CN105503531A - 一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用，所述提取物是从真菌Trichoderma？sp.的培养发酵液的乙酸乙酯萃取液中浓缩、分离得到的无色油状物；所述无色油状物为倍半萜类化合物。本发明提供了上述提取物的制备方法，包括以下步骤：真菌Trichoderma？sp.的种子培养、发酵培养、发酵培养物的提取。本发明制备的提取物可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。本发明为阿尔茨海默病药物的制备提供了新的方法。

Description

一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和化学领域，尤其涉及一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用。
背景技术
老年痴呆特别是阿尔茨海默型痴呆(Alzheimer’sDisease:AD)，也就是通常所说的阿尔茨海默病，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。据中国阿尔茨海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，每7秒就有一个人患上此病，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。这也使得AD症的预防和治疗成为21世纪以来需要攻克的重大医药课题。
关于阿尔茨海默病的发病机制，一般认为Aβ聚集体的形成是引发阿尔茨海默病的重要原因。β-淀粉样多肽(Aβ),尤其是含有42个氨基酸残基的Aβ(1-42),被认为是阿尔茨海默病发病的核心蛋白。目前主流的Aβ中心学说认为:体内Aβ正常的产生和清除的平衡一旦破坏,就会发生Aβ的积累,这导致了阿尔茨海默病的发生,而Aβ的聚集则是产生生理毒性的关键。现在还没有发现合适的药物能够从根本上解决Aβ的聚集及毒性的产生从而治愈疾病，因此，寻找新型的能够抑制Aβ聚集的小分子有机化合物及其制备方法，进而从根本上治疗阿尔茨海默病已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够抑制Aβ聚集的小分子有机化合物及其制备方法，进而从根本上治疗阿尔茨海默病。
本发明是这样实现的，一种真菌培养物的提取物，所述提取物是从真菌Trichodermasp.的培养发酵液的乙酸乙酯萃取液中浓缩、分离得到的无色油状物；所述无色油状物为倍半萜类化合物；所述倍半萜类化合物包括以下化合物，化合物的结构式如下所示：
(式I)；
所述倍半萜类化合物包括以下化合物中的一种或两种，化合物的结构式如下所示：
(式II)；
(式III)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种真菌培养物的提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将真菌Trichodermasp.接种到种子培养基中，获得种子培养液；
(2)按接种量将种子培养液接种到大米固体培养基中，室温静置培养40～50天，获得发酵培养液；
(3)将上述发酵培养液用乙酸乙酯萃取，获得萃取液，经浓缩、分离获得真菌Trichodermasp.培养物的无色油状提取物。
进一步地，所述萃取液浓缩、分离的过程为：将萃取液在低于50℃下减压浓缩得发酵液浸膏；将发酵液浸膏经硅胶柱层析分离、反向硅胶柱层析分离、反向HPLC分离纯化，获得真菌Trichodermasp.培养物的提取物。
进一步地，所述种子培养液的配置过程为：Trichodermasp.接种到种子培养基上，在转速220r/min、27～29℃条件下培养47～49小时获得种子培养液。
进一步地，所述种子培养基的成分，按重量百分比计，包括：葡萄糖1.9～2.1％，蛋白胨0.9～1.1％，酵母提取物0.4～0.6％，海盐2～4％，其余为去离子水；所述种子培养基经121℃高压灭菌20分钟后获得。
进一步地，所述大米固体培养基的成分包括海盐、去离子水和大米，所述海盐、去离子水、大米的质量比为7～8:240～260:140～160。
进一步地，所述大米固体培养基的配制过程为：按质量比称取海盐、去离子水和大米，将海盐完全溶解于去离子水中，然后加入大米，浸泡过夜，再经121℃高压灭菌40分钟获得大米固体培养基。
进一步地，所述接种量为每1mL种子培养液对应28～32g大米培养基。
进一步地，所述萃取过程具体为：按比例向发酵提取物中添加乙酸乙酯，所述乙酸乙酯与发酵提取物的体积比为70～90:5。
进一步地，所述萃取为超声萃取，超声萃取时间为30～40分钟，频率为40KHz。
为了解决上述技术问题，本发明还一种真菌培养物的提取物的应用，所述提取物用于制备抗Aβ42聚集活性的制剂。
进一步地，所述提取物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明在深海真菌Trichodermasp.的发酵培养物中首次分离出3个倍半萜类化合物，其中1个是新化合物。我们对所述倍半萜类化合物进行抗Aβ聚集活性测定，其中1个化合物具有很强的抗Aβ聚集活性，另外2个化合物具有较强的抗Aβ聚集活性。本发明的提取物可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
近几十年来，天然产物领域的技术不断成熟及实验设备不断完善，从陆地环境的生物分离得到一些具有治疗AD症的先导化合物，但有限的陆地资源使得发现新的具有抗AD的活性化合物出现明显减缓趋势，而海洋是生命的发源地且占地球表面积的2/3，和陆地环境相差甚远，产生与陆地真菌不同的次级代谢产物的可能性比较大，因此海洋的研究空间不仅非常广阔，而且具有极其重要的研究意义。
本发明首先对采自中国南海深海真菌SCSIOW21进行菌种鉴定，确定菌株名称Trichodermasp.，然后利用大米固体培养基对深海来源真菌20株进行了初步发酵，乙酸乙酯萃取得到提取物后，运用TLC薄层色谱分析，正、反相硅胶柱色谱，SephadexLH-20凝胶柱色谱，高效液相等现代色谱学手段对发酵产生的次级代谢产物进行分离纯化，并对得到的化合物应用现代波谱学方法(MS、NMR、COSY、HSQC、HMBC、NOE等)和理化性质等确定其化学结构。对提取物进行了多种活性测定，包括一氧化氮(NO)产生抑制活性、抗癌细胞毒活性、A-Beta蛋白聚集抑制活性、以及多种细菌的抗菌活性。最后，利用ThT模型对分离得到的化合物进行抗Aβ42多肽聚集活性的筛选，试图发现抗老年痴呆的活性化合物，从而解决困扰老年人身体健康的重大疾病。
按照本发明的技术方案进行如下操作：
一、种子培养：
将低温保藏的深海真菌菌种Trichodermasp.SCSIOW21复苏后，将菌种接种到种子培养基中，27～29℃培养47～49小时，得到种子培养液；
其中，种子培养基的配方为：葡萄糖1.9～2.1％，蛋白胨0.9～1.1％，酵母提取物0.4～0.6％，海盐2～4％。经121℃高压灭菌20分钟。
二、发酵培养：
将种子培养液接种到大米固体培养基中，室温静置培养40～50天，获得深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21的发酵培养物；
其中，大米固体培养基的成分包括海盐、去离子水和大米，其中，海盐：去离子水：大米的质量比为7～8:240～260:140～160。具体的制备方法为：按比例称取海盐溶于去离子水中，待海盐完全溶解后，加入大米，浸泡过夜。经121℃高压灭菌40分钟。按照每5mL种子培养液配140～160g大米的比例接种。
按照上述方法发酵后，就可以得到含有所述倍半萜类化合物的深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21的发酵培养物，为了获取所述倍半萜类化合物，还需要进一步提取分离。本发明中还提供利用深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21发酵物提取纯化所述倍半萜类化合物的方法，具体包括以下步骤：
超声萃取：将深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21的发酵培养物用乙酸乙酯超声萃取，萃取液在低于50℃下减压浓缩得发酵液浸膏；重复前述萃取步骤数次，合并发酵液浸膏；
硅胶柱层析分离：将发酵液浸膏拌入硅胶后装硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱溶剂梯度洗脱，经TLC分析，根据极性大小的不同获取两个组分W21-1、W21-2；
反向硅胶柱层析分离：分别将W21-1、W21-2组分进行反向硅胶柱层析分离，以甲醇-水为洗脱溶剂梯度洗脱，经TLC分析，分别得到组分W21-1-1、W21-2-1；
反向HPLC分离纯化：组分W21-1-1、W21-2-1用反向HPLC柱分离纯化，0-30min内甲醇浓度分别由30％和50％的等浓度冲洗，W21-1-1收集后即可得到纯化的式(I)倍半萜类化合物，W21-2-1收集后可得到纯化的式(Ⅱ)和式(Ⅲ)倍半萜类化合物。
其中，所述超声萃取过程中，按照每5mL种子培养液配350～450mL的乙酸乙酯比例添加乙酸乙酯。所述硅胶柱层析分离过程中，所用硅胶为200～300目，洗脱溶剂梯度为氯仿-甲醇体积比100:0，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，9:1，8:2，7:3，6:4，0:100。
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1真菌培养物的提取物的制备和结构鉴定
一、提取物的制备
1.种子培养：
(1)配制种子培养基：葡萄糖1.9～2.1％，蛋白胨0.9～1.1％，酵母提取物0.4～0.6％，海盐2～4％。121℃高压灭菌20分钟，获得灭菌的种子培养基。
(2)种子的培养：低温保藏的深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21经复苏后，将此菌株接入到上述种子培养基中，于27～29℃、220r/min转速下摇床培养47～49小时得到种子培养液。
2.发酵培养：
(1)配制发酵培养基(大米固体培养基)：称取450克海盐溶于14～16升的去离子水中，待海盐完全溶解后，平均分装于60个装有140～160克大米的2000mL的锥形瓶中，浸泡过夜。121℃高压灭菌40分钟，获得灭菌的发酵培养基。
(2)发酵培养：在超净的工作台中，将5mL种子培养液接入装有140～160克大米的2000mL的锥形瓶中，总共60瓶。室温静置培养40～50天，获得深海真菌Trichodermasp.SCSIOW21的发酵培养物。
3.提取分离：
将上述每瓶固体发酵液用350～450mL的乙酸乙酯超声萃取，萃取液在低于50℃下减压浓缩得发酵液浸膏，反复萃取3次，合并得到发酵液浸膏20克。该发酵液浸膏拌入200-300目的硅胶后装硅胶柱，经硅胶柱层析分离，采用氯仿-甲醇(体积比100:0，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，9:1，8:2，7:3，6:4，0:100)梯度洗脱，经TLC分析，根据极性大小的不同，减压浓缩后，相应的得到11个馏分。选取组分W21-1和W21-2分别进行反向硅胶柱层析分离，以水-甲醇为洗脱溶剂梯度洗脱(体积比8:2，4:6，3:7)，经TLC分析，分别得到组分W21-1-1、W21-2-1。组分W21-1-1、W21-2-1用反向HPLC柱进一步分离纯化，0-30min内甲醇浓度分别由30％和50％等浓度冲洗，收集后即可得到纯化的所述倍半萜类化合物。
二、提取物的相对结构鉴定
对上述步骤中所得到的倍半萜类化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
式(I)化合物，无色油状物；[α]25 D-14.4(c0.11,CHCl3)；IR(neat)νmax3450,3371,2965,1381,1162,1024,920,724cm-1；HR-ESIMSm/z297.2131[M+Na]+(calcd.forC15H30O4Na,297.2154)；1HNMR(600MHz，DMSO-d6)和13CNMR(100MHz，DMSO-d6)数据见如下表1。
表1：式(I)化合物的NMR数据(600/125MHz，DMSO-d6，TMS为内标，JinHz,δinppm)
Position δH(JinHz) δC 1H,1H-COSY HMBC
2 73.0
3 1.63,1H(m) 54.2 H-4,H-7 C-2,C-4
4 1.62,1.45,2H(m) 24.0 H-3,H-5
5 1.50,1.36,2H(m) 39.9 H-4
6 79.1
7 1.47,1H(m) 43.8 H-3,H-8
8 0.90,3H(d),J＝6.8 15.1 H-7 C-3,C-6,C-7,C-9
9 1.10,3H(s) 26.3 C-5,C-6,C-7
1’ 1.59,1.20,2H(m) 38.2 H-2’
2’ 1.58,1.06,2H(m) 25.4 H-1’,H-3’ C-1’,C-2
3’ 3.00,1H(dt),J＝5.2,6.4 78.5 H-2’,OH-3’ C-2’,C-4’
4’ 71.7
5’ 0.97,3H(s) 24.8 C-3’,C-4’,C-5’
6’ 1.03,3H(s) 26.2 C-3’,C-4’,C-5’
7’ 0.99,3H(s) 24.8 C-2,C-3,C-1’
2-OH 3.76,1H(br.s) C-1’,C-2,C-7’
6-OH 3.78,1H(br.s) C-5,C-6,C-7,C-9
3’-OH 4.20,1H(d),J＝5.2 C-2’,C-3’,C-4’
4’-OH 4.01,1H(br.s) C-3’,C-4’,C-5’,C-6’
根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式(I)所示：
式(I)
式(Ⅱ)化合物，Cyclonerodiol：无色油状物；[α]25 D-5.1(c0.09,CHCl3)；IR(neat)νmax3428,2963,1673,1453,1376,1147,918,884,817cm-1；HR-ESIMSm/z259.1718[M+H2O+H]+(calcd.forC15H31O3,259.1698)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6和CDCl3)和13CNMR(100MHz，DMSO-d6和CDCl3)数据见如下表2。
表2式(Ⅱ)化合物的NMR数据(400/100MHz，DMSO-d6和CDCl3，TMS为内标，JinHz,δinppm)
根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式(Ⅱ)所示：
式(Ⅱ)
式(Ⅲ)化合物，Epicyclonerodioloxide:无色油状物；[α]25 D-12.5(c0.08,acetone)；IR(neat)νmax3425,2966,2874,1456,1371,1124,1054,885cm-1；HR-ESIMSm/z279.1930[M+Na]+(calcd.forC15H28O3Na,279.1936)；1HNMR(400MHz，CDCl3)和13CNMR(100MHz，CDCl3)数据见如下表3。
表3式(Ⅲ)化合物的NMR数据(400/100MHz，DMSO-d6和CDCl3，TMS为内标，JinHz,δinppm)
根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式(Ⅲ)所示：
式(Ⅲ)
实施例2：对实施例1所得到的3个倍半萜类化合物的抗Aβ聚集活性的筛选实验。
抗Aβ多肽聚集活性可以采用ThT方法测定，即采用硫磺素T(ThT)嵌入Aβ42多肽的β-折叠片层中，后者受到激发产生荧光，可用于定量检测Aβ42多肽的聚集状态。利用此模型可直接筛选抗Aβ42蛋白聚集的活性物质，并比较其活性大小。将0.5mg冻干的Aβ42多肽溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，4℃震荡过夜。氮气吹干后，将多肽重新溶解于DMSO中使其浓度达到200mol/L，超声15min，制成原液。在96孔板上加入含有20mol/L硫磺素T的180L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)，加入20LAβ42原液，最后加入样品。将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)做为阳性对照，用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发射波长为485nm。根据以下公式计算每一个样品的相对抑制活性(Vi)：Vi(％)＝100-[(Fi-Fb)/Fo]×100，其中Fi为加入样品后的荧光强度，Fb为样品本身在此测定条件下的荧光强度(无Aβ42多肽)，Fo为未加入样品时Aβ42自发聚集的荧光强度。3个倍半萜类化合物所测结果见表4，表明在此浓度下，式(Ⅱ)化合物具有很强抗Aβ多肽聚集活性，式(I)和式(Ⅲ)化合物有较强的抗Aβ多肽聚集活性。
表4式(Ⅰ)至式(Ⅲ)化合物的抗Aβ42聚集活性结果(ThT模型)
样品 相对抑制活性(％)(100uM)
EGCG 72.02士1.56
式(Ⅰ)化合物 32.71士10.49
式(Ⅱ)化合物 56.69士8.08
式(Ⅲ)化合物 36.53士1.99
备注：ThT模型中相对抑制活性接近60％的化合物具高活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种真菌培养物的提取物，其特征在于，所述提取物为倍半萜类化合物；所述倍半萜类化合物包括以下化合物，化合物的结构式如下所示：
2.如权利要求2所述的真菌培养物的提取物，其特征在于，所述倍半萜类化合物还包括以下化合物中的一种或两种，化合物的结构式如下所示：
3.如权利要求1～2任意一项所述的一种真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将真菌Trichodermasp.接种到种子培养基中，获得种子培养液；
(2)按接种量将种子培养液接种到大米固体培养基中，室温静置培养40～50天，获得发酵培养液；
(3)将上述发酵培养液用乙酸乙酯萃取，获得萃取液，经浓缩、分离获得真菌Trichodermasp.培养物的无色油状提取物。
4.如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述萃取液浓缩、分离的过程为：将萃取液在低于50℃下减压浓缩得发酵液浸膏；将发酵液浸膏经硅胶柱层析分离、反向硅胶柱层析分离、反向HPLC分离纯化，获得真菌Trichodermasp.培养物的提取物。
5.如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的成分，按照重量百分比计，包括：葡萄糖1.9～2.1％，蛋白胨0.9～1.1％，酵母提取物0.4～0.6％，海盐2～4％，其余为去离子水。
6.如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述大米固体培养基的成分包括海盐、去离子水和大米；所述海盐、去离子水、大米的质量比为7～8:240～260:140～160。
7.如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述接种量为每1mL种子培养液对应28～32g大米培养基。
8.如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述萃取过程具体为：按比例向发酵提取液中添加乙酸乙酯，所述乙酸乙酯与发酵提取液的体积比为70～90:5。
9.如权利要求1～2任意一项所述的一种真菌培养物的提取物的应用，其特征在于，所述提取物用于制备抗Aβ42聚集活性的制剂。
10.如权利要求9所述的真菌培养物的提取物的应用，其特征在于，所述提取物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
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