114231575B CN202111133449.1A CN202111133449A CN114231575B CN 114231575 B CN114231575 B CN 114231575B CN 202111133449 A CN202111133449 A CN 202111133449A CN 114231575 B CN114231575 B CN 114231575B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- dendrobium
- dendrobe
- fermentation
- raw material
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 240
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 227
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 227
- 241001523681 Dendrobium Species 0.000 title claims abstract description 153
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 110
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 110
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 96
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 claims abstract description 48
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 claims abstract description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 25
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 23
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 15
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 15
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 15
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 15
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 15
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 12
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 10
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 10
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 6
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 23
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 17
- 240000004638 Dendrobium nobile Species 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 13
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 13
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 13
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 13
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 12
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 12
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 12
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 11
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 11
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 11
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 11
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 4
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000036559 skin health Effects 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- RYAHJFGVOCZDEI-UFFNCVEVSA-N Dendrobine Chemical compound C([C@H]1CC[C@@H]2[C@@]31C)N(C)[C@@H]3[C@H]1[C@@H](C(C)C)[C@@H]2C(=O)O1 RYAHJFGVOCZDEI-UFFNCVEVSA-N 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003471 anti-radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- RYAHJFGVOCZDEI-CZKZLRAZSA-N dendrobine Natural products O=C1O[C@@H]2[C@H](C(C)C)[C@H]1[C@H]1[C@@]3(C)[C@@H]2N(C)C[C@H]3CC1 RYAHJFGVOCZDEI-CZKZLRAZSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及发酵工程技术领域,公开了一种石斛多糖及其制备方法与应用。本发明提供的石斛多糖的制备方法,以石斛为发酵原料,罗伊氏乳杆菌为发酵菌种,发酵,经罗伊氏乳杆菌发酵后,石斛多糖的得率提高了60%~70%;所得到的石斛多糖可以显著提高经SDS诱导的HaCaT细胞存活率,即可以提高皮肤屏障修复效果;可以降低经LPS诱导的RAW264.7细胞中NO含量,即可以提高免疫调节功效;可见,本发明提供的制备方法不仅可以提高提高石斛多糖的提取率,还可以提高所得到的石斛多糖的皮肤屏障修复效果和免疫调节功效,且效果优于未发酵石斛多糖。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域,具体涉及一种石斛多糖及其制备方法与应用。
背景技术
石斛味甘,性微寒,具有益胃生津,滋阴清热的功效。研究表明,石斛中含有的主要活性成分为石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分,多糖是其最主要的有效成分, 多糖含量的高低决定石斛生物活性的强弱,其具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等作用,在化妆品原料开发中具有很好的应用前景。目前通过酶提法、酸提法、碱提法、水提法、超声提取等多种方法提取多糖并应用于化妆品。
近几年有研究表明:通过微生物法发酵石斛可提高多糖的提取量,微生物在生长代谢过程中分泌大量的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖苷酶、淀粉酶、果胶酶等胞外酶,可使植物细胞破裂,细胞间隙增大,加快中药有效成分的溶出,有效提高中药有效成分的提取率。通过微生物发酵不仅可以提高多糖的提取率,而且通过微生物的生物转化作用,可以将原有的植物多糖转化成活性更高的新型发酵多糖;此外,部分微生物在发酵过程中,可利用小分子碳水化合物自身合成胞外多糖,尤其一些乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌,利用该微生物发酵石斛不仅可以纯化石斛多糖,而且产生的菌体胞外多糖与石斛多糖起到协同增效作用。但微生物的上述作用依赖于菌株的代谢酶系,具有很强的株特异性,有的菌株无法利用石斛原料进行发酵增殖,有的菌株即使增殖亦无法进行多糖的生物转化,有的菌株甚至会降低多糖的活性,能够产胞外多糖的菌株亦具有很强的特异性。
近年来,肠道益生菌被广泛研究,被证明具有绝对安全性和广泛的功效潜能。利用益生菌发酵石斛原料,挖掘能够发酵石斛提高多糖其得率,提高发酵后多糖的活性的菌株和发酵工艺,不但可以节约石斛资源,还可以提高石斛的有效性及应用范围。
石斛多糖在皮肤健康中的应用一直被关注,其在增加细胞活性、皮肤免疫、抗氧化、抗辐射、保湿等方面都有应用。皮肤作为人体的第一道防线,对抵御外界有害因素的损伤以及维持人体内环境的稳态有着至关重要的作用。皮肤的屏障功能是防止外界物质进入人体和体内水分丢失的主要屏障,而皮肤屏障受损和皮肤免疫应答反应同时发生。皮肤屏障功能受损导致皮肤免疫应答失调,而皮肤免疫应答失调会加重皮肤屏障受损,从而恶性循环。只有在维持皮肤屏障完整性同时促使皮肤免疫应答正常化,才是保证皮肤健康的重要凭证。而石斛多糖既可以修复皮肤屏障功能,又能用于调节皮肤免疫。但是,目前尚无能够有效发酵石斛原料,在提高发酵多糖得率的同时,对皮肤屏障修复和皮肤免疫调节功效均提高的菌株和发酵工艺。因此,利用现代发酵工程技术使发酵过程中限制性因素得到解决,使中药原料得到充分的开发利用,提高其有效成分多糖得率,筛选出一株益生菌能够发酵石斛原料,且发酵后提取多糖在屏障修复和免疫调节功效方面均提高,具有重要价值。
发明内容
本发明的第一方面的目的,在于提供一种石斛多糖的制备方法。
本发明的第二方面的目的,在于提供本发明第一方面的制备方法得到的石斛多糖。
本发明的第三方面的目的,在于提供本发明第一方面的制备方法和/或本发明第二方面的石斛多糖在制备产品中的应用。
本发明的第四方面的目的,在于提供一种产品。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种石斛多糖的制备方法,将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)接种于发酵原料中,发酵,得到石斛多糖;
所述发酵原料包含石斛。
在本发明的一种实施方式中,所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CCFM8631(Lactobacillus reuteri),罗伊氏乳杆菌CCFM8631(Lactobacillus reuteri)于2017年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC NO.14394;已在专利文献CN107523526A中公开。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵原料还包含乳杆菌增殖因子和微量元素。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛为石斛粉末。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛粉末的制备方法如下:将石斛粉碎至全部过60目。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛为新鲜石斛或干石斛。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵原料包含:40~80g/L石斛、10~40g/L乳杆菌增殖因子和0.1~1.0g/L微量元素;进一步地,所述发酵原料包含:40~60g/L石斛、10~25g/L乳杆菌增殖因子和0.25~0.83g/L微量元素。
在本发明的一种实施方式中,所述乳杆菌增殖因子为酵母浸粉、酵母提取物、酵母蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白胨中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中,所述微量元素为硫酸镁和硫酸锰中的至少一种;进一步为硫酸镁和硫酸锰。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵原料还包含助溶剂。
在本发明的一种实施方式中,所述助溶剂为吐温-80。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵原料的pH为5~7;进一步为6~7。
在本发明的一种实施方式中,所述罗伊氏乳杆菌的接种量按罗伊氏乳杆菌的终浓度计为1.0×106~5.0×107cfu/mL;进一步为1.0×106~1.0×107cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵的条件为32~38℃下发酵15~24h;进一步为36.5~37.5℃下发酵16~24h。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵的pH为5~7;进一步为6~7。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵为恒温恒pH发酵。
在本发明的一种实施方式中,所述制备方法还包括如下步骤:超声提取;固液分离,得到上清液a;除蛋白,得到上清液b;醇沉。
在本发明的一种实施方式中,所述超声提取的条件为:温度为20~90℃,超声功率为100~500w,时间为10~60min;进一步为:温度为25~80℃,超声功率为200~500w,时间为10~30min。
在本发明的一种实施方式中,所述固液分离的方式为离心。
在本发明的一种实施方式中,所述离心的条件为6000~10000g下离心5~20min;进一步为6000~8000g下离心5~15min。
在本发明的一种实施方式中,所述除蛋白的方法为:将上清液a与三氯乙酸混合,静置,离心,得到上清液b。
在本发明的一种实施方式中,三氯乙酸的添加量按三氯乙酸在三氯乙酸与上清液a的混合液中的体积百分比计为2%~8%;进一步为2%~5%。
在本发明的一种实施方式中,所述三氯乙酸的浓度为700~900g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述除蛋白的方法中静置的条件为0~4℃下静置30~60min。
在本发明的一种实施方式中,所述除蛋白的方法中离心的条件为6000~10000g下离心5~20min。
在本发明的一种实施方式中,所述醇沉的方法为:将上清液b与乙醇混合,静置,离心,得到石斛多糖。
在本发明的一种实施方式中,所述上清液b与乙醇混合后乙醇的终浓度为60~90%。
在本发明的一种实施方式中,所述醇沉的方法中静置的条件为0~4℃下静置8~14h。
在本发明的一种实施方式中,所述醇沉的方法中离心的条件为6000~10000g下离心5~20min。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛多糖的制备方法还包括如下步骤:将醇沉得到的石斛多糖与水混合至无沉淀,干燥,得到石斛多糖粉末。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛多糖与水的质量比为1:1~1:2。
在本发明的一种实施方式中,所述干燥的条件为:预冻温度为-60~-50℃,时间为3~5h;一次干燥温度为-25~-35℃,压力为180~220μbar,时间为22~26h;二次干燥温度为20~30℃,压力为0μbar,时间为15~20h。
本发明的第二个方面,提供一种石斛多糖,通过本发明第一方面的制备方法得到。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛多糖的重均分子量小于32000;进一步为1500~32000;更进一步为1619~30827。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛多糖的单糖组成为木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。
在本发明的一种实施方式中,所述石斛多糖中木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的质量比为(60~75):(25~32):(1~4):(0.5~1)。
本发明的第三个方面,提供第二方面的石斛多糖在制备产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述产品用于:
(1)修复皮肤屏障;和/或
(2)提高免疫力。
在本发明的一种实施方式中,所述产品用于:
(1)修复皮肤屏障;和/或
(2)提高皮肤免疫力。
在本发明的一种实施方式中,所述产品包括保健食品、药品和化妆品。
本发明的第四个方面,提供一种产品,包含本发明第二方面的石斛多糖。
在本发明的一种实施方式中,所述产品用于:
(1)修复皮肤屏障;和/或
(2)提高免疫力。
在本发明的一种实施方式中,所述产品用于:
(1)修复皮肤屏障;和/或
(2)提高皮肤免疫力。
在本发明的一种实施方式中,所述产品包括保健食品、药品和化妆品。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种石斛多糖的制备方法,以石斛为发酵原料,罗伊氏乳杆菌为发酵菌种,发酵,经罗伊氏乳杆菌发酵后,石斛多糖的得率提高了60%~70%;所得到的石斛多糖可以显著提高经SDS诱导的HaCaT细胞存活率,即可以提高皮肤屏障修复效果;可以降低经LPS诱导的RAW264.7细胞中NO含量,即可以提高免疫调节功效;可见,本发明提供的制备方法不仅可以提高石斛多糖的提取率,还可以提高所得到的石斛多糖的皮肤屏障修复效果和免疫调节功效,且效果优于未发酵石斛多糖。
本发明通过添加乳杆菌增殖因子和有利于促进罗伊氏乳杆菌增殖的微量元素,使罗伊氏乳杆菌能够在包含石斛的发酵原料中快速增殖。
本发明通过限定超声提取条件为温度为20~90℃,超声功率为100~500w,时间为10~60min;将温浸法与超声法相结合:其中,温浸法提取多糖利用“相似相溶”原理,将原料中大分子多糖通过加热,利用溶剂水将多糖有效溶解出,其工艺安全,成本低廉,适宜大规模生产;超声法提取多糖,可将菌体表面的多糖通过超声波萃取下来,将原料中的粗多糖通过超声波空化作用,形成高温和高压的环境,增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力,从而将石斛原料中大分子多糖分解成可以利用的小分子多糖,加速目标成分多糖进入溶剂,提高多糖的提取率,利用超声法提取石斛多糖,不但提高了多糖提取率,而且节约溶剂、时间,避免高温对石斛多糖活性产生影响;而本发明中将二者相结合,将菌体表面产生的多糖剥离,将原料中的多糖有效溶解出来,既节约了成本,又节约了时间,且将发酵液中的多糖充分提取出,极大提高了发酵后多糖的提取率,而且利于大规模工业化生产,有很好的的应用价值。
本发明提供了一种石斛多糖,与未发酵石斛多糖相比,该石斛多糖中的大分子量多糖显著减少,单糖组分减少(未发酵石斛多糖中单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,本发明的石斛多糖中单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖),且各单糖组分含量有所差别;该石斛多糖可用于制备保健食品、药品和化妆品。
附图说明
图1是实施例1得到的石斛多糖粉末的直观图。
图2是不同提取方法的多糖提取率图:**表示“与对比例1相比,p<0.01”。
图3是不同提取方法得到的石斛多糖处理SDS诱导的HaCaT细胞后的存活率图:**表示“与模型组相比,p<0.01”。
图4是不同提取方法得到的石斛多糖处理LPS诱导的RAW264.7细胞后的NO含量图:**表示“与模型组相比,p<0.01”。
图5是实施例1得到的石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)的液相色谱图。
图6是对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)的液相色谱图。
图7是对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)的水解产物的液相色谱图。
图8是实施例1得到的石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)的水解产物的液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特别说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例中涉及罗伊氏乳杆菌CCFM8631(Lactobacillus reuteri),于2017年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC NO.14394;已在专利文献CN107523526A中公开。
下述实施例中提取率计算方法、活菌数检测方法、细胞存活率计算方法以及细胞抑制率的计算方法如下:
提取率=(发酵后/未发酵提取多糖含量/未发酵石斛原料含量)×100%;
活菌数的检测方法:采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》;
细胞存活率=(多糖干预组OD-空白组OD)/(阴性对照组OD-空白组OD)*100%;
细胞抑制率=1-细胞存活率。
下述实施例中石斛原料的制备方法如下:将干燥石斛粉碎后,过60目筛备用。
下述实施例中的瑞士乳杆菌M10(Lactobacillus helveticus M10)由江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心提供,于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,保藏编号为GDMCC NO.60452;已在专利文献CN 109402019 A中公开。
下述实施例中的植物乳杆菌X1(Lactobacillus plantarum X1)由江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心提供,已在文献“王玉林,黄洁,崔树茂,等.植物乳杆菌最适生长底物解析及高密度培养工艺[J].食品与发酵工业,2020,46(4):19-27.”中公开。
下述实施例中的脆弱拟杆菌FAHBZ17K2(Bacteroides fragilis FAHBZ17K2)由江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心提供,从中国广西的人群粪便样本中筛选得到,已在文献“翟齐啸,陈卫,孙凤婷,等.一株能够调控肠道阿克曼菌属相对丰度的脆弱拟杆菌”中公开。
实施例1罗伊氏乳杆菌CCFM8631提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为40g/L,酵母浸粉的终浓度为10g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入罗伊氏乳杆菌CCFM8631(罗伊氏乳杆菌CCFM8631的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到5.0×108cfu/mL;
(3)继续发酵至24h,达到发酵终点,得到石斛原料发酵液;利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料发酵液在超声清洗机中以500w功率,80℃,超声10min;然后,8000g,5min离心,除掉菌体和石斛原料发酵液残渣,得到石斛原料发酵液上清;
(4)在石斛原料发酵液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的5%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与95%的乙醇以1:4比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末(如图1所示)。
实施例2罗伊氏乳杆菌CCFM8631提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为80g/L,酵母浸粉的终浓度为25g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入罗伊氏乳杆菌CCFM8631(罗伊氏乳杆菌CCFM8631的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到8.0×108cfu/mL;
(3)继续发酵至24h,达到发酵终点,得到石斛原料发酵液;利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料发酵液在超声清洗机中以500w功率,80℃,超声10min;然后,8000g,5min离心,除掉菌体和石斛原料发酵液残渣,得到石斛原料发酵液上清;
(4)在石斛原料发酵液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的5%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与95%的乙醇以1:4比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末。
实施例3罗伊氏乳杆菌CCFM8631提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为40g/L,酵母浸粉的终浓度为10g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入罗伊氏乳杆菌CCFM8631(罗伊氏乳杆菌CCFM8631的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到5.0×108cfu/mL;
(3)继续发酵至24h,达到发酵终点,得到石斛原料发酵液;利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料发酵液在超声清洗机中以200w功率,25℃,超声30min;然后,8000g,5min离心,除掉菌体和石斛原料发酵液残渣,得到石斛原料发酵液上清;
(4)在石斛原料发酵液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的2%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与无水乙醇以1:9比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末。
对比例1超声法提取石斛多糖
(1)取干燥石斛原料,加纯净水混合,石斛原料的终浓度为40g/L,利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料在超声清洗机中以500w功率,80℃,超声10min;然后,8000g,5min离心,除掉石斛原料残渣,得到石斛原料提取液上清;
(2)在石斛原料提取液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的5%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料提取液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与95%的乙醇以1:4比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末。
对比例2瑞士乳杆菌M10提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为40g/L,酵母浸粉的终浓度为10g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入瑞士乳杆菌M10(瑞士乳杆菌M10的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到2.1×107cfu/mL。
由于瑞士乳杆菌M10未明显增殖,可见瑞士乳杆菌M10未能发酵石斛原料,因此,未继续进行发酵。
对比例3植物乳杆菌X1提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为40g/L,酵母浸粉的终浓度为10g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入植物乳杆菌X1(植物乳杆菌X1的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到1.9×108cfu/mL;
(3)继续发酵至24h,达到发酵终点,得到石斛原料发酵液;利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料发酵液在超声清洗机中以500w功率,80℃,超声10min;然后,8000g,5min离心,除掉菌体和石斛原料发酵液残渣,得到石斛原料发酵液上清;
(4)在石斛原料发酵液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的5%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与95%的乙醇以1:4比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末。
对比例4脆弱拟杆菌FAHBZ17K2提取石斛多糖
(1)石斛原料发酵培养基的配制:取干燥石斛原料、酵母浸粉、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80,混合,添加纯净水,定容(石斛原料的终浓度为40g/L,酵母浸粉的终浓度为10g/L,七水硫酸镁的终浓度为0.58g/L,硫酸锰的终浓度为0.25g/L,吐温-80的终浓度为0.1%(v/v)),调节pH值至7.0,于115℃条件下加热20min灭菌;
(2)将灭过菌的石斛原料发酵培养基冷却到40℃以下,于无菌环境下在石斛原料发酵培养基中加入脆弱拟杆菌FAHBZ17K2(脆弱拟杆菌FAHBZ17K2的终浓度为1.0×106cfu/mL),在温度37℃,pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵16h,此时,活菌数达到1.3×109cfu/mL;
(3)继续发酵至24h,达到发酵终点,得到石斛原料发酵液;利用超声法提取石斛多糖:将石斛原料发酵液在超声清洗机中以500w功率,80℃,超声10min;然后,8000g,5min离心,除掉菌体和石斛原料发酵液残渣,得到石斛原料发酵液上清;
(4)在石斛原料发酵液上清中添加三氯乙酸,三氯乙酸占三氯乙酸和上清的混合液的5%(v/v),三氯乙酸的浓度为800g/L,除掉石斛原料发酵液上清中的蛋白质;在4℃冰箱中放置30min,然后8000g,5min离心,得到的上清液与95%的乙醇以1:4比例(体积比)混合,沉淀多糖,在4℃冰箱中放置过夜;然后,8000g,5min离心,得到石斛多糖,用超纯水复溶石斛多糖(石斛多糖与超纯水的质量比为1:1)至无明显固体沉淀,将得到的溶液放置在平板中在真空冷冻干燥机中干燥46h(预冻温度为-50℃,时间为4h;一次干燥温度为-30℃,压力为200μbar,时间为24h;二次干燥温度为25℃,压力为0μbar,时间为18h),得到石斛多糖粉末。
效果实施例
1.石斛原料发酵培养基对不同菌株增殖活菌数的影响
不同菌株(罗伊氏乳杆菌CCFM8631、瑞士乳杆菌M10、植物乳杆菌X1、脆弱拟杆菌FAHBZ17K2)在石斛原料发酵培养基中发酵16h后,活菌数如表1所示:罗伊氏乳杆菌CCFM8631、植物乳杆菌X1、脆弱拟杆菌FAHBZ17K2在石斛原料发酵培养基中发酵后,活菌数显著增加,而瑞士乳杆菌M10在石斛原料发酵培养基中发酵后,却未有明显增殖,可见瑞士乳杆菌M10未能发酵石斛原料。
表1不同菌株在石斛原料发酵培养基中发酵16h后的活菌数
菌株 | 活菌数(cfu/mL) |
初始接种活菌数 | 1.0×106 |
罗伊氏乳杆菌CCFM8631(实施例1) | 5.0×108 |
罗伊氏乳杆菌CCFM8631(实施例2) | 8.0×108 |
瑞士乳杆菌M10(对比例2) | 2.1×107 |
植物乳杆菌X1(对比例3) | 1.9×108 |
脆弱拟杆菌FAHBZ17K2(对比例4) | 1.3×109 |
2.不同提取方法对石斛多糖提取率的影响
分别计算实施例1、2、3,对比例1、3、4方法的石斛多糖提取率,结果如图2所示:与石斛未发酵多糖(对比例1)相比,罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖(实施例1、2、3)、植物乳杆菌X1发酵石斛多糖(对比例3)可显著提高石斛多糖的提取率,尤其,罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖(实施例1)的提取率最高可达未发酵石斛多糖(对比例1)的1.65倍。
3.不同提取方法得到的石斛多糖的屏障修复效果
(1)细胞培养:于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养人角质形成细胞(HaCaT细胞),待细胞达到90%融合度时传代培养;弃去完全培养基,PBS洗去残余完全培养基,胰酶消化,添加完全培养基(90% DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+100U/mL青链霉素)终止消化,吹打并收集细胞悬液,1000rpm离心5min,完全培养基重悬细胞,传代培养;取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)MTT法检测细胞活率:实验分组为空白组(只含MTT工作液,无细胞)、阴性对照组、模型组、多糖干预组,每组设3个重复孔。空白组OD测量方法:每孔添加MTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液,过滤除菌后,于-20℃冰箱避光保存;使用时,将MTT储存液按1:9的比例(体积比)添加到无血清培养基中配置MTT工作液)100μL,于培养箱中继续孵育4h,弃去MTT工作液,每孔加入150μL DMSO溶液,于振荡器上中速震荡5min后,酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值);阴性对照组OD测量方法如下:将细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中培养72h,弃去原培养液,PB S洗去残余培养液,每孔添加MTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液,过滤除菌后,于-20℃冰箱避光保存;使用时,将MTT储存液按1:9的比例(体积比)添加到无血清培养基中配置MTT工作液)100μL,于培养箱中继续孵育4h,弃去MTT工作液,每孔加入150μL DMSO溶液,于振荡器上中速震荡5min后,酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值);模型组OD测量方法方法如下:将细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中培养24h,弃去原培养液,更换含SDS(50ug/mL)的完全培养基(称取SDS粉末,溶于PBS缓冲液,过滤除菌,使用时用完全培养基稀释到使用浓度)继续培养48h,弃去原培养液,PBS洗去残余培养液,每孔添加MTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液,过滤除菌后,于-20℃冰箱避光保存;使用时,将MTT储存液按1:9的比例(体积比)添加到无血清培养基中配置MTT工作液)100μL,于培养箱中继续孵育4h,弃去MTT工作液,每孔加入150μL DMSO溶液,于振荡器上中速震荡5min后,酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值);多糖干预组OD测量方法如下:将细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中培养24h,弃去原培养液,更换含SDS(50ug/mL)的完全培养基(称取SDS粉末,溶于PBS缓冲液,过滤除菌,使用时用完全培养基稀释到使用浓度)继续培养24h,更换含石斛多糖(实施例1、对比例1、3、4得到石斛多糖,终浓度为1000μg/mL)的完全培养基继续孵育24h;弃去培养液,PBS洗去残余培养液,每孔添加MTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液,过滤除菌后,于-20℃冰箱避光保存;使用时,将MTT储存液按1:9的比例(体积比)添加到无血清培养基中配置MTT工作液)100μL,于培养箱中继续孵育4h,弃去MTT工作液,每孔加入150μL DMSO溶液,于振荡器上中速震荡5min后,酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值)。计算不同方法得到浓度为1000μg/mL的石斛多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率,结果如表2及图3所示:与对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)相比,对比例3、4得到的石斛多糖(植物乳杆菌X1发酵石斛多糖、脆弱拟杆菌FAHBZ17K2发酵石斛多糖)处理SDS诱导的HaCaT细胞后,细胞存活率略有下降,而实施例1得到石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)处理SDS诱导的HaCaT细胞后,细胞存活率显著提高,表明:与对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)相比,对比例3、4得到的石斛多糖(植物乳杆菌X1发酵石斛多糖、脆弱拟杆菌FAHBZ17K2发酵石斛多糖)对皮肤屏障的修复效果无提升(甚至有所降低),而实施例1得到石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)可以显著提升皮肤屏障的修复效果。
表2不同方法得到的石斛多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率的影响
分组 | 细胞存活率 |
阴性对照组 | 100.00% |
模型组 | 69.04% |
石斛多糖浓度(μg/mL) | 1000 |
未发酵石斛多糖(对比例1) | 83.66% |
植物乳杆菌X1发酵石斛多糖(对比例3) | 81.49% |
脆弱拟杆菌FAHBZ17K2发酵石斛多糖(对比例4) | 73.36% |
罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖(实施例1) | 94.86% |
4.不同提取方法得到的石斛多糖的免疫效果
(1)细胞培养:于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞,待细胞达到90%融合时传代培养;弃去完全培养基,PBS洗去残余完全培养基,加入2mL完全培养基(90% DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+100U/mL青链霉素),用细胞刮刀将细胞刮打下来,吹打均匀收集至离心管,1200rpm离心3min,收集细胞沉淀,完全培养基重悬细胞,传代培养;取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)NO含量评价石斛多糖的效果:将细胞接种于6孔板中培养,每孔1×105个细胞,培养24h;随机分为阴性对照组、脂多糖(LPS)模型组、多糖干预组,每组3个复孔:阴性对照组更换完全培养基,模型组和干预组更换含LPS的完全培养基(LPS终浓度为5ug/mL),继续培养24h;阴性对照组和模型组更换完全培养基,干预组更换含石斛多糖的完全培养基(实施例1、对比例1得到石斛多糖,终浓度为1000μg/mL),继续培养24h;细胞处理后,分别取各组培养上清50uL于96板中,加入格里斯试剂检测NO含量;酶标仪检测540nm波长吸光度(OD),制作标准曲线,计算NO含量,结果如表3及图4所示:与对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)相比,实施例1得到石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)处理LPS诱导的RAW264.7细胞后NO含量有所下降,表明实施例1得到石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)的免疫效果优于对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)。
表3不同方法得到的石斛多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
分组 | NO含量(μM) |
LPS模型组 | 42.859 |
阴性对照组 | 13.420 |
石斛多糖浓度(μg/mL) | 1000 |
未发酵石斛多糖(对比例1) | 23.825 |
罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖(实施例1) | 22.556 |
5.不同提取方法得到的石斛多糖的分子量分布
(1)准确称取50mg如下葡聚糖标准品:Dextran T-2000(Mw 2000000)、Dextran T-300(Mw300600)、Dextran T-150(Mw 135030)、Dextran T-10(Mw 9750)、Dextran T-5(Mw2700)、葡萄糖(Mw 180)以及实施例1、对比例1得到的石斛多糖,分别将上述标准品及样品置于10mL容量瓶中,以0.1M NaNO3溶解并定容至10mL,随后使用0.22μm的滤膜过滤;
(2)采用高效液相色谱仪和2410示差折光检测器,进样量为5μL,色谱柱(UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2)与保护柱(Agilent,PL aquagel-OH Guard8μm,50mm×7.5mm)串联,流动相为0.1M硝酸钠溶液,流速为0.8mL/min,柱温为40℃。根据标准样品的保留时间以及峰面积,积分计算该样品的分子量分布范围,结果如表4、表5、图5、图6所示:对比例1得到的石斛多糖的重均分子量为1549~1001496(其中,重均分子量为1001496的石斛多糖的面积达99.44%,重均分子量为1549的石斛多糖的面积仅为0.56%),实施例1得到的石斛多糖的重均分子量为1619~30827(其中,重均分子量为30827的石斛多糖的面积达52.57%,重均分子量为16199的石斛多糖的面积为47.43%),即实施例1得到的大分子量多糖显著减少,罗伊氏乳杆菌CCFM8631可以将石斛原料中大分子多糖分解成小分子多糖。
表4对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)的分子量分布
表5实施例1得到的石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)的分子量分布
保留时间 | Mn(数均分子量) | Mw(重均分子量) | MP(峰位分子量) | 面积 | %面积 | |
1 | 17.483 | 9163 | 30827 | 7138 | 152977 | 52.57 |
2 | 18.651 | 1229 | 1619 | 1787 | 138004 | 47.43 |
6.不同提取方法得到的石斛多糖中单糖组成
(1)混标的制备和衍生:在真空密封安瓿管中,将各单标(岩藻糖,鼠李糖,阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖,木糖,甘露糖,果糖,半乳糖醛酸,葡萄糖醛酸)和混标(岩藻糖,鼠李糖,阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖,木糖,甘露糖,果糖,半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的混合物)溶解,配制浓度为1.0mg/mL标准溶液,精确吸取250μL混合标准溶液到5mL EP管中,分别加入0.3mol/L NaOH和0.5mol/L PMP(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮,甲醇溶解)各250μL,70℃水浴1h,冷却至室温,加入0.3mo1/L HC1溶液250μL终止反应,再加入250μL氯仿,振荡摇匀后静置20min,弃去下层氯仿层,萃取三次,水层过膜上机。
(2)样品的水解和衍生:分别准确称取实施例1及对比例1得到的石斛多糖10mg于安瓿管中,加入浓度4mol/L的三氟乙酸(TFA)1mL,真空封管;在120℃高温条件下水解反应2h,氮气吹干,水解后的溶液分别加入0.3mol/L NaoH和0.5mol/L PMP(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮,甲醇溶解)各0.1mL,70℃水浴1h,冷却至室温,加入0.3mol/L HCl溶液1mL终止反应,再加入1mL氯仿,振荡摇匀后静置20min,弃去下层氯仿层,萃取三次,水层过膜上机。
(3)Agilent 1200配紫外检测器,检测波长245nm;色谱柱:SHISEIDO C18(4.6mm*250mm*5urn);流动相洗脱液:83%(v/v)0.1M KH2PO4,17%(v/v)乙腈。柱温:25℃;进样体积:10uL,流速:1mL/min。实施例1及对比例1得到的石斛多糖中单糖组成如表6、表7及图7、图8所示:与对比例1得到的石斛多糖相比,实施例1得到的石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)中的单糖组分减少(对比例1得到的石斛多糖水解后单糖为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,实施例1得到的石斛多糖水解后单糖为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖),且各单糖含量不同,表明:罗伊氏乳杆菌CCFM8631可以将石斛原料中的多糖转变成新型多糖。
表6对比例1得到的石斛多糖(未发酵石斛多糖)的单糖组成
组别 | 名称 | 保留时间 | 相对面积 | 面积 | 浓度 |
No. | min | % | nC*min | Mg/L | |
1 | 阿拉伯糖 | 6.967 | 0.34 | 0.3126 | 8.5955 |
2 | 半乳糖 | 8.892 | 0.84 | 0.7732 | 19.1155 |
3 | 葡萄糖 | 10.059 | 36.65 | 33.7757 | 1127.9287 |
4 | 木糖 | 12.375 | 61.72 | 56.8803 | 1370.9767 |
5 | 半乳糖醛酸 | 22.15 | 0.25 | 0.2345 | 0.2855 |
6 | 葡萄糖醛酸 | 22.809 | 0.2 | 0.186 | 8.2351 |
最大值 | 61.72 | 56.8803 | |||
最小值 | 0.2 | 0.186 | |||
总和 | 100 | 92.1624 |
表7实施例1得到的石斛多糖(罗伊氏乳杆菌CCFM8631发酵石斛多糖)的单糖组成
组别 | 名称 | 保留时间 | 相对面积 | 面积 | 浓度 |
No. | min | % | nC*min | Mg/L | |
1 | 阿拉伯糖 | 6.917 | 0.71 | 0.1961 | 5.3920 |
2 | 半乳糖 | 8.859 | 2.93 | 0.8113 | 20.0575 |
3 | 葡萄糖 | 10.067 | 29.04 | 8.0504 | 268.8405 |
4 | 木糖 | 12.45 | 67.33 | 18.6681 | 449.9542 |
最大值 | 67.33 | 18.6681 | |||
最小值 | 0.71 | 0.1961 | |||
总和 | 100 | 27.7259 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种石斛多糖的制备方法,将罗伊氏乳杆菌CCFM8631接种于发酵原料中,发酵,超声提取,固液分离,除蛋白,醇沉,得到石斛多糖;
所述发酵原料包含石斛。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述发酵原料还包含乳杆菌增殖因子和微量元素。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述发酵原料包含:40~80g/L 石斛、10~40g/L 乳杆菌增殖因子和0.1~1.0g/L 微量元素。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述乳杆菌增殖因子为酵母浸粉、酵母提取物、酵母蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白胨中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述微量元素为硫酸镁和硫酸锰中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述发酵原料还包含助溶剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述发酵的条件为32~38℃下发酵15~24h。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631的接种量按罗伊氏乳杆菌CCFM8631的终浓度计为1.0×106~5.0×107cfu/mL。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的制备方法,其特征在于:
所述超声提取的条件为:温度为20~90℃,超声功率为100~500w,时间为10~60min。
10.一种石斛多糖,通过权利要求1~9中任一项所述的制备方法制得。
11.根据权利要求10所述的石斛多糖,其特征在于:
所述石斛多糖的单糖组成为木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。
12.根据权利要求11所述的石斛多糖,其特征在于:
所述石斛多糖中木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的质量比为(60~75):(25~32):(1~4):(0.5~1);或
所述石斛多糖的重均分子量为1500~32000。
13.权利要求10~12任一项所述的石斛多糖在制备产品中的应用;
所述产品用于修复皮肤屏障;
所述产品为药品或化妆品。
14.权利要求10~12任一项所述的石斛多糖在制备产品中的应用;
所述产品用于提高免疫力;
所述产品为保健食品或药品。
15.一种用于修复皮肤屏障的产品,包含权利要求10~12任一项所述的石斛多糖;所述产品为药品或化妆品。
16.一种用于提高免疫力的产品,包含权利要求10~12任一项所述的石斛多糖;所述产品为保健食品或药品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111133449.1A CN114231575B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种石斛多糖及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111133449.1A CN114231575B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种石斛多糖及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114231575A CN114231575A (zh) | 2022-03-25 |
CN114231575B true CN114231575B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=80743119
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111133449.1A Active CN114231575B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种石斛多糖及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114231575B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1604647A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-12-14 | Ichimaru Pharcos Co., Ltd. | Cosmetic composition containing polyorganosiloxane-containing epsilon-polylysine polymer, and polyhydric alcohol, and production thereof |
CN107523526A (zh) * | 2017-10-17 | 2017-12-29 | 无限极(中国)有限公司 | 一种罗伊氏乳杆菌及其用途 |
AU2018101488A4 (en) * | 2018-10-05 | 2018-11-08 | Macau University Of Science And Technology | Method and kit for treating cancer through combination therapy |
CN110613738A (zh) * | 2019-10-25 | 2019-12-27 | 江南大学 | 一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物 |
CN112586562A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-04-02 | 贵州中医药大学 | 中药酸奶及其制备方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100086647A1 (en) * | 2005-05-13 | 2010-04-08 | Medimush As | Feed or food products comprising fungal material |
CN114032190B (zh) * | 2021-08-20 | 2023-04-28 | 江南大学 | 一株可发酵石斛且其发酵液可有效修复日光皮炎的罗伊氏乳杆菌 |
CN113604395B (zh) * | 2021-08-20 | 2023-07-25 | 江南大学 | 一株可发酵石斛且其发酵液可改善皮肤质量的植物乳杆菌 |
-
2021
- 2021-09-27 CN CN202111133449.1A patent/CN114231575B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1604647A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-12-14 | Ichimaru Pharcos Co., Ltd. | Cosmetic composition containing polyorganosiloxane-containing epsilon-polylysine polymer, and polyhydric alcohol, and production thereof |
CN107523526A (zh) * | 2017-10-17 | 2017-12-29 | 无限极(中国)有限公司 | 一种罗伊氏乳杆菌及其用途 |
AU2018101488A4 (en) * | 2018-10-05 | 2018-11-08 | Macau University Of Science And Technology | Method and kit for treating cancer through combination therapy |
CN110613738A (zh) * | 2019-10-25 | 2019-12-27 | 江南大学 | 一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物 |
CN112586562A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-04-02 | 贵州中医药大学 | 中药酸奶及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Farahziela Abu 等.Antioxidant Properties of Crude Extract,Partition Extract,and Fermented Medium of Dendrobium sabin flower.Hindawi.2017,第1-9页. * |
不同菌种发酵对铁皮石斛多糖及其生物活性的影响;王丹 等;中国调味品;20190930;第44卷(第9期);第39-43页 * |
功能导向的植物提取物全产业链加工新技术及在日化中的应用;杜冰 等;CNKI科技成果;20230310;第1-6页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114231575A (zh) | 2022-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113773984B (zh) | 提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌 | |
CN108823261B (zh) | 一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用 | |
CN108048368B (zh) | 一株植物乳杆菌ua-416株及其应用 | |
Song et al. | Bifidogenic effects of Cordyceps sinensis fungal exopolysaccharide and konjac glucomannan after ultrasound and acid degradation | |
CN113604395B (zh) | 一株可发酵石斛且其发酵液可改善皮肤质量的植物乳杆菌 | |
Polak-Berecka et al. | Optimization of culture conditions for exopolysaccharide production by a probiotic strain of Lactobacillus rhamnosus E/N | |
CN101591630B (zh) | 一种耐辐射奇球菌及产生的微生物抗紫外辐射制剂 | |
CN104996729B (zh) | 一种麦冬药渣的资源化综合利用技术 | |
KR20090132065A (ko) | 발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장유래의 바실러스 서브스틸리스 신균주 | |
CN114032190B (zh) | 一株可发酵石斛且其发酵液可有效修复日光皮炎的罗伊氏乳杆菌 | |
CN114231576B (zh) | 罗伊氏乳杆菌在制备植物多糖中的应用 | |
Fan et al. | Magnetically immobilized edible Bacillus natto for the biotransformation of polydatin to resveratrol and its bioactivity assessment | |
CN108330086A (zh) | 一种产胞外多糖空间植物乳杆菌ss18-33及其在提高生物抗氧化活性中的应用 | |
CN108294224A (zh) | 一种利用植物乳杆菌发酵脱除大米中重金属镉的方法 | |
CN113773985B (zh) | 提高中药多糖得率并调节皮肤屏障及免疫的枯草芽孢杆菌 | |
CN104357332A (zh) | 黑曲霉jh-2及在生物转化合成积雪草酸中应用 | |
CN111349678A (zh) | 一种油菜花粉多糖提取方法以及提取产物 | |
CN114231575B (zh) | 一种石斛多糖及其制备方法与应用 | |
KR101776613B1 (ko) | 식물성 유산균을 이용한 유산균 생성물질 제조방법 | |
CN116355816A (zh) | 一种发酵翅果油种子的微生物及其降血脂组合物 | |
CN104055702B (zh) | 一种皮肤抗敏保湿剂 | |
CN103333872B (zh) | 一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法 | |
CN113999325B (zh) | 一种米糠发酵多糖,制备及应用 | |
CN103981132A (zh) | 一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用 | |
CN106754475A (zh) | 乳酸菌wxt002及胞外多糖的制备与功能 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |