CN104370984B - 高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种高效低毒匹马霉素衍生物，分子式为C33H49NO11，化学结构式如下：该高效低毒匹马霉素衍生物是以基因工程改造菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01发酵菌体为原料，经菌体处理、有机试剂提取、反相色谱柱层析及高效液相色谱分离获得。本发明化合物结构稳定、活性好、毒性低，可作为抗真菌药物及食品防腐剂，具有良好的临床应用前景及经济价值。

Description

高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物次级代谢产物分离技术，具体涉及一种高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用。
技术背景
系统性真菌感染是一种严重的免疫系统缺陷并发症，其病原体往往具有高传播率、高增殖率、高致死率以及高耐药性等特点，严重威胁着人们的健康。由于真菌病原体耐药性的迅速发展以及药物间的相互作用等原因，目前可以在临床上用于治疗系统性真菌感染的抗真菌药物十分有限，并且治疗效果十分不理想。其中，多烯类抗生素对多种真菌病原体均具有高效的抗菌抑菌活性，且真菌病原体对其抗药性的发展十分缓慢，是目前公认的最有效的抗真菌药物。但多烯类抗生素同时也可以与哺乳动物细胞膜中的胆固醇作用，造成严重的溶血毒性，使其临床应用价值被严重限制。
匹马霉素是一种常用的多烯类抗生素，其结构简单、化学性质稳定，并被广泛用作食品(如奶酪等非灭菌食物)防腐添加剂、抗真菌兽药以及用于治疗角膜炎。匹马霉素是目前最常用的四种多烯类抗生素(匹马霉素、两性霉素B、制霉菌素及杀念菌素等)中，溶血毒性最低的一种，但其抗真菌活性同样也相对较低。相对偏低的药理性质，严重限制了匹马霉素在临床中的应用价值。因此，通过基因工程改造等方法，对匹马霉素的相关功能团进行改造优化，研究开发新的高抗真菌活性、低溶血毒性的匹马霉素衍生物，具有重要的临床应用及经济价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高效低毒匹马霉素衍生物；目的之二是提供上述匹马霉素衍生物的制备方法；目的之三是提供上述匹马霉素衍生物的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
一种高效低毒匹马霉素衍生物，分子式为C33H49NO11，结构式如下：
上述高效低毒匹马霉素衍生物的制备方法，是以基因工程改造菌株Streptomyceschattanoogensis QZ01发酵菌体为原料，经菌体处理、有机试剂提取、反相色谱柱层析及高效液相色谱分离获得，具体步骤如下：
A、突变株QZ01的构建：构建P450单加氧酶基因pimG的失活质粒，并通过结合转移失活匹马霉素工业高产菌株Streptomyces chattanoogensis L10中的P450单加氧酶基因pimG，得到突变株QZ01；
B、突变株QZ01的发酵培养：将突变株QZ01的孢子接种于种子培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养24h，得种子培养液；然后将种子培养液按10％接种量接种于发酵培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养5d，得发酵培养液；
C、菌体处理：将突变株QZ01的发酵培养液离心处理，收集发酵菌体，用水洗涤菌体3次，去除洗涤液，将发酵菌体冻干；
D、有机试剂提取：将冻干的发酵菌体用甲醇超声提取3次，每次30min，离心获得提取液，提取液合并，减压浓缩得到粗样a；
E、反相色谱柱层析：将粗样a用重量比1.5-3倍量的甲醇溶解，静置，滤除沉淀物，然后上样于反相色谱柱层析，用体积比为0∶1～1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，经HPLC检测，目标化合物由1∶0配比的甲醇水溶液洗脱得到，浓缩目标化合物所在洗脱液，得粗样b；
F、高效液相色谱分离：将粗样b溶于少量甲醇中，经高效液相色谱分离纯化，得到匹马霉素衍生物。
上述制备方法，其中，步骤A所述的P450单加氧酶基因pimG的失活是通过将基因pimG的活性位点氨基酸Cys344突变为Ala实现的。
上述制备方法，其中，步骤B所述的种子培养基配方为葡萄糖1.75％，胰蛋白胨1.5％，氯化钠1.0％；发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，酵母提取物0.7％，黄豆饼粉2.8％。
上述制备方法，其中，步骤E所述的用体积比为0∶1～1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，甲醇水溶液的体积比梯度依次为0∶1、3∶7、4∶6、6∶4、1∶0。
上述制备方法，其中，步骤F所述的高效液相色谱分离纯化是以甲醇与0.1％甲酸水溶液为流动相，甲醇与0.1％甲酸水溶液的体积比为54∶46，以流速为3ml/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为303nm，每次进样50～100μl，收集对应色谱峰，多次累加后蒸干。
上述高效低毒匹马霉素衍生物可用于制备抗真菌药物及食品防腐剂。
本发明匹马霉素衍生物是首次被分离并报道的，通过核磁共振分析确定为匹马霉素衍生物，其核磁共振数据如表1所示：
表1
本发明高效低毒匹马霉素衍生物的应用是这样实现的：以白色念珠菌为指示菌，对所述匹马霉素衍生物及匹马霉素的体外抗真菌活性进行测定，得到匹马霉素及所述匹马霉素衍生物的MIC50/MIC90值分别为1.09±0.02/1.61±0.04μg/ml及0.51±0.01/0.77±0.02μg/ml，即所述匹马霉素衍生物的抗真菌活性是匹马霉素的2倍以上。以脱纤维马全血为研究对象，体外测定匹马霉素及所述匹马霉素衍生物的溶血毒性，得到匹马霉素及所述匹马霉素衍生物的HC5o值分别为114.0μg/ml及478.4μg/ml，即所述匹马霉素衍生物的溶血毒性不足匹马霉素的1/4。本发明所述匹马霉素衍生物结构稳定，抗真菌活性高，溶血毒性低，可作为抗真菌药物及食品防腐剂，具有良好的临床应用前景及经济价值。
附图说明
图1为匹马霉素衍生物产生菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的构建示意图；
图2为本发明中的匹马霉素衍生物的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图3为本发明中的匹马霉素衍生物的核磁共振碳谱(13C NMR)。
具体实施方法
下面通过实施例对本发明作进一步描述，但这些实施例并不意味着对本发明任何限制。
实施例1
按种子培养基及发酵培养配方，分别配制500ml种子培养基及5L发酵培养基，分装于250ml三棱瓶中，每瓶装50ml，115℃灭菌30min，将突变株QZ01孢子，接入上述种子培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养24h得种子培养液。将种子培养液按10％接种量接入发酵培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养5d得突变株QZ01的发酵培养物。将发酵培养得到的5L发酵培养物离心处理，收集发酵菌体，用水洗涤菌体3次，去除洗涤液，将菌体过夜冻干；向冻干的发酵菌体加入2L甲醇，超声处理30min，离心得提取液，重复超声提取3次，提取液合并，提取液过滤，减压浓缩得到约5g粗样a；将粗样a用15ml甲醇溶解，静置，滤除沉淀物，然后上反相色谱柱层析，依次用体积比为0∶1、3∶7、4∶6、6∶4、1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，经HPLC检测，发现所述匹马霉素衍生物主要存在于1∶0配比的甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液中，将其浓缩得到约2g粗样b；将粗样b溶于少量甲醇中，经高效液相色谱分离纯化，其以甲醇与0.1％甲酸水溶液为流动相，比例为54∶46，流速为3ml/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为303nm，每次进样50μl，收集对应色谱峰，多次累加后蒸干，即得到本发明的一种匹马霉素衍生物。
实施例2
按种子培养基及发酵培养配方，分别配制1L种子培养基及10L发酵培养基，分装于250ml三棱瓶中，每瓶装50ml，115℃灭菌30min，将突变株QZ01孢子，接入上述种子培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养24h得种子培养液。将种子培养液按10％接种量接入发酵培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养5d得突变株QZ01的发酵培养物。将发酵培养得到的10L发酵培养物离心处理，收集发酵菌体，用水洗涤菌体3次，去除洗涤液，将菌体过夜冻干；向冻干的发酵菌体加入3L甲醇，超声处理30min，离心得提取液，重复超声提取3次，提取液合并，提取液过滤，减压浓缩得到约11g粗样a；将粗样a用35ml甲醇溶解，静置，滤除沉淀物，然后分三次上反相色谱柱层析，依次用体积比为0∶1、3∶7、4∶6、6∶4、1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经HPLC检测，发现所述匹马霉素衍生物主要存在于1∶0配比的甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液中，将其浓缩得到约5g粗样b；将粗样b溶于少量甲醇中，经高效液相色谱分离纯化，其以甲醇与0.1％甲酸水溶液为流动相，比例为54∶46，流速为3ml/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为303nm，每次进样50μl，收集对应色谱峰，多次累加后蒸干，即得到本发明的一种匹马霉素衍生物。
实施例3
体外测定匹马霉素衍生物的抗真菌活性及溶血毒性
体外抗真菌活性的测定是以白色念珠菌为指示菌，通过测定白色念珠菌在不同抗生素浓度下的生长情况，进而得到相应抗生素的MIC50及MIC90值。首先，将白色念珠菌的过夜培养液，按1/10000比例分别接种于LB培养基中，并按200μl/孔分装于96孔板中。配制不同浓度(0～500μg/ml)的所述匹马霉素衍生物及匹马霉素的DMSO溶液，并按2％比例分别添加于上述LB培养基中。将96孔板置于34℃培养箱中，静置培养12h，使用酶标仪测定不同浓度抗生素条件下的OD660。所测得数据对抗生素浓度绘制抑菌曲线，即可得到MIC50与MIC90值。抗生素的体外溶血毒性是以抗生素造成红细胞裂解能力的强弱来衡量的。将0.1ml不同浓度的抗生素DMSO溶液与0.9ml含2.5％去纤维马全血的PBS缓冲液混合，37℃温浴1h，5000rpm离心5min，取上清，使用酶标仪测定样品的OD545。其中，以0.1ml DMSO与0.9ml含2.5％去纤维马全血的PBS缓冲液混合所得结果为空白对照，以0.1mlDMSO与0.9ml含2.5％去纤维马全血的去离子水混合所得结果为100％溶血度。将上述结果对抗生素浓度绘制溶血曲线，即可得到HC50值。
上述实验，不同浓度抗生素均进行3组平行实验，所得实验结果如表2所示：
表2
上述实验结果表明，本发明的匹马霉素衍生物的抗真菌活性是匹马霉素活性的2倍以上，而匹马霉素衍生物的溶血毒性不足匹马霉素毒性的1/4，可见，本发明的匹马霉素衍生物结构稳定，抗真菌活性高，溶血毒性低，可作为抗真菌药物及食品防腐剂，具有良好的应用前景。
匹马霉素衍生物产生菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的构建过程如图1所示，本发明中的匹马霉素衍生物的核磁共振氢谱(1H NMR)如图2所示，本发明中的匹马霉素衍生物的核磁共振碳谱(13C NMR)如图3所示。

Claims (7)

1.一种高效低毒匹马霉素衍生物，分子式为C33H49NO11，结构式如下：
2.权利要求1所述高效低毒匹马霉素衍生物的制备方法，其特征在于：以基因工程改造菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01发酵菌体为原料，经菌体处理、有机试剂提取、反相色谱柱层析及高效液相色谱分离获得，具体步骤如下：
A、突变株QZ01的构建：构建P450单加氧酶基因pimG的失活质粒，并通过结合转移失活匹马霉素工业高产菌株Streptomyces chattanoogensis L10中的P450单加氧酶基因pimG，得到突变株QZ01；
B、突变株QZ01的发酵培养：将突变株QZ01的孢子接种于种子培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养24h，得种子培养液；然后将种子培养液按10％接种量接种于发酵培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养5d，得发酵培养液；
C、菌体处理：将突变株QZ01的发酵培养液离心处理，收集发酵菌体，用水洗涤菌体3次，去除洗涤液，将发酵菌体冻干；
D、有机试剂提取：将冻干的发酵菌体用甲醇超声提取3次，每次30min，离心获得提取液，提取液合并，减压浓缩得到粗样a；
E、反相色谱柱层析：将粗样a用重量比1.5-3倍量的甲醇溶解，静置，滤除沉淀物，然后上样于反相色谱柱层析，用体积比为0:1～1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，经HPLC检测，目标化合物由1:0配比的甲醇水溶液洗脱得到，浓缩目标化合物所在洗脱液，得粗样b；
F、高效液相色谱分离：将粗样b溶于少量甲醇中，经高效液相色谱分离纯化，得到匹马霉素衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤A所述的P450单加氧酶基因pimG的失活是通过将基因pimG的活性位点氨基酸Cys344突变为Ala实现的。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤B所述的种子培养基配方为葡萄糖1.75％，胰蛋白胨1.5％，氯化钠1.0％；发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，酵母提取物0.7％，黄豆饼粉2.8％。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤E所述的用体积比为0:1～1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，甲醇水溶液的体积比梯度依次为0:1、3:7、4:6、6:4、1:0。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤F所述的高效液相色谱分离纯化是以甲醇与0.1％甲酸水溶液为流动相，甲醇与0.1％甲酸水溶液的体积比为54:46，以流速为3ml/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为303nm，每次进样50～100μl，收集对应色谱峰，多次累加后蒸干。
7.权利要求1所述高效低毒匹马霉素衍生物在制备抗真菌药物及食品防腐剂中的应用。
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