CN106754475A - 乳酸菌wxt002及胞外多糖的制备与功能 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乳酸菌WXT002及胞外多糖的制备与功能。本发明提供了乳酸菌Lactobacillus Pantheris WXT002，其保藏号为12414。本发明的实验证明，本发明发现了一株新的乳酸菌Lactobacillus Pantheris，将其发酵产生胞外多糖，可以用来免疫调节和抑制卵巢癌细胞生长，为治疗卵巢癌提供研究基础和新型药物。

Description

乳酸菌WXT002及胞外多糖的制备与功能
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及乳酸菌WXT002及胞外多糖的制备与功能。
背景技术
乳酸菌是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称,目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有个属。在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。乳酸菌是益生菌最主要的来源,许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌,具有改善人体肠道菌群,调节机体免疫力,抑肿瘤,降低血清胆固醇,调节血压等重要的生理活性。乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理,除了定殖、通过主要代谢产物等改善肠道内环境等以外,一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。其中,具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖引起了国内外许多学者的研究兴趣。
乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacterium exopolysaccharide，LAB EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的荚膜多糖或黏液多糖，是乳酸菌的次级代谢产物。胞外多糖具有多种生物活性，而且基本无细胞毒性，使其成为食品科学，天然药物等领域的研究热点之一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、免疫调节等效果，具有广阔的应用前景。还可以作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长,优化肠道微生态环境等。
因此,开展产胞外多糖乳酸菌的研究,对于、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品,具有十分重要的研究意义和经济价值。开发具有益生功能的乳酸菌胞外多糖成为目前研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供乳酸菌Lactobacillus Pantheris WXT002。
本发明提供的乳酸菌Lactobacillus Pantheris WXT002，其保藏号为12414。
上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在生产胞外多糖中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种生产胞外多糖的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的乳酸菌，得到发酵液，即得到胞外多糖。
上述方法中，所述发酵采用的培养基为MRS培养基；
或，所述发酵的时间为30h；
或，所述发酵的温度为37℃。
上述方法中，在所述发酵后，还包括如下步骤：用三氯乙酸萃取所述发酵液，收集上清液；再用乙醇沉淀所述上清液，得到多糖。
或，在所述沉淀后还包括如下：将所述多糖依次进行透析、离子交换纯化和分子筛纯化的步骤。
由上述方法制备的胞外多糖也是本发明保护的范围。
上述的胞外多糖或上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备促进巨噬细胞增殖产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的胞外多糖或上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞释放NO产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的胞外多糖或上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞分泌TNF-α产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞分泌IL-6产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的胞外多糖或上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的胞外多糖或上述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备治疗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述巨噬细胞为Ana-1；
或，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞；
或，所述肿瘤为卵巢癌。
上述中，所述胞外多糖包括EPS1、EPS2和EPS3三种多糖；
或所述EPS1包括D-苏糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；
或所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖的摩尔比为14.44：2.94：1；
或所述EPS2包括D-来苏糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；
或所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖为3.51：8.39：1.80:：1。
或所述EPS3包括D-苏糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖；
或所述D-半乳糖：所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖为6.61:4.67:1.23:1。
上述中，所述产品为试剂盒。
WXT002于2016年5月3日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.12414，分类命名为Lactobacillus Pantheris。
二、Lactobacillus Pantheris WXT002发酵条件的优化
本发明的实验证明，本发明发现了一株新的乳酸菌Lactobacillus Pantheris，将其发酵产生胞外多糖，可以用来免疫调节和抑制卵巢癌细胞生长，为治疗卵巢癌提供研究基础和新型药物。
附图说明
图1为WXT002菌落形态。
图2为WXT002的革兰氏染色镜检图(100×)。
图3为WXT002的生长曲线。
图4为WXT002发酵过程中pH的变化。
图5为硫酸苯酚法检测培养基对WXT002EPS产量的影响。
图6为硫酸苯酚法检测时间对WXT002EPS产量的影响。
图7为硫酸苯酚法检测温度对WXT002EPS产量的影响。
图8为粗胞外多糖经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化洗脱曲线。
图9为EPS1、EPS2、EPS3经过Sepharose CL-6B色谱柱的洗脱曲线。
图10为三种胞外多糖的紫外扫描结果。
图11为GPC测定EPS3的相对分子质量分布图谱。
图12为测定EPS分子量的离子色谱图。
图13为EPS红外光谱扫描结果。
图14为EPS刺激巨噬细胞系Ana-1增殖情况。
图15为EPS对巨噬细胞系Ana-1NO释放量的影响。
图16为Elisa检测EPS刺激巨噬细胞Ana-1 24h后TNF-α的产生量。
图17为Elisa检测EPS刺激巨噬细胞Ana-1 24h后IL-6的产生量。
图18为EPS48小时对卵巢癌细胞A-2780的体外抑制效果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Lactobacillus Pantheris WXT002的获得及其特性鉴定
一、Lactobacillus Pantheris WXT002的分离纯化
5g发酵番茄渣样品加入放有45ml无菌水的锥形瓶中，封口至于恒温摇床中震荡30min制备菌悬液并进行梯度稀释，稀释液涂布于MRS固体平板上，37℃厌氧条件下培养48h。根据菌落的大小，颜色，形状及边缘特征将不同的菌在MRS平板上进行分离i。将已经分离的菌株在MRS固体培养中反复划线纯化，直至固体培养基中出现纯的、单一的并且无其它杂菌的菌落。将纯化的单菌落接种于MRS肉汤中，37℃厌氧条件下培养24h，将菌液与60％的无菌甘油以7：3的比例混匀，密封后放置在涡旋震荡仪上震荡混匀后-80℃保存。
二、Lactobacillus Pantheris WXT002的鉴定
1、Lactobacillus Pantheris WXT002菌种特性
将冻存的WXT002划线接种在MRS固体培养基上，37℃恒温培养40h。观察菌落的大小和形状、颜色、透明度、边缘整齐与否、表面光滑与否、透明度及菌落的颜色等。
结果如图1所示，其菌落直径约2-3mm，大而凸起，颜色灰白不透明，表面光滑。
革兰氏染色后在显微镜下观察单个菌体的形状，结果如图2所示，从图中可以看出WXT002位革兰氏阳性菌，单个菌体呈杆状。
2、16S rDMA序列的扩增及测序
从-80℃取出冻存的Lactobacillus Pantheris WXT002株乳酸菌菌株，室温融化后于用接种环挑取适量菌液，采用三区划线法在MRS平板上划线进行活化。用接种环挑取单菌落到MRS肉汤中进行扩大培养，37℃厌氧培养18h用于DNA的提取，方法参照试剂盒说明书。提取出的DNA用于16S rDMA序列的扩增。
乳酸菌的16S rRNA基因序列扩增引物为细菌16S rRNA基因序列通用引物，上游引物：27F 5'-GAGTTTGAT CCTGGCTCA-3’下游引物：1492R
5'-TACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系如下表1所示(50μl)。
表1为PCR反应体系
PCR反应条件：预变性：94℃5min,94℃变性1min,53℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃10min
扩增产物的电泳：PCR产物电泳后，凝胶成像仪下观察，如果成功，可以看到1500bp左右的条带。PCR产物回收参照Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书，回收产物检测浓度后由Invitrogen公司测序。
Lactobacillus Pantheris WXT002的16S rDMA的核苷酸序列为序列表中的序列1。
3、Lactobacillus Pantheris WXT002生长特性及乳酸菌碳水化合物发酵实验
将保存于-80℃的Lactobacillus Pantheris WXT002在MRS平板上活化两次，检测菌种的纯度后，按常规方法对该菌在不同温度不同pH的生长情况进行检测，乳酸菌碳水化合物发酵实验参照API50CH试纸条的说明书进行测定。
结果如表2-4所示。
表2 Lactobacillus Pantheris WXT002对不同碳水化合物发酵结果
表3为Lactobacillus Pantheris WXT002在不同温度下的生长情况
温度 5.0 10.0 45.0 50.0
WXT002 － － + +
表4为Lactobacillus Pantheris WXT002在不同pH下的生长情况
pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
WXT002 － － + + +
4、Lactobacillus Pantheris WXT002菌株生长曲线和生长过程中发酵液pH变化的测定
WXT002划线接种在MRS固体培一管养基上，37℃恒温培养40h。将单菌落挑入液体培养集中培养20h。将Lactobacillus Pantheris WXT002以4％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下进行培养，每隔2h取出，以MRS培养基做为空白调零，在600nm的波长处检测吸光值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，得到该菌株的生长曲线，对其pH测量后绘制发酵液pH变化曲线。
生长曲线结果如图3所示，可以看出，WXT002的延滞期只有2小时左右，之后开始进入生长对数期，在第10小时左右达到稳定期。
WXT002发酵过程中发酵液的pH变化如图4，从图中可以看出，自发酵开始后WXT002即开始产酸，当发酵10h左右，菌体生长进入稳定期后，发酵液pH也基本不再变化，维持在4左右。
WXT002于2016年5月3日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.12414，分类命名为Lactobacillus Pantheris。
二、Lactobacillus Pantheris WXT002发酵条件的优化
1、发酵培养基的选择
将WXT002划线接种在MRS固体培养基上，37℃恒温培养40h。将单菌落分别挑入MRS液体培养基(MRS固体和液体培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。配方：蛋白胨10g/L，牛肉粉8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80，1g/L。)和脱脂乳培养基(脱脂奶粉购自Becton,Dickinson and Company，葡萄糖购自中国国药集团。配方：脱脂奶粉50g/L，葡萄糖10g/L。MRS固体培养基加琼脂15g/L。)中37℃条件下进行培养20h，得到种子液。
将种子液以4％接种量分别接入25mL初始pH为6的MRS培养基和脱脂乳培养基中，37℃培养30h，每组设2平行。发酵结束后沸水浴处理10分钟，冷却后离心去除菌体。加入800g/L的三氯乙酸至其终浓度为40g/L。吸取离心去除蛋白杂质的发酵液50μL，稀释10倍后加入500μL6％苯酚，最后加入2mL浓硫酸，充分混匀，30分钟后在490nm波长处检测吸光值。
结果如图5所示，用硫酸苯酚法测得WXT002在MRS培养基的产糖量约为0.82g/L，远大于在脱脂乳培养基中0.09g/L。故根据以上两种结果，后续试验中的培养基使用MRS液体培养基。
2、发酵时间优化
将WXT002在MRS液体培养基发酵得到的种子液以4％接种量接入25mL初始pH为6的MRS培养基中，37℃培养14h、24h、30h、38h、48h，每组设2平行。发酵结束后沸水浴10分钟，冷却后离心去除菌体。加入800g/L的三氯乙酸至其终浓度为40g/L。吸取离心去除蛋白杂质的发酵液50μL，稀释10倍后加入500μL6％苯酚，最后加入2mL浓硫酸，充分混匀，30分钟后在490nm的波长处检测吸光值。
结果如图6所示，用硫酸苯酚法测得WXT002在MRS液体培养基产EPS趋势先升后降，在30h时的产糖量最高，约0.82g/L。
3、发酵温度优化
将WXT002在种子液以4％接种量接入25mL初始pH为6的MRS培养基中，分别在25、30、34、37、42℃培养30h，每组设2平行。发酵结束后沸水浴处理10分钟，冷却后离心去除菌体。加入800g/L的三氯乙酸至其终浓度为40g/L。吸取离心去除蛋白杂质的发酵液50μL，稀释10倍后加入500μL6％苯酚，最后加入2mL浓硫酸，充分混匀，30分钟后在490nm的波长处检测吸光值。
结果如图7所示，用硫酸苯酚法测得WXT002在MRS液体培养基产EPS趋势先升后降，在37℃时的产糖量最高，约0.80g/L。
实施例2、Lactobacillus Pantheris WXT002胞外多糖的提取与分离纯化
一、胞外多糖的提取
将Lactobacillus Pantheris WXT002在MRS平板上活化，待长出单菌落后接入MRS肉汤中37℃厌氧培养20h制成种子液。将种子液以4％(v/v)的接种量接种到MRS培养基中，37℃厌氧培养30h，收发酵液。
发酵液置于沸水中10分钟灭活能够降解多糖的酶类，冷却至常温后离心(5500r/min，18min，4℃)除去菌体和其它不溶物。向上清液中加入浓度为800g/L的三氯乙酸水溶液至其终浓度为40g/L，4℃静置10h，离心(10000r/min，15min，4℃)收集上清以去除蛋白。向上清液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，离心(10000r/min，18min，4℃)收集多糖沉淀。沉淀使用60℃蒸馏水回溶，离心(10000r/min，15min)去除沉淀，上清液装入透析袋内(小于透析袋体积的1/3)，透析后2-4h，更换第一次透析液，之后每6-8小时更换一次透析液，透析2天。收集透析袋内多糖溶液，冷冻干燥制得WXT002的粗多糖。
二、胞外多糖的纯化
1、胞外多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化
将处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow装填于Column XK26/40(内径：26mm，高度40cm)层析柱中，床体积为150ml，Tris-HCl溶液(55m mol/L，pH 7.5-7.8)过夜平衡层析柱。将上述一制备的WXT002的粗多糖用去离子水溶解，上样浓度为10mg/mL，流动相使用Tris-HCl洗脱液和含1mol/L NaCl的Tris-HCl，将GE Healthcare Bio-Sciences AB的流速设置为2.0mL/min，每6mL收集一管。用苯酚-硫酸法在490nm检测糖含量，并绘制洗脱曲线。
结果如图8所示，从左到右依次出现了3个明显的峰，可初步分为EPS的三个组分，分别命名为EPS1，EPS2和EPS3；其中EPS1在流动相中加入NaCl之前被洗脱下来，表明该胞外多糖为中性多糖；EPS2和EPS3是在加入NaCl之后被洗脱下来，表明这两种胞外多糖为酸性多糖。收集三种多糖的主峰部分，并用截留分子量为8000-12000Da的透析袋透析2天后，浓缩冷冻干燥得到初步纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3。
2、胞外多糖的Sepharose CL-6B分子筛纯化
将处理好的Sepharose CL-6B装填于Column XK16/100(内径：16mm，高度100cm)层析柱中，床体积为180ml，Tris-HCl溶液(55mmol/L，pH 7.5-7.8)过夜平衡层析柱。上述1得到的EPS1、EPS2和EPS3用流动相溶解后上样，上样浓度为5mg/mL，上样量40mg，流动相使用Tris-HCl洗脱液，流速为0.5mL/min，每6mL收集一管。用苯酚-硫酸法在490nm检测糖含量，并绘制洗脱曲线。
EPS1结果如图9a所示，经过纯化后，EPS1的主峰出现在15-24管。收集主峰部分，并用截留分子量为8000-12000Da的透析袋透析2天后，浓缩冷冻干燥得到最终纯化的多糖样品。
EPS2结果如图9b所示，经过纯化后，EPS2的主峰出现在15-26管。收集主峰部分，并用截留分子量为8000-12000Da的透析袋透析2天后，浓缩冷冻干燥得到最终纯化的多糖样品。
EPS3结果如图9c所示，经过纯化后，EPS3的主峰出现在3-19管。收集主峰部分，并用截留分子量为8000-12000Da的透析袋透析2天后，浓缩冷冻干燥得到最终纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3。
3、检测
1)紫外光谱扫描
用去双蒸水将上述2得到的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3溶解，浓度为为0.5mg/mL溶液，用0.22μL滤膜过滤后在185～400nm波长范围内进行紫外扫描。样品流速为0.5mL/min。流动相为去离子水。
结果如图10所示(由上到下分别为EPS1，EPS2，EPS3)，三种胞外多糖在206nm处均出现了多糖才具有的响应吸收峰；在260nm和280nm处无特征吸收峰，表明三种胞外多糖都不含蛋白质和核酸。
2)胞外多糖分子量测定
采用凝胶渗透色谱(GPC)检测多糖的纯度及其分子量分布。以不同分子量的葡萄糖作为标准品，称取分子量分别为5800，11800，47300，212000，788000的标准葡聚糖样品7mg，用1ml缓冲溶液流动相溶解，待用；采用Ultrahydrogel 500与Ultrahydrogel 250(7.8mm×300mm，排阻范围0.1kD-1000kD，柱温：45℃)凝胶柱，两柱串联；醋酸盐缓冲溶液(PH＝7)作为流动相，流速0.9mL/min；精密称取无水乙酸钠18g，冰醋酸9.8ml，混匀，溶于超纯水中，定容到1000ml，用0.25微米的膜过滤，作为缓冲液待用；吸取不同分子量的样品溶液，过滤，上样量20μL；以保留时间(Rt)为横坐标(X轴)，分子量的对数值为纵坐标(Y轴)，绘制标准曲线，得回归方程(软件上计算)，通过标准曲线计算样品的数均分子量。
标准品测定完成后即依次加入上述2得到的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3。
GPC测定结果如图11所示，EPS1(图11a)峰形均匀对称，表明其纯度较高；根据葡聚糖分子量标准曲线得出，重均分子量(Mw)为20292Da，EPS2(图11b)重均分子量(Mw)为22971Da，EPS3(图11c)重均分子量(Mw)为19301Da。
3)单糖成分分析
精确称取10.0mg多糖样品(分别称取上述2得到的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3)，与5.0mL 4mol/L三氟乙酸(TFA)在安瓿瓶中充分溶解，混匀后封口，110℃水解4h。水解完成后，样品减压蒸干，反复加入甲醇洗涤样品以除去残留的三氟乙酸，用去离子水溶解样品，冻干待用。
用1mL流动相溶解7种单糖标准品，每种5mg，包括D-葡萄糖(Glc)、D-木糖(Xyl)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-半乳糖(Gal)、D-甘露糖(Man)、D-果糖(Fru)、L-鼠李糖(Rha)，D-来苏糖(Lyx)。
上样前，将样品用0.45μm的微孔滤膜过滤，然后进行HPLC色谱分析。流动相为80％(v/v)的乙腈水溶液，流速1mL/min，进样量20μL。
根据胞外多糖的液相色谱图照单糖标准品的液相色谱图可知EPS1(图12a)主要由来D-苏糖、D-甘露糖和D-葡萄糖组成，三者摩尔比葡萄糖：甘露糖：来苏糖为14.44：2.94：1。EPS2(图12b)主要由来D-来苏糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成，四者摩尔比半乳糖：葡萄糖：甘露糖：来苏糖为3.51：8.39：1.80：1。EPS3(图12c)主要由来D-苏糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成，四者摩尔比半乳糖：葡萄糖：甘露糖：来苏糖为6.61:4.67:1.23:1。
4)红外光谱分析
取1-2mg糖样(分别检测上述2得到)的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3)和100-200mg KBr(中国国药集团，CAS：7758-02-3)粉末置于烘箱中烘至干燥，将上述样品混合，在玛瑙研钵中研磨均匀至无明显反光，使用压片机将压成厚度约0.1mm的透明薄片，对样品分组进行红外扫描。
EPS1的红外扫描结果如图13a。由图可知，EPS1在3373.64cm-1处出现很强的吸收峰，是糖类化合物羟基的O-H键伸缩振动吸收峰；在2913.6cm-1出现的强吸收峰是C-H键的吸收峰；出现在1636.67cm-1附近的是C＝O非对称伸缩振动峰；出现在1368.55cm-1处的吸收峰很是C-H变角振动峰；在1055.11cm-1处出现的强特征吸收峰是吡喃糖的C-O-C特征吸收峰；在864.15cm-1处出现的是α-甘露糖的特征吸收峰。
EPS2的红外扫描结果如图13b。由图可知，EPS2在3374.61cm-1处出现很强的吸收峰，是糖类化合物羟基的O-H键伸缩振动吸收峰；在2913.6cm-1出现的强吸收峰是C-H键的吸收峰；出现在1639.56cm-1附近的是C＝O非对称伸缩振动峰；出现在1366.63cm-1处的吸收峰很是C-H变角振动峰；在1041.8cm-1处出现的强特征吸收峰是吡喃糖的C-O-C特征吸收峰；在881.51cm-1处出现的是α-甘露糖的特征吸收峰；在800.56cm-1出现的是吡喃糖端基C-H变角振动。
EPS3的红外扫描结果如图13c。由图可知，EPS3在3370.75cm-1处出现很强的吸收峰，是糖类化合物羟基的O-H键伸缩振动吸收峰；在2920.35cm-1出现的强吸收峰是C-H键的吸收峰；出现在1636.67cm-1附近的是C＝O非对称伸缩振动峰；出现在1364.7cm-1处的吸收峰很是C-H变角振动峰；在1035.82cm-1处出现的强特征吸收峰是吡喃糖的C-O-C特征吸收峰；在876.79cm-1处出现的是α-甘露糖的特征吸收峰。在801.31cm-1出现的是吡喃糖端基C-H变角振动。
实施例3、Lactobacillus Pantheris WXT002胞外多糖体外免疫活性和抑制肿瘤细胞生长活性研究
一、Lactobacillus Pantheris WXT002胞外多糖体外免疫活性
1、MTS法检测胞外多糖对巨噬细胞Ana-1增殖的影响
(1)实验设空白对照组(细胞培养液)、阴性对照组(不添加任何刺激物)、阳性对照组(LPS(购自sigma company，L2630)浓度为1μg/mL)、EPS试验组(实施例2的二的2得到的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3浓度梯度均为31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，每组设三复孔；
(2)调整巨噬细胞Ana-1(购自中科院细胞库，GNM 2)浓度为1×105个/mL，每孔100μL接入96孔板中；共60孔(9孔备用)；4小时后用加有药品的培养液替换原培养液。37℃，5％CO2培养箱中培养22h。
(3)每孔加入20μL MTS检测液，放入培养箱中继续培养2h；
(4)在490nm下检测各孔OD值。
使用MTS试剂分别检测巨噬细胞增殖情况后，得到以下结果：EPS1刺激巨噬细胞增殖情况如图14，5个浓度梯度的EPS1均能刺激巨噬细胞增殖，增殖趋势先升后降，其中在62.5μg/mL浓度下细胞增殖最多，之后逐步下降。EPS2刺激巨噬细胞增殖情况如图14，5个浓度梯度的EPS2均能刺激巨噬细胞增殖，增殖趋势先升后降，其中在125μg/mL浓度下细胞增殖最多，之后逐渐下降。EPS3刺激巨噬细胞增殖情况如图14，5个浓度梯度的EPS1均能刺激巨噬细胞增殖，增殖趋势先升后降，其中在62.5μg/mL浓度下细胞增殖最多，之后逐渐下降。
综上所述，3种胞外多糖均能刺激巨噬细胞Ana-1增殖。
2、EPS对巨噬细胞Ana-1释放NO的影响(Griess法)
实验设空白对照组(细胞培养液)、阴性对照组(不添加任何刺激物)、阳性对照组(LPS浓度为1μg/mL)、EPS试验组(上述2得到的纯化的多糖样品EPS1、EPS2和EPS3浓度梯度均为31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，每组设三复孔；.调整巨噬细胞浓度为1×105个/mL，每孔200μL接入96孔板中；共60孔(9孔备用)；4小时后用加有药品的培养液替换原培养液。在细胞培养箱中培养24h，收集上清液。亚硝酸盐标准品的稀释(1)将0.1M亚硝酸盐标准品稀释为100μM，混合均匀后加入96孔板中，每孔50μL，设三复孔。(2)标准品的梯度稀释：将亚硝酸盐标准品的浓度稀释为0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100μM，充分混匀。5.将收集的上清液加入96孔板中，每孔50μL。6.每孔加入50μL对氨基苯磺酰胺，室温放置7分钟。7.每孔加入50μL NED，室温放置7分钟。8.在535nm下检测各孔OD值。9.绘制标准曲线，计算每孔的亚硝酸根浓度。
使用Griess试剂盒检测巨噬细胞的NO2 -产生量后发现，3种EPS均能刺激巨噬细胞释放NO，且NO释放量与EPS浓度成正比(如图15)。浓度为125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的ESP1刺激巨噬细胞的NO释放量与阴性对照相比，差异极显著；浓度为125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的ESP1刺激巨噬细胞的NO释放量与阴性对照相比，差异极显著。EPS1和EPS3浓度为500μg/mL时，NO2 -浓度最高；EPS2浓度为250μg/mL时，NO2 -浓度最高，500μg/mL时NO2 -浓度有所下降。
3、Elisa检测EPS对巨噬细胞Ana-1分泌TNF-α的影响
1)、TNF-α标准品稀释：向标准品试剂瓶中加入1mL去离子水，混合均匀得到的标准品浓度为7000pg/mL；
2)、标准品的梯度稀释：使用Calibrator Diluent RD5K试剂，将TNF-α标准品的浓度稀释为0、10.9、21.9、43.8、87.5、175、350、700pg/mL，充分混匀。
3).向Mouse TNF-αKit Control试剂瓶中加入1mL去离子水，充分混匀；
4).将20mL浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍，得到500mL洗涤液；
5).向预包被板中的每个实验孔中加入50μL RD1-63；
6).向实验孔中分别加入不同浓度的标准品、样品和Mouse TNF-αKit Control。轻拍60s混匀液体。封板室温孵育2小时；
7).孵育结束后用洗板机冲洗5次，洗完后将板在吸水纸上拍干；
8).向实验孔中加100μl Mouse TNF-αConjugate，封板室温孵育2小时；
9).重复步骤7)；
10).将显色液的A液和B液等体积混合，15min内使用；
11).向实验孔中加入100μl显色液，室温避光孵育30分钟；
12).向实验孔中加入100μl的终止液，充分混匀；
13).在450nm下检测各孔OD值；
14).绘制标准曲线，计算每孔的TNF-α浓度。
EPS刺激巨噬细胞Ana-1释放TNF-α的结果如图16，从图中可以看出，EPS1，EPS2和EPS3均能刺激巨噬细胞Ana-1释放TNF-α，且与阴性对照差异显著。
4、Elisa检测EPS对巨噬细胞Ana-1分泌IL-6的影响
方法与3相同，所用到的试剂均改为IL-6试剂盒中的对应试剂。
EPS刺激巨噬细胞Ana-1释放IL-6的结果如图17，从图中可以看出，EPS1刺激刺激巨噬细胞Ana-1释放IL-6的量与糖浓度呈正相关性，糖浓度达到125μg/mL时IL-6的分泌量不再增长；不同浓度的EPS2和EPS3均能刺激巨噬细胞Ana-1大量释放IL-6，IL-6的分泌量与糖浓度无线性关系，均在31.25μg/mL时达到峰值。
二、胞外多糖对卵巢癌细胞A-2780增殖
1、MTS法检测胞外多糖对卵巢癌细胞A-2780增殖的影响
(1)实验设空白对照组(细胞培养液)、阴性对照组(不添加任何刺激物)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶，浓度为50μg/mL)、EPS试验组(EPS1、EPS2和EPS3浓度梯度均为31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，每组设三复孔，设24实验组，48小时实验组和72小时实验组；
(2)调整HCT-116细胞浓度为1×105个/mL，每孔200μL接入96孔板中，每板60孔(9孔备用)；4小时后用加有药品的培养液替换原培养液。37℃，5％CO2培养箱中培养；
(3)3个实验组在22h，46h，70h时，每孔加入20μL MTS检测液，放入培养箱中继续培养2h；
(4)在490nm下检测各孔OD值；
(5)计算EPS对癌细胞的抑制率，
公式为：
EPS抑制卵巢癌细胞A-2780增殖72h后的结果如图18。EPS的整体抑制率与糖浓度呈正相关。EPS1在62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL三个浓度下的抑制率都超过了40％；EPS2在31.25μg/mL时的抑制率超过了45％，62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和三个浓度下超过了50％，在500μg/mL下超过了60％；EPS3在31.25μg/mL和62.5μg/mL两个浓度下的抑制率超过了50％，在125μg/mL和250μg/mL两个浓度下超过了60％，在500μg/mL下超过了70％。整体抑制率抑制率：EPS3＞EPS2＞EPS1。
序列表
<110>内蒙古大学
<120> 乳酸菌WXT002及胞外多糖的制备与功能
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16569
<212> DNA
<213> Lactobacillus Pantheris
<400> 1
ctgcagtcga gcgaacttaa ctaaatgaat gcggtgcttg caccaagtga ttttagagcg 60
gtgagcggcg gatgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tctaagcagg ggataacatt 120
tggaaacaga tgctaatacc gtataaatcc taaaaccaca tggttttagg ctgaaaggcg 180
gcttcggctg tcacttagag atggacccgc ggcgtattag ctagttggtg aggtaatggc 240
tcaccaaggc aatgatacgt agccgaactg agaggttgat cggccacatt gggactgaga 300
cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgcaagtct 360
gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttgaag 420
aagaacacgt ttgagagtaa ctgttcagac gttgacggta ttcaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gatttattgg 540
gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccctcgg cttaaccgag 600
gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgaat gctgaagagg acagtggaac tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtcagt 720
tattgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
tgccgtaaac gatgaatact aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cgcagctaac 840
gcattaagta ttccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcttctgcta tttctagaga tagaaagttc ccttcgggga cggaatgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt atgactagtt gccagcatta agttgggcac tctagtaaga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggttggt acaacgagtt gcgaactcgc gagggtaagc taatctctta 1260
aagccaatct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta cacgaagtcg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccatgag agtttgtaac acccaaagcc ggtggggcaa cccttcgggg agctg 1435

Claims (10)

1.乳酸菌Lactobacillus Pantheris WXT002，其保藏号为12414。
2.权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在生产胞外多糖中的应用。
3.一种生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的乳酸菌，得到发酵液，即得到胞外多糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵采用的培养基为MRS培养基；
或，所述发酵的时间为30h；
或，所述发酵的温度为37℃。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述发酵后，还包括如下步骤：用三氯乙酸萃取所述发酵液，收集上清液；再用乙醇沉淀所述上清液，得到多糖。
或，在所述沉淀后还包括如下：将所述多糖依次进行透析、离子交换纯化和分子筛纯化的步骤。
6.由权利要求3-5中任一所述方法制备的胞外多糖。
7.权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备促进巨噬细胞增殖产品中的应用；
或，权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞释放NO产品中的应用；
或，权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞分泌TNF-α产品中的应用；
或，权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备刺激巨噬细胞分泌IL-6产品中的应用；
或，权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用；
或，权利要求6所述的胞外多糖或权利要求1所述的乳酸菌或其菌悬液或其发酵液或其培养液在制备治疗肿瘤产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述巨噬细胞为Ana-1；
或，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞；
或，所述肿瘤为卵巢癌。
9.根据权利要求2或7或8所述的应用或权利要求3-5中任一所述方法，其特征在于：所述胞外多糖包括EPS1、EPS2和EPS3三种多糖；
或所述EPS1包括D-苏糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；
或所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖的摩尔比为14.44：2.94：1；
或所述EPS2包括D-来苏糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；
或所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖为3.51：8.39：1.80:：1。
或所述EPS3包括D-苏糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖；
或所述D-半乳糖：所述D-葡萄糖：所述D-甘露糖：所述D-来苏糖为6.61:4.67:1.23:1。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
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