CN105219817A - 一种乳酸菌胞外多糖的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳酸菌胞外多糖的制备方法和应用。采用的技术方案是：将乳酸菌发酵液以1-5％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为4.5-8.5，于25-40℃下，培养8-16h；所述的MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，碳源2％，氮源1％，磷酸氢二钾0.1-0.8％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L；组成的MRS液体培养基的碳氮比为1:0.3-1:3。采用本发明的方法可以有效提高乳酸菌胞外多糖的产量。

Description

一种乳酸菌胞外多糖的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种乳酸菌胞外多糖的发酵制备方法，属于微生物学领域。

背景技术

乳酸菌胞外多糖是一种被分泌到细胞外的多糖，它或者以荚膜的形式附着在细胞表面，或者以粘液的形式分散在胞外环境中，分别被称为附着胞外多糖和游离胞外多糖(或荚膜多糖和黏液多糖)。在自然环境中，胞外多糖通常起着保护微生物的作用，它可以避免细胞干燥脱水，遭噬菌体浸染、受抗生素或者有毒物质损害、原生动物伤害，还可以稳定渗透压、支持细胞结构、参与细胞信息传递和细胞构成等。

近几年，乳酸菌胞外多糖作为深入探讨对象是因为以下两个原因：一是，由于乳酸菌胞外多糖物理化学的特性，常常当作添加剂加入到食物中或者由乳酸发酵的食品里，这会优化食品的特性，如保证良好的质构、提高稳定性、保证持水性以及延长保质期等；二是，乳酸菌胞外多糖拥有大量对人体生命活动有益的生物功能。

乳酸菌发酵产生胞外多糖受到多种因素相互作用，主要是培养基成分和培养条件对胞外多糖合成量和组成存在较大相互作用。虽然乳酸菌产生的胞外多糖的功能及应用广泛，但是现有的方法产量低，如何提高乳酸菌胞外多糖的产量是现在面临的主要问题。

发明内容

针对乳酸菌产生胞外多糖产量的问题，本发明的目的是提供一种能提高乳酸菌胞外多糖产量的制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：

1)将乳酸菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到乳酸菌发酵液。

2)将乳酸菌发酵液以1-5％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为4.5-8.5，于25-40℃下，培养8-16h，得乳酸菌胞外多糖。

所述的MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，碳源2％，氮源1％，磷酸氢二钾0.1-0.8％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L；组成的MRS液体培养基的碳氮比为3:1-1:3。

3)纯化：将乳酸菌胞外多糖溶于水中，然后缓慢加入DEAE-D52纤维素柱中，用蒸馏水和0.1-2.0moL/L浓度的NaCl进行梯度洗脱，合并洗脱主峰的洗脱液，用分子量在1000kd-8000kd的透析袋中透析24h。

上述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，所述的MRS液体培养基中，所述的碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖或壳聚糖。优选的，所述的碳源为葡萄糖。

上述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，所述的MRS液体培养基中，所述的氮源为蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、氯化铵或硫酸铵。优选的，所述的氮源为蛋白胨。

上述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，所述的MRS液体培养基中，优选的，所述的磷酸氢二钾的含量为0.6％。

上述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，所述的MRS液体培养基中，优选的，所述的碳氮比为2:1。

优选的，上述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，将乳酸菌发酵液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为7.5，于34℃下，培养12h。

本发明的有益效果是：本发明在MRS培养基的基础上，通过培养基成分及培养条件的优化，得出乳酸菌胞外多糖产量最高的培养基组成和培养条件，以此来增加乳酸菌胞外多糖的产量，通过本发明的方法制备的乳酸菌胞外多糖具有抗氧化、抑制胃癌细胞增殖、诱导胃癌细胞凋亡等作用。

附图说明

图1是胞外多糖纯化结果。

图2是Gimesa染色法实验结果。

其中，A1：空白作用6h细胞形态变化；A2：加药作用6h细胞形态变化；

B1：空白作用12h细胞形态变化；B2：加药作用12h细胞形态变化；

C1：空白作用24h细胞形态变化；C2：加药作用24h细胞形态变化。

图3是DNALadder法实验结果；

其中，M：Marker；K：空白对照；6：加药作用6小时；12：加药作用12小时；24：加药作用24小时。

具体实施方式

实施例1乳酸菌胞外多糖培养基的确定

方法：1)将乳酸菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到乳酸菌发酵液；

2)将乳酸菌发酵液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，转速为200r/min，培养12h。

3)以不接种乳酸菌发酵液为空白对照组，根据苯酚硫酸法，用酶标仪检测在490nm处的吸光度，计算多糖浓度。

(一)不同碳源的影响

方法同上，MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，碳源(种类如表1)2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L；结果如表1。

表1

碳源	葡萄糖	乳糖	蔗糖	果糖	壳聚糖
						多糖ug/mL	42	57	40	20	11

由表1可见，对碳源的优化可以看出乳糖为碳源时胞外多糖的产量最高，可达到57ug/ml，葡萄糖和蔗糖的胞外多糖的产量分别为42ug/ml、40ug/ml。果糖和壳聚糖的产量比较低。

(二)不同氮源的影响

方法同上，MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，葡萄糖2％，氮源(种类如表2)1％，磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L。结果如表2。

表2

氮源	蛋白胨	胰蛋白胨	尿素	氯化铵	硫酸铵
						多糖ug/mL	100	110	82	150	90

由表2可见，在氮源的筛选实验中，氯化铵作为氮源时胞外多糖的产量达到最高，150ug/ml。胰蛋白胨和蛋白胨胞外多糖的产量分别为110ug/ml、100ug/ml。尿素和硫酸铵的产量较低。

(三)不同磷酸氢二钾含量的影响

方法同上，MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，葡萄糖2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾含量如表3，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L。结果如表3。

表3

磷酸氢二钾含量	0.1％	0.2％	0.4％	0.6％	0.8％
						多糖ug/mL	110	118	120	162	167

由表3可见，随着磷酸盐含量的增加，胞外多糖的产量也随着增加，在0.8％达到最高，产量为167ug/ml。磷酸盐含量为0.1％时，胞外多糖的产量最低可达到110ug/ml。

(四)不同碳氮比的影响

方法同上，MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，葡萄糖2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L。组成的MRS液体培养基的碳氮比如表4。结果如表4。

表4

碳氮比	1:1	1:2	1:3	2:1	3:1
						多糖ug/mL	75	126	106	110	180

由表4可见，在碳氮比的试验中，胞外多糖产量最高的为3:1，可达到180ug/ml，在1:2时产量可以达到126ug/ml，当比例为2:1时产量为110ug/ml，1:3时可达到106ug/ml，产量最低的比例为1:1，产量为75ug/ml。

(五)培养基成分正交实验

在单因素实验的基础上，以不同碳源，不同氮源，不同碳氮比，不同磷酸氢二钾含量四个因素进行正交试验，优化胞外多糖的最佳培养基成分。实验分组如表5，实验结果如表6

表5

序号	A不同碳源	B不同氮源	C不同碳氮比	D不同盐含量(％)
					1	葡萄糖	蛋白胨	2:1	0.4
2	乳糖	胰蛋白胨	1:2	0.6
					3	蔗糖	氯化铵	3:1	0.8

表6

实验号	A	B	C	D	多糖含量ug/ml
						1	1	1	1	1	546
2	1	2	2	2	481
						3	1	3	3	3	511
4	2	1	2	3	252
						5	2	2	3	1	187
6	2	3	1	2	425
						7	3	1	3	2	363
8	3	2	1	3	326
						9	3	3	2	1	188
K1	513	387	432	307
						K2	288	331	307	423

K3	326	375	354	363
						R	224	56	126	116

根据表6可知，最佳的培养条件为A₁B₁C₁D₂，即以葡萄糖为碳源，以蛋白胨为氮源，碳氮比为2:1，磷酸氢二钾含量为0.6％，在此条件下多糖含量产量最高为556ug/ml。

实施例2乳酸菌胞外多糖培养条件的确定

方法：1)将乳酸菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到乳酸菌发酵液；

2)将乳酸菌发酵液以1-5％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为4.5-8.5，于25-40℃下，转速为200r/min，培养8-16h；所述的MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，葡萄糖2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.4％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L。组成的MRS液体培养基的碳氮比为1:3。

3)以不接种乳酸菌发酵液为空白对照组，根据苯酚硫酸法，用酶标仪检测在490nm处的吸光度，计算多糖浓度。

(一)不同接种量的影响

方法同上。将乳酸菌发酵液按表7的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，转速为200r/min，培养12h。结果如表7。

表7

接种量	1％	2％	3％	4％	5％
						多糖ug/mL	40	85	79	75	74

由表7可见，当接种量为2％时，胞外多糖的产量最高可达到85ug/ml，在3％、4％、5％时胞外多糖的产量分别可以达到79ug/ml、75ug/ml、74ug/ml。产量最低发生在接种量为1％时，达到40ug/ml。

(二)不同初始pH的影响

方法同上。将乳酸菌发酵液按2％接种量接种于MRS液体培养基中，如表8调节初始pH值，于37℃下，转速为200r/min，培养12h。结果如表8。

表8

pH	4.5	5.5	6.5	7.5	8.5
						多糖ug/mL	39	43	57	95	84

由表8可见，随着pH值的增加多糖产量先增加后减少，在pH值在7.5时产量达到最高为95ug/ml，最低产量是在pH值为4.5时，产量为39ug/ml。

(三)不同温度的影响

方法同上。将乳酸菌发酵液按2％接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值6.5，如表9在不同温度下，转速为200r/min，培养12h。结果如表9。

表9

温度	28℃	31℃	34℃	37℃	40℃
						多糖ug/mL	70	93	109	97	90

由表9可见，随着温度的升高，多糖的产量先升高在下降，在温度达到34℃时多糖产量达到最高为109ug/ml，多糖产量最低时的温度为28℃，产量为70ug/ml。

(四)不同培养时间的影响

方法同上。将乳酸菌发酵液按2％接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值6.5，在37℃下，转速为200r/min，培养时间如表10。结果如表10。

表10

时间	8h	10	12	14	16h
						多糖ug/mL	39	43	127	95	105

由表10可见，在培养12h时多糖产量达到最高为127ug/ml，在8h、10h时多糖产量较低分别为39ug/ml、43ug/ml。

(五)发酵条件正交实验

在单因素实验的基础上，以培养时间，培养温度，初始pH值，接种量四个因素进行正交试验，优化胞外多糖的培养条件。实验分组如表11，实验结果如表12

表11

序号	A发酵时间(h)	B发酵温度(℃)	C初始pH值	D接种量(％)
					1	10	31	6.5	1
2	12	34	7.5	2
					3	14	37	8.5	3

表12

实验号	A	B	C	D	多糖含量ug/ml
						1	1	1	1	1	62
2	1	2	2	2	38
						3	1	3	3	3	94
4	2	1	2	3	170
						5	2	2	3	1	120
6	2	3	1	2	232
						7	3	1	3	2	144
8	3	2	1	3	213
						9	3	3	2	1	228
K1	65	125	169	137
						K2	174	124	145	138
K3	195	185	119	159
						R	130	61	50	22

由表12可知，最佳的培养条件为A₃B₃C₁D₃，即培养时间为14h，培养温度为37℃，pH值为6.5，接种量为3％时，在此条件下多糖含量产量最高为248ug/ml。

实施例3一种乳酸菌胞外多糖的制备方法

方法如下：

1)将乳酸菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到乳酸菌发酵液。

2)将乳酸菌发酵液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，转速为200r/min，培养12h，得乳酸菌胞外多糖。

所述的MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，葡萄糖2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.6％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水1L。组成的MRS液体培养基的碳氮比为2:1。

3)纯化

3-1)DEAE-D52纤维素预处理：将DEAE-D52纤维素25g，用ddH₂O浸泡24h，充分溶胀，出去填料悬浮颗粒，分别用0.5moL/LNaOH和0.5moL/LHCL溶液交替浸泡30min，酸碱浸泡后用ddH₂O洗涤至中性，保存备用。

3-2)装柱：柱子垂直装好后，以双蒸水为缓冲溶液倒入柱内1/3处，将预处理后的DEAE-D22纤维素填料用玻璃棒沿壁柱缓缓倒入壁内。

3-3)平衡：打开排水阀，使DEAE-D22纤维素填料均匀缓慢的沉降，用双蒸水做平衡液平衡柱子，使柱内均匀分布达到平衡状态。

3-4)上样：精确称多糖0.5g溶于50mL双蒸水中，配制成10mg/mL溶液，过滤，上样量为5mL，沿柱壁缓缓加入。

3-5)洗脱：分别用蒸馏水、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0moL/L浓度的NaCl溶液分段进行洗脱，浓度由低到高依次洗脱并分别收集，流速1mL/min。

3-6)检测：采用苯酚硫酸法检测收集到的多糖洗脱液，以收集管数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱液，并合并各洗脱主峰的洗脱液，透析除盐。

3-7)透析除盐：收集合并的洗脱液，用分子量在1000kd—8000kd的透析袋透析24h，冻干保存。

如图1所示，经过DEAE-D52纤维素柱洗脱后分离到两份组分，分别为EPS₁和EPS₂，由于组分EPS1收集体积较大，EPS₂洗脱体积较小，不方便收集，所以本实验只收集EPS₁，作为纯化多糖。

4)以不接种乳酸菌发酵液为空白对照组，根据苯酚硫酸法，用酶标仪检测在490nm处的吸光度，计算多糖浓度。多糖产量达到556ug/ml。

实施例4乳酸菌胞外多糖的活性验证

以实施例3制备的多糖样品进行如下实验。

1)DPPH自由基清除：样品+0.2mMDPPH的OD₅₁₇为A_I；样品+无水乙醇的OD₅₁₇为A_J；0.2mMDPPH+无水乙醇的OD₅₁₇为A_I。DPPH乙醇溶液呈现深紫色，在517nm波长下有最强吸收峰，并且其含量与吸光度具有一定的关系。通过吸光度反映DPPH的含量变化，从而间接反映样品的抗氧性。结果如表13。

表13

多糖ug/ml	200	100	50	25	12.5	6.25
							纯化多糖清除率％	42.34	40.89	29.87	28.87	22.72	21.22
未纯化多糖清除率％	18.78	18.78	18.78	18.78	18.78	18.78

如表13所示纯化后胞外多糖对DPPH·自由基的抑制效率用随着样品浓度提高而提高。当含量为50μg/mL时，抑制效率达到29.87％，当浓度达到100μg/mL时，抑制效率达到40.89％。而未纯化的样品对DPPH·的清除效果基本不变，基本保持在18.78％的抑制效率。

2)-OH自由基清除实验在试管中分别加入10nmol/L的水杨酸乙醇溶液0.5ml，多糖溶液(浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200mg/ml)0.5ml，10mmol/LFeSO₄溶液，3.5mL蒸馏水0.5mL后，加入10mmol/LH₂O₂0.5ml启动Fenton反应摇匀后于510nm处测定吸光度A_i；将0.5mLddH₂O代替10mmoL/LFeSO₄溶液得到的吸光度为A_j；将0.5mLddH₂O代替多糖样液所得到的吸光度为A_C，Vc为对照实验，结果如表14。

表14

多糖ug/ml	200	100	50	25	12.5	6.25
							纯化多糖清除率％	40.07	37.84	34.53	20.23	12.43	5.32
未纯化多糖清除率％	27.84	21.16	19.84	17.84	9.87	4.28

胞外多糖和粗多糖对超氧阴离子自由基的抑制作用是随着样品含量提高而提高的。胞外多糖含量在100μg/mL时，对超氧阴离子自由基的抑制效率达到37.84％，而粗多糖的清除率为21.16％。

实施例5乳酸菌胞外多糖活性验证体外抑制肿瘤

以实施例3制备的多糖样品进行如下实验。

1)采用MTT比色法。加入适量含有10％血清和1％双抗的新鲜RPMI1640培养基，计数；以胃癌细胞823以0.5×10⁵/孔的量加入96孔板中，每孔100μL；将含量为10％血清的RPMI1640培养基将样品稀释到一定含量，加入到96孔板中，每样6个复孔，每孔100μL；以BSA阴性作为对照，5-Fu作为阳性对照，每样6个复孔；在5％CO₂，37℃条件下培养72h；取出96孔板，加入50μL/孔MTT，5％CO₂，37℃培养4h；3000r/min离心10min，加入DMSO120μL/孔，37℃溶解20min；测值，结果如表15

表15

多糖ug/ml	200	100	50	25	12.5	6.25
							纯化多糖清除率％	45.67	44.23	25.22	23.22	21.03	14.22
未纯化多糖清除率％	26.45	22.99	11.55	10.53	5.21	2.77
							阳性对照	73.23
阴性对照	18

如表15所示，随着纯化后样品含量的增加，对胃癌细胞的抑制率增大。当含量为100μg/mL时，纯化后样品抑制率达到44.23％，未纯化样品抑制率为22.99％。当浓度为200μg/mL时，纯化后样品抑制率达到45.67％，未纯化样品抑制率为26.45％。以5氟尿嘧啶为阳性对照效率达到73.23％，以BSA为阴性对照的效率为18％。

2)Giemsa染色实验：每瓶加入1-2ml胰酶-EDTA将处于对数生长期的胃癌细胞消化下来；将无菌的盖玻片加入12孔细胞培养板，然后再加入浓度为1×10⁵/mL的细胞悬浮液，每空加入1mL；当细胞贴到培养瓶壁后，将样品稀释到一定浓度，加入到96孔板中空白对照组加入RPMI-1640培养液，当培养3h、6h、9h、12h、24h后取出盖玻片；用冷D-hanks液体对盖玻片慢慢漂洗3次(注意玻片背面漂洗)；在盖玻片彻底干燥后，在青霉素瓶口将其放上，用甲醇冰乙酸固定液固定10min，每隔10min换一次固定液；待固定后的盖玻片水分蒸发后，在另一青霉素瓶口上轻轻放置，加Giemsa应用液染色15min，流水冲洗3min；采用流通空气干燥，中性树胶封片，放在倒置显微镜下观察拍照。结果如图2。

如图2所示，通过形态学方法观察细胞凋亡关系到单个细胞的，即使是某一部分细胞也不是同步发生的。在加药作用6小时时细胞体积缩小，细胞开始变圆，周围开始出现液泡，在作用12小时时细胞核开始浓缩，在作用24小时时核膜核仁破碎，内容物外溢出。

3)DNALadder法检测细胞凋亡：收集凋亡细胞，将1～2×10⁶个细胞，离心后迅速加入70％的酒精，固定2h。再将固定的细胞离心10000r/min，5min。弃上清，PBS洗涤两次。加入400ul细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100ul，置于60℃水浴消化2h或过夜。加入8mol/L的醋酸钾75ul，4℃条件作用15min，再加入750ul氯仿，充分混匀后，10000r/min，离心10分钟，将上清液移入新的Eppendorf管中。加入750ul无水乙醇，上下轻柔颠倒混匀，可以看见乳白色沉淀，12000r/min离心10min弃上清，在加入70％乙醇1ml混匀，10000r/min,5min，弃上清。将ddH₂O溶解DNA，测定DNA浓度。结果如图3。

如图3所示，当细胞凋亡的显著变化为细胞内DNA出现降解现象，所产生的片段大小的DNA，其约为180-200bp的整倍数，这种大小长短刚好的是组蛋白寡聚体的长度，因为DNA的片段化刚刚是在核小体之间连接部位被切断，形成大小不用的寡聚核小体片段，在加药作用6小时时开始出现DNA片段化。

4)WesternBLot法检测细胞凋亡：先将总蛋白进行提取，将提取的蛋白样品进行测定，测定方法如下：配制BCA工作液，将蛋白标准品按照0μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL加到96孔板的蛋白标准孔中，加灭菌的ddH₂O加入至10μL，将10μL未测定样品加入96孔板，各组实验3个平行。将蛋白标准品孔和待测样品孔中加入200μLBCA工作液混匀。37℃温浴30min，冷却至室温。测OD值并且计算样品浓度。

5)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验：用洗洁精把两块玻璃板手洗干净，用吹风机吹干后后按说明书放好电泳槽。将玻璃板在灌胶支架上固定好；向两层玻璃板之间加入分离胶，再加入无水乙醇将气泡年初，压平液面，静止40min；将无水乙醇倒出，用滤纸轻轻将多余液体除去，加入浓缩胶至玻璃板边缘，并且迅速平稳地插入梳子，静止放置30min；拔出梳子后，在电泳槽内加入缓冲液，没过胶体，用微量注射器距槽底1/3出迅速平稳进样，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在80V，当选入分离胶后改为100V，溴酚蓝距凝胶边缘距5mm时，停止电泳，电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色4小时左右，染色后的凝胶用脱色液脱色，直至区帯清晰。

Claims (10)

1.一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将乳酸菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到乳酸菌发酵液；

2)将乳酸菌发酵液以1-5％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为4.5-8.5，于25-40℃下，培养8-16h，得乳酸菌胞外多糖；

所述的MRS液体培养基的组成为：按重量百分比，碳源2％，氮源1％，磷酸氢二钾0.1-0.8％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，柠檬氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，蒸馏水余量；组成的MRS液体培养基的碳氮比为3:1-1:3。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：包括纯化步骤，3)纯化：将乳酸菌胞外多糖溶于水中，然后缓慢加入DEAE-D52纤维素柱中，用蒸馏水和0.1-2.0moL/L浓度的NaCl进行梯度洗脱，合并洗脱主峰的洗脱液，于分子量在1000kd-8000kd的透析袋中透析24h。

3.根据权利要求1或2所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖或壳聚糖。

4.根据权利要求3所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的碳源为葡萄糖。

5.根据权利要求1或2所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的氮源为蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、氯化铵或硫酸铵。

6.根据权利要求5所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的氮源为蛋白胨。

7.根据权利要求1或2所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的磷酸氢二钾的含量为0.6％。

8.根据权利要求1或2所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的MRS液体培养基中，所述的碳氮比为2:1。

9.根据权利要求1或2所述的一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：将乳酸菌发酵液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，培养12h。

10.按照权利要求1或2所述的方法制备的乳酸菌胞外多糖在抗氧化性、抑制肿瘤增值中的应用。