CN108342325B - 一种蝉虫草来源的蒽醌类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蝉虫草来源的蒽醌类化合物及其制备方法和应用。首先提供了一种蝉虫草真菌（Cordyceps cicadae）SUSY‑01，该菌株已于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60290。并从该真菌中发现了一种新的蒽醌类化合物，具有显著的抑菌活性，具有很好的药用价值，在制备抑菌药物以及保健品中具有重要的应用价值。而且，该蒽醌类化合物原料来源于蝉虫草真菌，蝉虫草真菌稳定、易培养、来源丰富，利用该真菌制备蒽醌类化合物的方法简单可行，成本低，适用于大规模工业应用，具有很好的推广应用前景。

Description

一种蝉虫草来源的蒽醌类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种蝉虫草来源的蒽醌类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
蝉虫草是麦角菌科蝉草属真菌大蝉草的蝉拟青霉寄生在蝉若虫上形成的虫菌复合体，具有丰富的营养及活性成分。文献古籍记载蝉花具有散风热、镇惊、明目之功效，注治少儿天吊、夜啼心悸，祛风止痉，麻疹、目赤、多泪。药用部位是蝉花全株。蝉花由菌核、孢梗束和孢子粉三部分构成，文献药理研究报道及临床经验绝大部分均全株入药或研究。据现代药理研究发现，蝉花主要有免疫调节作用、抗肿瘤作用、镇痛安眠缓解精神压力、促进血液红细胞再生改善血液环境状态、滋补肾亏肾虚、改善糖尿病性视网膜病变等多种药理作用等。
文献报道的蝉虫草活性成分主要有多球壳菌素、麦角甾醇及过氧化物、虫草酸、虫草素、腺苷以及多种肽类化合物，如白僵菌素、白僵菌酮、白僵菌酮甲、白僵菌素甲以及白僵菌素乙等，具有重要的药用价值。
蝉虫草活性成分的进一步研究和挖掘，对于蝉虫草的应用和新药研发都具有重要的现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是进一步研究挖掘蝉虫草的活性成分和应用价值，从该真菌中发现了一种新的蒽醌类活性成份，该化合物具有显著的抑菌活性，具有很好的药用价值。
本发明的目的是提供一种蝉虫草真菌(Cordyceps cicadae)SUSY-01。
本发明另一目的是提供一种蝉虫草真菌来源的蒽醌类化合物Cicadaquinone。
本发明的再一目的是提供所述蒽醌类化合物的制备方法及其应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种蝉虫草真菌(Cordyceps cicadae)SUSY-01，该菌株已于2017年11月 24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60290，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一种蝉虫草真菌来源的蒽醌类化合物，其结构式如下式(I)所示：
该蒽醌类化合物来源于蝉虫草真菌SUSY-01的孢梗束部位，制备方法包括真菌的种子培养、发酵培养、分离菌丝体、有机溶剂萃取菌丝体、色谱分离、凝胶柱层析分离以及重结晶纯化等步骤。具体步骤如下：
S1.种子培养：权利要求1所述蝉虫草真菌SUSY-01的种子培养，得种子液；
S2.发酵培养：将种子液转接入固体大米发酵培养基中，培养至收获蝉虫草子实体；
S3.步骤S2培养好的蝉虫草子实体，选取孢梗束部位，粉碎后用甲醇提取三次，浓缩提取液，从获得的浓缩浸膏中分离纯化得到蒽醌类化合物。
其中，优选地，步骤S1所述种子液的培养方法：挑取蝉虫草真菌SUSY-01 接入斜面培养基，28～30℃培养3～5天。
优选地，所述斜面培养基的配方为：琼脂1.5～2.5％，氯化钠1.5～4％，蛋白胨0.1～0.5％，葡萄糖0.2～0.4％，酵母提取物0.05～0.2％，余量水。
更优选地，所述斜面培养基的配方为：琼脂2.5％，氯化钠3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.3％，酵母提取物0.1％，余量水。
优选地，步骤S2所述固体大米发酵培养基的配方为大米：葡萄糖水溶液＝0.5～1.5：0.5～1.5。
更优选地，步骤S2所述固体大米发酵培养基的配方为大米：葡萄糖水溶液＝1：1。
更优选地，所述葡萄糖水溶液中葡萄糖的含量为5～20％。
优选地，步骤S2所述培养的条件为：温度15～35℃，湿度60～90％，光照强度100～600LUX、光照时间8～12小时。
优选地，步骤S2所述培养的时间为4～6周。
更优选地，步骤S2所述培养的时间为30～35天。
优选地，步骤S3所述分离纯化的方法：利用柱层析色谱分离，收集50～60％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，再以柱层析分离技术进行分离。
优选地，所述柱层析分离技术为硅胶柱层析分离技术、凝胶柱层析分离技术或C-18反相柱层析分离技术。
由上述方法制备得到的蒽醌类化合物也在本发明的保护范围之内。
另外，该蒽醌类化合物具有显著的抑制细胞活性，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等具有很好的抑菌活性，是潜在的抗菌药物。
因此，所述蒽醌类化合物在抑菌方面的应用，具体是在制备具有抑菌活性的制剂方面的应用，以及在制备抗菌药物或保健品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种蝉虫草真菌SUSY-01，并从该真菌中发现了一种新的蒽醌类活性成份，该化合物具有显著的抑菌活性，具有很好的药用价值，在制备抑菌药物以及保健品中具有远大的市场前景。
本发明的蒽醌类化合物原料来源于蝉虫草真菌，来源丰富、稳定、成本低廉；而且，蝉虫草真菌稳定，易培养，利用该真菌制备蒽醌类化合物的方法简单可行，成本低，适用于大规模工业应用，具有很好的推广应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1真菌SUSY-01的分离与鉴定
1、材料：从中国湖北黄梅县采集的蝉虫草真菌样品。
2、经过菌株的培养、分离、鉴定，获得纯蝉虫草真菌菌株，经过鉴定为蝉虫草真菌(Cordyceps cicadae)SUSY-01，该菌株已于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60290。
实施例2蒽醌类化合物的制备
1、从蝉虫草真菌SUSY-01中分离制备蒽醌类化合物，步骤如下：
(1)蝉虫草真菌(Cordyceps cicadae)SUSY-01的种子培养：
培养基组成按重量比为：琼脂2.5％，水98％；氯化钠3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.3％，酵母提取物0.1％；
培养基制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30℃培养3天，得种子液。
(2)蝉虫草真菌SUSY-01的发酵培养：
固体大米发酵培养基配方为大米：葡萄糖水溶液＝1：1；
将种子液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，始终控制温度15～35℃、湿度60～90％、光照强度100～600LUX光照时间8～12小时，直至30～35天蝉虫草采收为止。
(3)将上述培养好蝉虫草孢梗束部位用甲醇提取三次，浓缩提取液，将获得的浓缩浸膏利用柱层析色谱分离；收集50～60％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，再以硅胶、凝胶、C-18反相等柱层析分离技术进行分离，得到化合物1。
2、蒽醌类化合物的结构测试解析
对上述得到的化合物1进行结构测试解析，得到以下试验数据：
化合物1：C22H22O8；HRESIMS：535.1314[M+H]+(理论计算值535.1315)；m.p.310–312℃；一维核磁共振数据见表1。
表1化合物1的NMR数据(CDCl3，125MHz/400MHz,ppm)
经过鉴定，化合物1为蒽醌类化合物，其结构式如下所示：
实施例3蒽醌类化合物的抑菌实验
1、材料：
菌种：大肠杆菌标准株(ATCC29522)、金黄色葡萄球菌标准株(ATCC29213)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、白色假丝念珠球菌标准株(ATCC10231)；
阳性对照：环丙沙星(细菌对照物)和氟康唑(真菌对照物)；
溶剂配制：二甲基亚砜(dimethyl smLfoxide,DMSO)为溶剂(Sigma,St.Lo uis,Mo.)。
2、实验方法——测量最低抑菌浓度(MIC)
(1)细菌悬液的制备：
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌分别接种于肉汤和 LB培养基中，37℃摇菌24h；
白色念珠菌挑取一个菌落，加入1mL沙保罗培养基，混匀后35℃摇菌24h～ 48h；
淋球菌临用前挑取数个菌落用MH肉汤稀释，麦氏比浊仪(DENSIMAT, Bio-Merieux公司)调整试管内菌液浓度为0.5麦氏比浊度，相当于5×107,8集落形成数(CFU)/mL的含菌量，1:10稀释备用，10min内接种。
(2)采用二倍稀释法在96孔板进行药物体外抑菌活性定
以无菌肉汤稀释样品及阳性对照药物至4倍最大期望最终检测浓度，加入检测孔中，然后对药物进行2倍系列稀释，并设有无药对照孔，将稀释好的菌液加入所有检测孔中以及无药对照孔中，每孔所含菌量约为5×105cfu/孔。
3、实验结果
结果测得蒽醌类化合物Cicadaquinone的抑菌MIC50值(μg/mL)见表2。
表2蒽醌类化合物Cicadaquinone的抑菌试验结果(MIC50值μg/mL)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种蝉虫草真菌(Cordyceps cicadae)SUSY-01，其特征在于，该菌株已于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60290。
2.一种蝉虫草真菌来源的蒽醌类化合物，其特征在于，其结构式如下式(I)所示：
3.权利要求2所述蒽醌类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.种子培养：权利要求1所述蝉虫草真菌SUSY-01的种子培养，得种子液；
S2.发酵培养：将种子液转接入固体大米发酵培养基中，培养至收获蝉虫草子实体；
S3.步骤S2培养好的蝉虫草子实体，选取孢梗束部位，粉碎后用甲醇提取三次，浓缩提取液，从获得的浓缩浸膏中分离纯化得到蒽醌类化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述固体大米发酵培养基的配方为大米：葡萄糖水溶液＝0.5～1.5：0.5～1.5。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述培养的条件为：温度15～35℃，湿度60～90％，光照强度100～600LUX、光照时间8～12小时。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述分离纯化的方法：利用柱层析色谱分离，收集50～60％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，再以柱层析分离技术进行分离。
7.权利要求2所述蒽醌类化合物在制备具有抑菌活性的制剂方面的应用。
8.权利要求2所述蒽醌类化合物在制备抗菌药物或保健品中的应用。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、大肠杆菌或沙门氏菌。
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