CN102993030B

CN102993030B - 苯炔类化合物及其制备方法及在水稻病原菌防治上的应用

Info

Publication number: CN102993030B
Application number: CN201210514877.3A
Authority: CN
Inventors: 郑永标; 黄建忠; 刘艳如; 吴小君
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-12-05
Also published as: CN102993030A

Abstract

本发明涉及一种苯炔类化合物及其制备方法及在水稻病原菌防治上的应用，属于生物防治领域。所述苯炔类化合物的分子式为C₁₀H₇NO。通过将花脸香蘑（Lepistasordida）活化后进行液体深层发酵，分离得到有抑菌活性的苯炔类化合物。本发明制备的苯炔类化合物对水稻细条病和水稻稻瘟病有较好的防治效果，可以利用菌株Lepistasordida发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

Description

苯炔类化合物及其制备方法及在水稻病原菌防治上的应用

技术领域

本发明涉及一种苯炔类化合物及其制备方法及在水稻病原菌防治上的应用，属于生物防治领域。

背景技术

大型真菌不但种类繁多，而且是“创造系数”很高的生物类群。大型真菌中发现的天然产物结构多样，并且具有抗细菌、促进神经生长因子合成、酶抑制剂、抗真菌、细胞毒、受体拮抗剂和抗氧化等多种生物活性。

担子菌与人类的关系极为密切。在发现了一些种对抗肿瘤和预防冠心病方面有作用之后，受到了医药界的重视并引起极大的兴趣。担子菌产生的生理活性物质有多糖类、多肽和蛋白质、抗生素类、维生素类等，其中抗生素类包含聚乙炔类化合物，如田头菇素（Agrocybin），HOCH2·(C≡C)3·CONH2，来源于Agrocybe cylindracea，对革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌有拮抗作用。

微生物源农药包括农用抗生素和活体微生物两大类。其中农用抗生素是由抗生菌发酵所产生的具有农药功能的次生代谢物质，它是有明确分子结构的化学物质。农用抗生素无疑是农药中的一个重要组成。由于其源于生物，故越来越受到人们关注。目前，在害虫的生物防治方面，真菌是研究、生产和应用最多的生物类群之前。真菌类生物农药主要是生真菌，目前在世界上记载的约有100属，800多种，大部分是兼性或专性病原体。真菌杀虫剂的研究在我国有较长历史，对制剂的安全性、防治松毛虫和玉米螟等研究都做了大量工作，但工业化生产技术至今未解决，因而始终没有正式商品问世。

开发具有防治水稻稻瘟病、纹枯病和细菌性条斑病等重大病害的绿色农药，对保护稻田湿地功能和减少稻田由于化学农药使用造成的面源污染具有重要意义，也可促进生态农业和绿色农业的发展。基于以上背景，开展本发明的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种由真菌发酵产物制备的苯炔类化合物及其制备方法及在水稻病害防治中的应用。

本发明首先提供了一种苯炔类化合物，所述苯炔类化合物的分子式为C₁₀H₇NO，结构式如下：

本发明还提供了一种苯炔类化合物的制备方法，制备方法包括以下步骤：

1)液体培养及发酵产物处理：将花脸香蘑（Lepista sordida）活化后进行液体深层发酵，液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯16-25%，葡萄糖1.5-2.5%，余量为水，pH自然，0.1Mpa、121℃灭菌30min，置于25－28℃，180－230r/min恒温摇床中培养10-15天；发酵结束后，用离心法将菌丝体与发酵液分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；

2)产物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用含体积比为1‰－1% 甲酸的甲醇-水梯度洗脱，对洗脱液组份用圆形滤纸片法测定抗菌活性（供试菌株为水稻细条病病原菌，下同），合并具有活性的组分，用甲醇溶解，进行凝胶柱层析，用含体积比为1‰－1% 甲酸的丙酮或甲醇溶液洗脱，洗脱液组份用圆形滤纸片法进行抑菌活性追踪，收集活性组分进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用含体积比为1‰－1% 甲酸的氯仿溶液洗脱，洗脱液组份同样采用圆形滤纸片法进行抑菌实验，得到有抑菌活性的苯炔类化合物。

步骤1）所述液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯20%，葡萄糖2%，余量为水。

步骤2）中所述进行反相硅胶柱层析，用含体积比为1‰－1% 甲酸的甲醇-水梯度洗脱，其中甲醇所占体积比分别为：10%、20%、30%、40%、50%、60%。

本发明另外提供了所述的苯炔类化合物在水稻病害防治中的应用。所述水稻病害为水稻稻瘟病或水稻细条病。

本发明制备的苯炔类化合物对水稻细条病和水稻稻瘟病有较好的防治效果，可以利用菌株Lepista sordida发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

附图说明

图1化合物LS5的化学结构式。

图2不同浓度LS5对水稻稻瘟病菌孢子萌发的抑制（注：图中数字表示化合物的浓度分别为0、1、2、4和8μg/100μL）。

图3为化合物LS5对水稻细条病病原菌的抑制作用 (注：1表示每滤纸片含供试化合物5μg/mL，2和3为对照)。

具体实施方式

本发明提供的苯炔类化合物的的制备方法，其步骤为：

1)液体培养及发酵产物处理：将花脸香蘑（Lepista sordida）（花脸香蘑对水稻细条病的抑制活性研究初报，中国农学通报，2012，28（12）：202－205.）斜面菌种先接种于装有150mL马铃薯液体培养基的三角瓶中活化，活化条件为转速230 r/min，培养温度28℃，培养时间7天，再进行大批量的液体深层发酵，采用培养基配方为：每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5 g，pH自然, 0.1Mpa,121℃灭菌30min，置于25－28℃，180－230　r/min恒温摇床中培养。发酵10－15天后，用离心法将菌丝体与发酵液分离。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，所得萃取物用无水硫酸钠脱水，再用旋转蒸发仪于40℃条件下真空浓缩，得到有机粗提物浸膏。

2)化合物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用不同梯度甲醇-水洗脱（含1‰－1% 甲酸），洗脱液用圆形滤纸片法测定抗菌活性物质，合并具有活性的组分，将活性组分用甲醇溶解，进行凝胶柱层析，丙酮或甲醇（含1‰－1% 甲酸）洗脱，洗脱液用圆形滤纸片法活性追踪，收集活性组分，接着进行正相硅胶层析，氯仿装柱，干法上样，用氯仿（含1‰－1% 甲酸)洗脱得到活性化合物纯品。

对纯品进行NMR（核磁共振）分析，并进行生物活性测试。

根据NMR（核磁共振）数据，对化合物进行结构鉴定，可确定化合物的结构。

本发明所述的化合物为苯炔类化合物4-(4-aminobuta-1,3-diynyl)phenol，分子式为C₁₀H₇NO，结构式如下：

根据化合物4-(4-aminobuta-1,3-diynyl)phenol的生物活性测定，发现对水稻稻瘟病和细条病菌均有防治效果，在稻瘟病菌孢子悬液中加入化合物4-(4-aminobuta-1,3-diynyl)phenol，完全抑制水稻稻瘟病孢子萌发的最小抑制浓度为8μg/100μL（实施例2）。圆型滤纸片活性测试表明每滤纸片添加5 μg该化合物，抑制水稻细条病的抑菌圈直径为1.8 cm（实施例3）。

实施例1

用马铃薯葡萄糖培养基（每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20g，pH自然，0.1Mpa，121℃灭菌30min），将活化后的菌株Lepista sordida液体发酵培养3 L，于28 ℃摇床培养12 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至0.5 L，发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用无水硫酸钠脱水后浓缩，再用甲醇溶解过滤，得甲醇可溶粗提物(186.6mg，褐色浸膏)。

将上一步骤中186.6mg甲醇粗提物，用适量甲醇充分溶解，进行反相硅胶(30 g)柱层析，用不同梯度甲醇-水洗脱（含1‰甲酸），流速约为15 mL /min，每试管收集20 mL，每试管取样进行薄层层析（展开剂为氯仿：甲醇＝15：1，显色剂：10%硫酸乙醇，碘化铋钾；下同）分析结果，合并相似组分，将所得到的组分为A(43.6mg), B(23mg), C(2.7mg), D(5.3mg), E(69.1mg), F(13.5mg), G(31.9mg), H(13.9mg)9个组分。采用滤纸片法对9个组分(（用量为每滤纸片100 μg ）进行抑菌实验,获得活性组分E(69.1mg)。

从上一步骤得到的组分E(69.1mg)，用适量甲醇溶解，进行将组分E进行凝胶(120g Sephadex LH-20)柱层析，丙酮（含1‰甲酸）洗脱，流速约为12 s／drop,每管收集3mL，根据薄层层析分析得到了E1（2.5 mg），E2（7.4mg），E3（22.7mg），E4（10.2mg）和E5（12.4mg）5个组分。同样采用滤纸片法对5个组分（用量为每滤纸片10 μg ）进行抑菌实验,获得对水稻细条病有抑制活性的E3组分。

从上一步骤中E3（22.7 mg）进行正相硅胶层析（1g 硅胶），氯仿装柱，干法上样，用100 ml氯仿（含1‰甲酸)洗脱得到LS5（4.1mg)，并得到其它２个组分。同样采用滤纸片法对3个组分（用量为每滤纸片5μg ）进行抑菌实验，制备得对水稻细条病有抑制活性的化合物LS5（4.1 mg）。

将上一步骤所得的化合物用氘代甲醇溶解，转移到核磁管中，进行核磁共振波谱（¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H,¹H-COSY）测定，并确定化合物结构。

所述化合物的¹H NMR(500 MHz， (CD₃)₂OD )：δ 6.89 (d, J=16.1, 1H, H-2), δ 6.89 (d, J=16.1, 1H, H-6), δ 6.71 (d, J=16.1, 1H, H-3), δ 6.71 (d, J=16.1, 1H, H-5)。所述化合物的¹³C NMR(500 MHz, (CD₃)₂OD )：δ(165.3s,C-1), δ(121.2d, C-2), δ(121.2d,C-6), δ(140.2d, C-3), δ(140.2d,C-5), δ(105.5s,C-4), δ(77.8s, C-7), δ(78.6s, C-8), δ(56.9s, C-9), δ(66.7s, C-10)。从化合物的¹H-NMR（d 6.90，d 6.77和它们之间的藕合常数16.1）和¹³C-NMR的化学位移值(165.3s,121.2d,140.2d,105.5s)表明化合物中含有对位取代的苯环结构单元。另据¹³C-NMR化学位移值（78.6s,77.8s,66.7s和56.9s）推测其为4个炔碳。根据H-C(1) 与C(3)、C(5)、C(1)、C(7)、C(10)、C(9)和H-C(2) 与C(8),C(2),C(6),C(1)的HMBC远程相关，确定了化合物的结构（图1）。

综上所述，确定化合物为4-(4-aminobuta-1,3-diynyl)phenol。

实施例2

将稻瘟病菌培养至产生孢子后,将稻稻瘟菌菌落用无菌水冲洗于三角瓶内,充分震荡摇匀,用无菌纱布过滤得到其孢子悬浮液,经显微镜观察统计,孢子浓度为7.5×10⁵个/mL。样品用甲醇溶解后用0.1%的吐温80无菌水稀释。分别吸取50μL 稻瘟病菌孢子悬液,和50μL经稀释的样品溶液，滴在于凹玻片的凹处。最终样品的含量分别为1μg/100μL、2μg/100μL、4μg/100μL、8μg/100μL。轻轻混匀后置于垫有湿滤纸的培养皿中。用甲醇设置空白对照，每处理3 个重复，置25 ℃恒温箱内悬滴培养12 h，显微观察各处理的孢子萌发形态变化并显微摄影。结果表明化合物LS5对水稻稻瘟病菌孢子萌发的抑制作用较强，最低抑制浓度为8μg/100μL（图2，图中数字表示化合物的浓度分别为0、1、2、4和8μg/100μL，其抑制水稻稻瘟病菌孢子萌发的抑制率分别为5.17%、4.34%、21.36%、49.56和96.75%）。用花脸香蘑发酵液粗提物（粗提物制备方法：发酵液用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，用无水硫酸钠进行脱水后，真空蒸干后获得），所需的粗提物含量为100μg/100μL时，对水稻稻瘟病孢子萌发的抑制率达到98.76%。因此，用纯的化合物LS5活性明显比粗提物高。

实施例3

水稻细条病原菌经划线活化后，刮取供试细菌菌苔一环接至5 mL无菌水中，摇匀菌悬液，倒入溶化并冷却至45~50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，摇匀后，迅速分装于培养皿中，每个培养皿中倒入20 mL，待凝固后备用。将所述的化合物4-(4-aminobuta-1,3-diynyl)phenol配制成浓度为1 mg/mL甲醇溶液，取已消毒过的直径 6mm的圆型纸片1片，用微量吸液管加入样品液5 μL，待溶剂挥发干后，贴于含有供试细菌培养基平板上，同时以溶剂作对照，尔后置于恒温培养箱中倒置培养(28℃)，48 h后观察结果。结果表明该化合物（5 μg/每滤纸片）可以明显抑制水稻细条病的生长，抑菌圈直径为1.8 cm（图3，1表示每滤纸片含供试化合物5μg/mL，抑菌圈直径为1.8㎝，2和３为对照，没有抑菌圈）。

Claims

1.一种苯炔类化合物，其特征在于：所述苯炔类化合物的分子式为C₁₀H₇NO，结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述的苯炔类化合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：

1)液体培养及发酵产物处理：将花脸香蘑活化后进行液体深层发酵，液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯16-25%，葡萄糖1.5-2.5%，余量为水，pH自然，0.1MPa、121℃灭菌30min，置于25-28℃，180-230r/min恒温摇床中培养10-15天；发酵结束后，用离心法将菌丝体与发酵液分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；

2)产物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用含体积比为1‰-1% 甲酸的甲醇-水梯度洗脱，对洗脱液组份用圆形滤纸片法测定抗菌活性，合并具有活性的组分，用甲醇溶解，进行凝胶柱层析，用含体积比为1‰-1% 甲酸的丙酮或甲醇溶液洗脱，洗脱液组份用圆形滤纸片法进行抑菌活性追踪，收集活性组分进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用含体积比为1‰-1% 甲酸的氯仿溶液洗脱，洗脱液组份同样采用圆形滤纸片法进行抑菌实验，得到有抑菌活性的苯炔类化合物；

步骤2）中所述进行反相硅胶柱层析，用含体积比为1‰-1% 甲酸的甲醇-水梯度洗脱，其中甲醇所占体积比分别为：10%、20%、30%、40%、50%、60%。

3.根据权利要求2所述的苯炔类化合物的制备方法，其特征在于：步骤1）所述液体深层发酵的培养基配方按重量比为：马铃薯20%，葡萄糖2%，余量为水。

4.如权利要求1所述的苯炔类化合物在水稻病害防治中的应用。

5.根据权利要求4所述的苯炔类化合物的应用，其特征在于：所述水稻病害为水稻稻瘟病或水稻细条病。