CN103725735B - 一种从短小芽孢杆菌e14中分离抗菌蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法,该方法通过发酵生产制得发酵菌液;离心制得上清液;然后用硫酸铵沉淀,所得沉淀用缓冲液重悬,得重悬液;通过离子交换法分离,收集洗脱峰、浓缩、透析,得活性成分分离峰。再通过抗菌活性检测和蛋白质电泳检测,测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在97.2-116.0?kD之间。本发明方法设计简单合理,操作方便,通过本发明方法可以分离得到具有抗哈维氏弧菌(<i>Vibrio</i><i>?harveyi</i>)效果的蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌蛋白质的制备方法,特别是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法。
背景技术
近三十年来,我国渔业取得了长足发展,水产品产量连续十多年居世界首位,是世界上唯一一个养殖产量超过捕捞产量的国家,水产品出口也已占农产品出口净收入的50%以上。渔业已经成为我国大农业中发展最快的产业之一,在促进农村产业结构调整、增加农民收入、保障食物安全、优化国民膳食结构以及维护国家海洋权益等方面做出了重要贡献。然而随着水产养殖业的不断发展,养殖规模的不断扩大,病害发生的频率越来越高、造成的损失也越来越大。
引起海水养殖病害的微生物主要有病毒、细菌和真菌,在细菌当中,弧菌是引起海水养殖品种中细菌性疾病的最重要的病原菌之一,流行面积广并且发病率高,给养殖业造成了巨大的危害,弧菌已成为水产领域长期以来的一大研究热点。
目前防治此类病害大多使用抗生素和化学合成药物,其对产品质量的影响显而易见,因此研究开发抗生素的替代品就显得十分迫切和重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种方法设计合理、可操作性强、分离的产物纯度高的从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法,其特点是,其步骤如下:
(1)发酵生产:取培养过夜的短小芽孢杆菌E14(Bacilluspumilus)将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中,接种量为5%,180rpm,28℃培养24h;得发酵菌液;
(2)上清液制备:发酵菌液1200rpm,4℃离心30min,上清液再次离心,重复2-3次;得上清液;
(3)硫酸铵沉淀:将硫酸铵烘干磨细,依据饱和硫酸铵溶液配制表,分别称取不同等份,冰上边搅拌边加入上清液中,获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液,然后冰上静置20min,4℃,8000rpm离心5min;取上清,继续冰上边搅拌边加入硫酸铵,至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液,冰上静置20min,4℃,8000rpm离心30min,沉淀用缓冲液重悬,重悬体积为沉淀前上清液的1/10,得重悬液;缓冲液为50mmoLTris-HClpH8.0,含150mmoLNaCl,50mmoLEDTA;
(4)离子交换法分离:采用DEAESepharoseFastFlow即DEAEFF分离;
装柱:根据柱子大小,取适量的DEAEFF,加入适量的bufferA即50mmoLTris-HClpH8.0,用玻璃棒轻轻搅拌,将其引流到层析柱中;
平衡柱子:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统上操作,bufferA平衡10倍柱体积,流速1.0mL/min;
上样与洗脱:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统中设置程序,完全自动进行,全程流速1.0mL/min,当A280大于0.05时开始收集,每管收集1.5mL,程序如下:V为柱体积:
①bufferA再平衡5×V;
②重悬液上样80mL;
③bufferA平衡5×V;
④bufferB即50mmoLTris-HClpH8.0,0.8mol/LNaCl,由0%-100%梯度洗脱10×V;
⑤bufferB洗脱5×V;
⑥bufferA洗脱5×V;
(5)收集、浓缩、透析:将洗脱峰收集,同一峰的各试管合并,-70℃冰箱预冷过夜,用LG-5冷冻干燥机浓缩;冻干样品用适量bufferC溶解,移至截留分子量为30kD的透析袋中,并用bufferC透析6h,中间换透析液一次,得活性成分分离峰;bufferC为50mMTris-HClpH8.0,含50mmolNaCl,0.5mmolEDTA;
(6)抗菌活性检测:抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法:将过夜培养的病原菌-哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上,待培养基表面稍干后,将直径为6mm的无菌滤纸片放置于培养皿中,然后吸取50μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上,28℃培养,16h后观察抑菌圈,测量抑菌圈大小;
(7)蛋白质电泳检测;对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测,按常规SDS-PAGA技术规程操作,测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0kD之间。
与现有技术相比,本发明方法设计简单合理,操作方便,通过本发明方法可以分离得到具有抗哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)效果的蛋白质。
附图说明
图1为短小芽孢杆菌E14活性成分化学属性及其在在细胞中位置的确定图;其中:1为短小芽孢杆菌E14菌液,2为上清液,3为沉淀,4为水煮处理,5为蛋白酶K处理,6为2216E;
图2为不同硫酸铵浓度沉淀的活性成分图;其中:图中数字为沉淀活性成分时的硫酸铵浓度,ck1为透析缓冲液;ck2为80%硫酸铵;
图3为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAEFF分离图谱;
图4为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAEFF分离峰抑菌活性图;其中:1为透析前,2为透析后,ck1为透析液;ck2为无菌水;
图5为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAEFF分离峰蛋白电泳结果图;其中:1为透析前,2为透析后,ck1为透析液;ck2为无菌水。
具体实施方式
以下参照附图进一步描述本发明的具体技术方案,以便本领域技术人员进一步的理解本发明,而不构成对本发明权利要求的限制。
实施例1,一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法,其步骤如下:
(1)发酵生产:取培养过夜的短小芽孢杆菌E14(Bacilluspumilus)将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中,接种量为5%,180rpm,28℃培养24h;得发酵菌液;
(2)上清液制备:发酵菌液1200rpm,4℃离心30min,上清液再次离心,重复2-3次;得上清液;
(3)硫酸铵沉淀:将硫酸铵烘干磨细,依据饱和硫酸铵溶液配制表,分别称取不同等份,冰上边搅拌边加入上清液中,获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液,然后冰上静置20min,4℃,8000rpm离心5min;取上清,继续冰上边搅拌边加入硫酸铵,至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液,冰上静置20min,4℃,8000rpm离心30min,沉淀用缓冲液重悬,重悬体积为沉淀前上清液的1/10,得重悬液;缓冲液为50mmoLTris-HClpH8.0,含150mmoLNaCl,50mmoLEDTA;
(4)离子交换法分离:采用DEAESepharoseFastFlow即DEAEFF分离;
装柱:根据柱子大小,取适量的DEAEFF,加入适量的bufferA即50mmoLTris-HClpH8.0,用玻璃棒轻轻搅拌,将其引流到层析柱中;
平衡柱子:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统上操作,bufferA平衡10倍柱体积,流速1.0mL/min;
上样与洗脱:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统中设置程序,完全自动进行,全程流速1.0mL/min,当A280大于0.05时开始收集,每管收集1.5mL,程序如下:V为柱体积:
①bufferA再平衡5×V;
②重悬液上样80mL;
③bufferA平衡5×V;
④bufferB即50mmoLTris-HClpH8.0,0.8mol/LNaCl,由0%-100%梯度洗脱10×V;
⑤bufferB洗脱5×V;
⑥bufferA洗脱5×V;
(5)收集、浓缩、透析:将洗脱峰收集,同一峰的各试管合并,-70℃冰箱预冷过夜,用LG-5冷冻干燥机浓缩;冻干样品用适量bufferC溶解,移至截留分子量为30kD的透析袋中,并用bufferC透析6h,中间换透析液一次,得活性成分分离峰;bufferC为50mMTris-HClpH8.0,含50mmolNaCl,0.5mmolEDTA;
(6)抗菌活性检测:抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法:将过夜培养的病原菌哈维氏弧菌3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上,待培养基表面稍干后,将直径为6mm的无菌滤纸片放置于培养皿中,然后吸取50μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上,28℃培养,16h后观察抑菌圈,测量抑菌圈大小;
(7)蛋白质电泳检测;对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测,按常规SDS-PAGA技术规程操作,测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0kD之间。
实施例2,参照图1-5,从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法实验:
1.实验方法
1.1短小芽孢杆菌E14拮抗活性的检测
短小芽孢杆菌E14,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保存,保存号CGMCCNo.6682。
本研究采用滤纸片抑菌圈法。将短小芽孢杆菌E14接种于2216E液体培养基中,28℃培养20h,吸取0.lmL培养液均匀涂抹于2216E固体培养基平板上,待培养基表面稍干后,将直径为6mm的无菌滤纸片放置于培养皿中,然后吸取50μL待测拮抗菌分次滴加于滤纸片上,28℃培养,16h后观察抑菌圈、测量抑菌圈大小。
1.2短小芽孢杆菌E14活性物质在细胞中位置的确定
取培养过夜的液体短小芽孢杆菌E141mL菌液,于12000rpm离心30min,留上清备用。沉淀用等体积2216E重悬、超声破碎,然后取过夜发酵菌液、发酵菌液上清液及沉淀重悬液各50μL进行抑菌活性检测。
1.3短小芽孢杆菌E14活性物质属性的判断
处理1,取过夜发酵菌液约200μL,95℃水煮10min;处理2,取过夜发酵菌液约200μL,按终浓度0.1mg/mL添加蛋白酶K,55℃水浴4h。分别将处理1、处理2及过夜发酵菌液50μL进行抑菌活性检测。
1.4短小芽孢杆菌E14活性物质的分离纯化
根据前述研究结果,视活性成分的化学属性和在细胞中的位置,分别选用不同的分离纯化方法,本实验以胞外蛋白质类活性成分的分离纯化为例说明研究方法。
1.4.1短小芽孢杆菌E14活性成分的粗分离—硫酸铵分级沉淀法
(1)短小芽孢杆菌E14发酵液上清液的制备:将过夜培养的发酵液在12000rpm,4℃离心30min,取上清,再离心,至不再有沉淀为止;
(2)短小芽孢杆菌E14活性成分的小量制备:首先配制硫酸铵饱和溶液,通过调整发酵液上清液与饱和硫酸铵的比例(冰上操作),分别制备20%,40%,60%和80%硫酸铵的沉淀物,依次检测各浓度下沉淀物的抑菌活性,获得不同拮抗菌活性成分可选用的最适硫酸铵浓度;
(3)短小芽孢杆菌E14活性成分的大量制备:以步骤(2)中获得的最适硫酸铵浓度为依据,称取适量固体硫酸铵(注意用前烘干磨细),冰上边搅拌边加入发酵液上清液中,然后静置20min,沉淀用少量缓冲液(50mmolTris-HClpH8.0,含150mmolNaCl,50mmolEDTA)重悬,部分用于检测抑菌活性,部分用于后续实验。
1.4.2短小芽孢杆菌E14活性成分的细分级分离—离子交换法
采用DEAESepharoseFastFlow(以下简称DEAEFF)分离。
(1)装柱:根据柱子大小,取适量的DEAEFF,加入适量的bufferA(50mmoLTris-HClpH8.0),用玻璃棒轻轻搅拌,将其引流到层析柱中;
(2)平衡柱子:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统上操作,bufferA平衡10倍柱体积,流速1.0mL/min;
(3)上样与洗脱:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统中设置程序,完全自动进行,全程流速1.0mL/min,当A280大于0.05时开始收集,每管收集1.5mL,程序如下(下文V为柱体积):
①bufferA再平衡5×V;
②上样80mL,可根据样品体积调整;
③bufferA平衡5×V;
④bufferB(50mmoLTris-HClpH8.0,0.8mol/LNaCl)由0%-100%梯度洗脱10×V;
⑤bufferB洗脱5×V;
⑥bufferA洗脱5×V;
(4)收集、浓缩、透析和保存。将洗脱峰收集,同一峰的各试管合并,-70℃冰箱预冷过夜,用LG-5冷冻干燥机浓缩。冻干样品用少量bufferC(50mMTris-ClpH8.0,含50mMNaCl,0.5mMEDTA)溶解,移至截留分子量为30kD的透析袋中,并用bufferC透析6h,中间换透析液一次,透析后的样品用于抗菌活性实验或应用。
1.5短小芽孢杆菌E14活性成分分子量测定
常规SDS-PAGE电泳检测。
2.实验结果
3.1短小芽孢杆菌E14活性成分化学属性及其在在细胞中位置的确定
按方法2.1-2.3操作,结果如图1。
95℃加热和蛋白酶K处理均可使拮抗菌丧失活性,表明该活性物质为蛋白质类;沉淀重悬液无抑菌活性以及上清液具有抑菌活性,说明抑菌活性成分被分泌在细胞外。
2.2短小芽孢杆菌E14活性物质的粗分离
按方法2.4.1操作,不同硫酸铵浓度沉淀的活性成分,其抑菌活性如图2。
由图2看出,浓度为60%和80%的硫酸铵溶液均可析出具有抑菌活性的活性成分,其中80%硫酸铵抑菌活性更强。因此后续实验大量制备活性成分时选用80%的硫酸铵浓度。
2.3短小芽孢杆菌E14活性物质的纯化
按方法2.4.2操作,梯度洗脱峰比较单一,如图3。收集分离峰,经抑菌活性检测(图4),证明该峰就是目标物即拮抗物质。
2.4短小芽孢杆菌E14活性成分分子量测定
按常规SDS-PAGA技术规程操作,经离子交换层析分离的目标峰,电泳结果如图5(透析后浓度比较小,未显示电泳条带)。可见短小芽孢杆菌E14的拮抗物质分子量在在97.2-116.0kD之间。
Claims (1)
1.一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法,其特征在于,其步骤如下:
(1)发酵生产:取培养过夜的短小芽孢杆菌E14(Bacilluspumilus)种子菌液接种于2216E液体培养基中,接种量为5%,180rpm,28℃培养24h;得发酵菌液;所述的短小芽孢杆菌E14(Bacilluspumilus)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏号为CGMCCNo.6682;
(2)上清液制备:发酵菌液1200rpm,4℃离心30min,上清液再次离心,重复2-3次;得上清液;
(3)硫酸铵沉淀:将硫酸铵烘干磨细,依据饱和硫酸铵溶液配制表,分别称取不同等份,冰上边搅拌边加入上清液中,获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液,然后冰上静置20min,4℃,8000rpm离心5min;取上清,继续冰上边搅拌边加入硫酸铵,至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液,冰上静置20min,4℃,8000rpm离心30min,沉淀用缓冲液重悬,重悬体积为沉淀前上清液的1/10,得重悬液;缓冲液为50mmoLTris-HClpH8.0,含150mmoLNaCl,50mmoLEDTA;
(4)离子交换法分离:采用DEAESepharoseFastFlow即DEAEFF分离;装柱:根据柱子大小,取适量的DEAEFF,加入适量的bufferA即50mmoLTris-HClpH8.0,用玻璃棒轻轻搅拌,将其引流到层析柱中;
平衡柱子:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统上操作,bufferA平衡10倍柱体积,流速1.0mL/min;
上样与洗脱:在BiologicDuoflowFPLC蛋白质层析系统中设置程序,完全自动进行,全程流速1.0mL/min,当A280大于0.05时开始收集,每管收集1.5mL,程序如下:V为柱体积:
bufferA再平衡5×V;
重悬液上样80mL;
bufferA平衡5×V;
bufferB即50mmoLTris-HClpH8.0,0.8mol/LNaCl,由0%-100%梯度洗脱10×V;
bufferB洗脱5×V;
bufferA洗脱5×V;
(5)收集、浓缩、透析:将洗脱峰收集,同一峰的各试管合并,-70℃冰箱预冷过夜,用冷冻干燥机浓缩;冻干样品用适量bufferC溶解,移至截留分子量为30kD的透析袋中,并用bufferC透析6h,中间换透析液一次,得活性成分分离峰;bufferC为50mmolTris-ClpH8.0,含50mmolNaCl,0.5mmolEDTA;
(6)抗菌活性检测:抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法:将过夜培养的病原菌哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上,待培养基表面稍干后,将直径为6mm的无菌滤纸片放置于培养皿中,然后吸取50μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上,28℃培养,16h后观察抑菌圈,测量抑菌圈大小;
(7)蛋白质电泳检测;对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测,测得短小芽孢杆菌E14(Bacilluspumilus)中分离抗菌蛋白质的分子量在97.2-116.0kD之间。
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