KR900004437B1 - 식물배양에 있어서의 2차 대사산물 생산의 유도방법 및 그 수단 - Google Patents

식물배양에 있어서의 2차 대사산물 생산의 유도방법 및 그 수단 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
식물배양에 있어서의 2차 대사산물 생산의 유도방법 및 그 수단
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 식물유래의 2차 대사산물에 관한 것이며, 더 상세히는 이들의 대사산물을 생산하기 위한 식물세포를 유도하는 방법 및 수단에 관한 것이다.
[배경기술]
식물에 의해서 생산되는 많은 화학물질이 그들이 세포 기능에 필수적이기 때문에 1차 대사산물로서 분류되어 있다. 1차 대사산물은 식물대사산물은 식물집단중에 보편적으로 존재하고 식물에 의해서 생산되는 화학물질의 대부분을 구성하지만 다른 화합물은 2차 대사산물로서 분류되고 그들의 여러가지 용도때문에 과학적 연구 및 상업적 이용의 양자의 초점이 되어 있다.
어떤 경우들에 있어서 2차 대사산물은 예를들면 미생물 감염, UV조사, 기계적 손상에 의해서 또한 유기물질 및 무기물질에 의한 처리에 의해서 유도되는 스트레스에 응답하여 몇몇 식물들에 의해서 생산된다. 이와같은 스트레스 조건하에서 생산되는 2차 대사산물의 다양성은 광범위하고 알카로이드류, 테르페노이드류, 프레보노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 그리코사이드류를 포함한다. 더 중요한 의약으로서 유용한 2차 대사산물로는 알카로이드류, 스테로이드 홀몬류, 강심배당화 및 항생물질류가 있고, 이중 인돌알카로이드류가 특히 흥미있다. 알카로이드는 많은 화합물을 포함하고 그중에 적어도 몇가지는 의약적 가치를 갖는 것으로 알려져 있다. 예를들면 인돌알카로이드인 아지말리신은 항고혈압제/정신안정제로서 기능하는것으로 알려져 있다. 또 빈그리스틴 및 빈브라스틴은 암의 치료에 허용된다. 빈브라스틴 및 빈그리스틴의 양자의 전구체인 카사란틴도 역시 2차 대사산물로서 생산된다. 그리고 그들 화합물의 제조에 있어서의 출발재료로서 가치가 있는 것이다.
그러나 모든 2차 대사산물이 모든 식물에 의해서 대량으로 생산되는 것은 아니다. 대사산물의 종류는 식물의 종류에 크게 의존된다. 예를들면 몇가지의 인돌 알카로이드는 가장 일반적인 카사란사스 로제우스(마다 가스칼페리우잉클(madagascar pe-riwinkle) 빈가로제아(vinca rosea) 및 로크네라 로제아(lochnera reosea)라고도 알려져 있다)로부터 추출된다. 또 몰피난(morphinan)알카로이드, 예를들면 몰핀 및 코데인은 양귀비(파파벨 솜니페룸(papavel somniferum))로부터 추출된다. 그리고 신코나(cinchona) 알카로이드 예를들면 키닌(quinine) 및 관련되는 키노린 알카로이드는 신코나 석시루브라(cinchona succirubra) 및 유연종으로부터 유래된다. 명백한 바와같이 2차 대사산물이 유래될 식물은 이 대사산물을 유전적으로 나타낼 수 있어야 하며 그리고 이 대사산물의 합성을 하는데 특정의 대사자극물질에 대해서 감수성이어야 한다.
현재 2차 대사산물은 본래의 식물로부터 추출된다. 그러나 가끔 목적으로 하는 대사산물은 통상 저농도로 존재하고 이 사실이 화학적 추출공정을 짜증스럽고 길게 만들고 있고, 이들이 이들의 화합물의 몇가지의 비교적 높은 원가에 반영되고 있다. 예를들면 인돌 알카로이드류는 전형적으로는 건조한 카사란사스로제우스식물중에 존재하고 이 알카로이드류는 이들의 식물로부터 통상 약 0.0003%(건조중량기준)의 농도로 유도된다. 빈크리스틴 및/또는 빈브라스틴을 이들의 식물로부터 추출하는 원가는 이들의 화합물의 판매가격을 약5000불/g (1983)로 상승시키고 키닌 및 코데인은 각각 약 100불/kg 및 650불/kg로 평가된다.
알카로이드를 추출하는 방법의 효율을 개량하는 방법이 고안되어 있으나, 식물조직 배앙의 출현이 유용한 대체기법을 제공했다. 식물조직배양(ptc)법을 사용함으로써 2차 대사산물을 생산하는 식물세포의 능력을 조작하고 그러므로써 본래의 식물 또는 식물수확물에 기초를 둔 노동력을 요하는 추출공정을 경감시킬 수 있다.
식물조직 배양은 배양물 전체에 영양을 순환시킬 필요성과 식물세포의 붕괴되기 쉬운 것 사이의 균형을 달성하는 정도의 교반을 행하고 영양배지중에 보유되는 식물세포의 집단의 증식을 수반한다. 그러나 모든 식물이 이 방법에 대해서 순종되는 것은 아니며 또 배지조건도 이 방법의 성공에 있어서의 중요한 인자이다. ptc기법의 이점은 명확한 환경, 영양조건등의 증식조건에 대해서 제어를 실시할 수 있는 점에 있다. 또 배양액내에 자극물질을 순환시킬 수 있는 능력은 자극물질을 카루스(callus)에 적용시킴으로써 가장 외측의 세포만이 효과를 얻는 것에 비해서 자극물이 더 많은 수의 세포 또는 세포 덩어리에 접촉하도록 한다.
ptc를 사용하여 소망하는 2차 대사산물에 생산하도록 몇가지 식물종을 유도하는 가능성이 연구되고 있다. 예를들면 "phytochemistry" Vo1. 20, No. 8, pp. 1841-1843(1981) lee등은 어느 종의 인돌 알카로이드를 생산하는 C. 로제우스 배양물의 능력에 대한 2-디에틸아미노에틸-2, 4-디크로로페닐에테르를 포함하는 특정한 아민의 효과를 개시하고 있다. 아지마리신(ajmalicine) 및 카사란틴(catharanthine)의 생산의 증가가 주목되었다. 그러나 알카로이드 유도제로 사용되는 5종류의 밀접하게 관련되는 화학물질중 3종류만이 뜻있는 유용성을 나타낸 것에 주목하는 것이 유의되는 일이다. 이들의 밀접한 구조의 유사성에도 불구하고 5종류의 유도체중 2종류는 실질적으로 무시될 수 있는 결과를 나타냈다. 또 상기의 아민은 5ppm 이하의 농도에서는 양호한 결과를 나타냈으나 더 높은 농도는 증식저해를 일으키고 또한 알카로이드의 합성을 감소시켰다. Planta Medica(1984)에 있어서, Bilert등은 루타그라베오렌스(Rutagraveolens)의 부유배양으로부터의 항미생물 알카로이드인 루타크리돈에폭시드(rutacridone epoxide) 및 하이도록시 루타크리돈에폭시드(hydroxy-rutacridone epoxi-de)의 생산을 유도하는 시도를 개시하고 있다. 생존중의 부유 또는 고정화된 효모의 또는 죽은 로도토루라 루브라(Rhodotorula rubra)의 세포 또는 그 조잡한 세포벽의 프렉숀의 현탁액의 첨가에 의해서 이들은 관심의 항미생물 화합물의 생산의 증가를 나타내고, 키토산(chltosan) 및 알긴산(alginate)은 다른 계에 있어서는 유도제로서 유용함이 입증되어 있으나 어느 것이나 목적하는 응답을 유도할 수 없었다는 결과가 주목된다.
Plant CeI1 Physio1ogy 26 : 1101-1110(1985)에 있어서 핫도리 및 오오다 는 특히 바나딘산 나토륨(Sodium Vanadate) (Na3VO4)의 존재하에서 레드빈(Red bean) (빈가 앵규라리스 (Vinga angularis))의 부유배양물을 증식시키는 실험의 결과를 개시하고 있다. 그들은 바나딘 산화물이 이소프라본그루코시드(isoflavone glucoside), 디아드제인 디그루코시드(diazein diglucoside)의 생산을 증강할 수 있음을 나타낸 결과를 나타내고 있다. 그러나 다른 화합물은 목적하는 결과를 만들지 못하고 더우기 또다른 것은 2차 대사산물의 생산에 억제효과를 나타냈다.
따라서 여러가지 식물종과 조합시켜서 다수의 유도제가 연구되어 있으나 이들의 결과는 현재로서는 활성의 어떤 패턴도 예측할 수 없다는 결론을 나타내고 있다. 이것은 한정적인 것은 아니지만, C. 로제우스가 인돌 알카로이드를 생산하도록 유도되는 계에 있어서 특히 명백한 것이다.
[발명의 개시]
본 발명의 목적은 적당한 식물세포에 의한 2차 대사산물의 생산을 유도할 수 있는 물질을 가려내어 정하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물의 세포에 의한 2차 대사산물의 생산을 증강시킬 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 식물세포로부터의 2차 대사산물의 생산을 유도하고 난 다음에 회수하는 방법을 제공하는데 있다. 배양 현탁물에 첨가된 경우에 배양된 식물세포중에서의 2차 대사산물의 합성을 유도하는데 충분한 침투압을 가져오는 화합물은 본 발명의 범위내에 있다. 여러가지 침투압에 의해서 야기되는 스트레스는 합성의 증가에 기여한다고 믿어진다.
침투압 스트레스를 일으키기 위하여 식물세포 현탁물에 첨가되는 화합물은 매우 광범위한 화합물로부터 선택될 수 있다. 일반적으로 이들의 화합물은 이온성 스트레스 유도화합물 및 유기스트례스 유도화합물로서 분류된다. 어느 경우에도 보유액으로의 이들의 첨가의 최종결과는 세포와 주위배지간의 침투압스트레스의 발생이다.
이온성 스트레스 유도제는 바람직하기로는 용액중에서 이온화할 수 있는 할로겐염이다. 더욱 바람직하기로는 이들의 염이 주기율표에 있어서의 I족 또는 Ⅱ족의 할로겐염이다.
가라크티늘(galactinol), 키시리톨(xylitol), 그리세롤(glycero1), 만니톨(mannito1) 및 이노시톨(inositol)과 그 여러가지 유도체가 포함되고 이들로서는 포스파티elf이노시롤(phosphatidylinosito1), 피틴산(phyticacid) 및 그 에스테르, 실리톨(scyllito), 피톨(phyto1), 알돈산(aldonic acid), 알달산(aldaricacid), 우론산(uronic acid) 그리고 특히 솔비톨(sorbito1)이 포함된다. 솔비톨은 특히 2차 대사산물의 의미있는 수율을 유도하고 그러므로 바람직한 것이다.
또 침투압 스트레스에 의한 것이 아닌 수단에 의해서 2차 대사산물을 유도하기 위하여 작용되는 화합물도 본 발명의 범위내에 있다. 본 발명의 이 관점은 여러가지 식물 생장조절 화합물 및 화학구조에 있어서 또는생화학기능에 있어서 관련화합물의 임의의 하나 또는 조합이 보충된 부유액중에서 식물세포를 배양하는 것을 포함하여 이루어진다. 아브시신산(abscissic acid; ABA)가 특히 유용한 것이지만 사용될 수 있는 다른 관련화합물로는 항 지베레린(Anti-gibberellin) 화합물, 예를들면 2'-이소프로필-4'-(트리메틸암모늄크로라이드)-5'-에틸페닐 피페리딘 카복시레이트, β-크로로에틸트리메틸 암모늄 크로라이드 및 트리브틸-2,4-디크로로벤질프스프크로라이드가 포함된다. 본 발명에 있어서 유용한 다른 ABA-관련 화합물로는 N-(디메틸아미노) 계피산(succinamic acid), 4'-디하이드로파세인산(4'-dihydropaseic acid), 파세인산 및 루누라린산(lunularic acid)이 포함된다.
따라서 본 발명의 하나의 관점에서 식물세포에 침투압적으로 스트레스를 주는 것을 포함하여 이루어진다. 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점은 식물 생장조절 화합물 또는 관련되는 그와같은 화합물의 존재하에 상기의 세포를 증식시키는 것을 포함하여 이루어지는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 생산을 유도하는 방법을 구성한다. 바람직하기로는 식물세포는 조절제가 보충된 부유액중에서 배양된다.
본 발명에 의한 조건하에서 식물세포를 배양한 후에 생화학 추출분야에 있어서 오늘날 확립되어 있는 화학적 수순을 사용하여 목적하는 하나 또는 복수의 대사산물을 회수할 수 있다.
몇가지 대사산물은 식물세포에 의해서 증식배지에 분비되므로 이들의 대사산물은 원심분리 및 여과와 같은 통상 사용하는 기술을 사용하여 세포를 농축시킴으로써 세포자체로부터 간단하게 분리할 수 있다. 다음에 대사산물을 함유하는 액은 투석과 같은 기법에 의해서 대사산물을 더욱 농축시키기 위하여 처리할 수 있다. 또는 표준적 화학적 추출기법을 직접 사용한 후에 작용시킬 수 있다. 목적하는 대사산물이 식물세포에 의해서 나타내지지만 그것으로부터 분비되지 않을경우, 예를들면 대기압 또는 침투압이 상승된 압력을 사용하여 식물세포를 파괴하고 또는 파쇄한다. 다음에 대사산물을 적당한 용제중에 추출할 수 있어 목적하는 2차 대사산물의 화학적 추출에 앞서서 상기의 수순을 사용하여 어느정도 농축시킬 수 있다. 사용될 특정의 화학적 추출수순은 회수되어야 할 대사산물의 화학적 성질에 의존읠 것이다. 단, 일반적으로 이와같은 수순은 용제, PH 등의 축차적 변화를 포함하고 또 당업자에 의해서 잘 알려져 있다.
따라시 본 발명의 제 2 의 관점은 본 발명의 유도방법에 의해서 생산된 화합물을 회수하는 것을 포함하여 이루어지는 식물세포 유래 2차 대사산물을 제공하는 방법을 구성하는 것이다.
본 발명의 방법 및 유도제를 사용하여 식물세포 배양계중에서 생산되는 2차 대사산물중에 세코로가닌(secoIoganin) 및 트리프토판(tryptophan)-유래 스트리크토시딘(strictosldin), 아지마리신, 요힘빈(yohimbin), 타벨소닌(tabersonine), 빈도린(vindoline) 및 카사란틴과 트리프타민을 포함하는 카사란시스 로제우스(catharanthis roseus)로부터 얻어지는 인돌알카로이드, 파파벨 솜니페룸(papaver somnlfer-um)으로부터의 티로신-유래몰핀 및 코데인, 파스페세포(parsley cell) 배양으로부터의 구마린(coumarine)과 같은 페날아라닌-유래화학물질 및 디기타리스 푸르푸레아(Digitalis purpurea) 또는 D 라나타.(D.lanata)로부터의 사포닌ㅡ(saponins)과 같은 메바론산-유래 화학물질, 예를들면 디기타리스(digitalis)를 예시할 수 있다.
이 예들은 배타적인 것으로 제출되는 것은 아니다. 다른 2차 대사산물의 생산이 그들이 상태적인 식물세포중에서 유도될 수 있는 것으로 안다. 본 발명은 바람직한 관점에 었어서 C. 로제우스 유래의 인돌 알카로이드인 카사란틴, 아지마리신, 타벨소닌 및 빈도린에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 유도물질 아브시신산은 다음 구조식을 갖는다.
Figure kpo00001
아브시신산은 탈리촉진(abscission-accelerating) 식물 홀몬, 즉 식물부분의 분리, 예를들면 가을철에 있어서의 줄기로부터의 잎사귀의 분리를 촉진하는 홀몬이다. 이것은 그 화학명칭이 5-(하이도록시-2,6,6-트리메틸-4-옥소-2-시크로헥센-1-일)-3-메틸-2,4-펜타디엔산인 도르민(dormim)으로 알려져 있는 상업적으로 입수가능한 상품이다. 이 약제의 합성형 및 여러가지의 시스트란스(cis-trans)이성체도 역시 상업적으로 입수가능하고 본 발명에 사용할 수 있는 것이다.
상술한 바와같이 식물세포의 배양기법은 알려져 있으며, 바람직하게 본 발명에 있어서 사용된다. 따라서, 통상 사용하는 방법이 사용된다. 이 방법에 있어서는 살아있는 식물재료, 예를들면 잎사귀재료, 줄기재료 또는 분열조직이 오염방지를 위하여 표면살균이 되고, 개개의 세포 또는 세포군의 작은 덩어리가 그들이 적당한 액체영양으로 옮겨지기까지 증식 프레이트(growth plate)중의 한천영양기상에서 배양된다. 현탁액이 배양프라스크중에서 연속적으로 교반되고, 그리고 최후에 바이오리액터로 옮겨진다. 교반은 "에어리프트"법에 의해서 적절히 달성되고 이 방법에서는 상승하는 기포의 온화한 작용에 의해서 혼합된다.
유도제를 배양에 첨가하기 때문에, 필요에 따라서 유도물질의 용액을 사전에 적절히 조제하고 중식유지배지 중의 이 물질의 균일성을 증감한다. 예를들면 첨가에 앞서서 본 발명의 모든 물질을 물과 혼합시킬 수있다. 아브시신산(abscisic acid)은 물 및 KOH와 같은 염기 몇 방울과 혼합하여 필요하면 용해를 도울 수 있다.
흔적량 또는 저레벨의 목적하는 2차 대사산물은 본 발명의 유도제의 부재하에 배양된 식물세포에 의해서 일반적으로 생성되겠지만 낮은 수율은 이미 알려져 있는 방법에 비교하여 개량된 추출수율을 가능토록 하지 않는다. 또 유도제의 부재하에서는 이들의 대사산물의 생산을 위하여 필요로 하는 시간은 비교적 길고, 30일까지 또는 45일이기도 한다. 이것에 대해서 본 발명의 유도제의 존재하에서의 식물세포의 배양은 생산 또는 2차 대사산물의 량을 증가시키고 그리고 그 특정량을 얻기 위하여 필요로 하는 시간을 의미있게 단축할 수 있다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
식물세포의 다양한 종들이 목적하는 2차 대사산물 발생시에 적용되지만 본 발명의 호적실시예가 인도릭알카로이드들이 카사란사스 로제우스에 의해서 생성되는 방법을 제공한다. 배양세포가 유래되는 C. 로제우스계는 명백하게 식물조직 배양을 하지 않으면 안된다. 이와같은 계를 얻는 것은 당업자간에서 잘 알려져 있으며 몇가지의 이와같은 계가 헌재 존재한다고 믿어진다. 이것은 그 세포배양 환경내에서 견디고 또한 기능하는 능력을 갖는 식물을 제공할 필요성을 줄이는 것은 아니다. 이 능력을 부여하는 특징은 당업계에서 잘 정의되어 있지 않다. 식물조직배양이 가능한 세포의 존재는 거의 시행착오법(Trial and Error Approach)에 의해서만 확인된다. 따라서, 이후 본 발명을 예시하기 위하여 본 발명자에 의해서 주어진 명칭을 갖는 특정의 셀라인이 사용되지만 본 발명의 범위는 범위는 이들의 특정한 식물계에 한정되는 것은 아님을 인식해야 할 것이다. 현재 존재하거나 또는 용이하게 창제되고 시험될 수 있는 형의 다른 계가 이 명세서에 있어 보고하는 것과 동일의 일반적 효율을 가지고 기능할 것이다. 본 발명에 있어서 바람직한 C. 로제우스계는 JWM, JOH는 Plant Biotechnology Institute, Saskatoon, Sasketchewan, 카나다에서 개발되었다. 계lBB-1은 AIlelix Inc. Mississauga Ontario 카나다에서 개발되었다. 모든 계는 원래 C. 로제우스의 약(anthers)으로부터 분리된 것이다.
C. 로제우스는 모든 필요한 대사산물을 함유하는 임의의 액체배지중에서 배양시킬 수 있으며, 그 예로는 SH배지, lS배지 및 MS배지가 포함되고 이 모두가 당 업계에 알려져 있다. lS배지(linsmair and Skoog)는 Phys Plantarum(l8)1964, pp. 100-127에 그 성분에 의해서 기재되어 있다. 본 발명에 있어서 사용하기 위하여 바람직한 SH배지(Shenck-Hilderbrandt)의 성분은 Can. J. Bot. 50; 195-204(1972)에 기재되어 있다. 본 발명에서 바람직한 배지인 MS배지(Murashige and Skoog)의 성분은 당 업자에 잘 알려져 있다. 이 배지에 슈크로즈(sucrose)또는 라크토스(lactose)와 같은 탄소원이 첨가된다. 3% 또는 4%의 슈크로즈의 첨가가 바람직하지만 유사농도의 라크토스를 사용할 수도 있다. SH배지에 첨가되는 유일한 증식조절제는 2mg/ℓ의 농도의 α-나프타렌 초산이다. 이 배지는 또 세포분열에 있어서 기능하는 합성 사이트카이닌(synthetic cytokinin)인 카이네틴(kinetin) (6-플프릴 이미노프린(6-furfurylaminopurine))을 함유시키는 것이 적당하다.
식물세포는 선택된 유도제 조제물의 유도효과에 대해서 그들이 한층 더 감수성이라고 예상되는 직선증식기 또는 초기정상증식기에 집단으로 도달되도록까지 스트레스를 감소시키고 빛에 의해서 유도되는 2차대사경로(예를들면 색소의 형성)로부터 영양을 채널링시키기 위하여 암소에서 또는 바람직하기로는 빛속에서 증식시킨다. 즉, C. 로제우스 세포 현탁액을 유도제의 부재하에 바람직하기로는 3-10일간 더욱 바람직하기로는 4-6일간 시험된 조건하에서 증식시킨다. 고호되는 증식조건이 사용될 경우 직선증식기 또는 초기정상기의 개시를 특정시키기 위하여 세포집단을 감시할 수 있다. 또 유도는 후기대수기 및 다른 증식기에 있어서의 첨가에 의해서 증식될 수 있으므로 유도제를 첨가하기 전에 직선기 또는 초기정상기에 도달하는 것은 절대적으로 필수의 것은 아닌 것을 이해할 수 있을 것이다. 알카로이드의 수율을 최대로 하기 위해서는 되도록 큰 세포집단을 유지하는 것이 소망된다.
C. 로제우스의 부유액이 소망하는 증식기에 도달한 후에 배양액중의 소망하는 농도를 달성하는데 충분한 양으로 유도물질을 도입시킨다.
본 발명에서 바람직한 유도물질은 이온성 침투압 스트레스 유도제로서의 NaC1, KCI 및 FeCl3; 유기침투압 스트레스 유도제로서의 쏠비톨 및 식물생장 조절 유도제로서 아브시진산(ABA)이다.
사용하려고 선택될 경우 NaCl 또는 KCI의 죄종배지농도는 최저의 바람직한 레벨로 약 0.lM이 적당하다. 더 낮은 레벨은 유도목적의 역할은 하지만 더 높은 농도에 의해서 얻어지는 단축된 시간내에 증강된 수확량을 가져오지 않는것 같다. NaCl 또는 KCl의 허용상방 농도레벨은 그 존재가 배양된 세포내에서 발생시키는 침투압에 의해서 지정된다. 즉, 다시말하면 고농도로 단시간 처리하여도 높은 수확량은 얻어지지 않는다. 따라서 상한은 원형 질 분리를 생기게 하는 농도보다 약간 낮은 것이다. 더 바람직하게는 NaCl 및 KCl은 0.01M-1.0M, 그리고 이상적으로는 약 0.5M의 배양농도를 달성하도록 첨가된다.
염화 제 2 철은 10-50ppm, 바람직하게로는 20-200ppm, 그리고 이상적으로는 약 50ppm의 최종농도를 달성하도록 부유배지에 첨가하는 것이 적당하다.
솔비톨의 배지농도는 NaCl 또는 KCl의 첨가에 관해서 검토한 것과 같이 약 0 .05M부터 원형질 분리가 생기는 농도보다 약간 낮은 최고농도까지이다. 바람직한 배지농도는 0.lM-0.5M의 범위이며, 그리고 이상적으로는 약 0.2M이다.
후기하는 실험조건하에서 아브시진산의 이상적인 농도는 현탁액 60㎖당 0. 1mg-0.5mg의 범위이다. 유도응답은 바림직하지 않게 낮지만 0.0lmg 이라는 낮은 농도를 사용할 수 있다. 0.5mg/60㎖에서 볼 수 있는 효과의 증강은 거의 없는 것 같지만 0.5mg/60㎖보다 농도를 사용 할 수도 있다.
어떤 유도제의 첨가후에 C. 로제우스의 세포를 일정시간 배양하여 유도제가 세포와 접촉하여 인돌알카로이드의 생산을 자극하도록 한다. 2-5일간의 기간이 바람직하다. 단, 특별히 조건이 이 명세서에 기재된 것과 같지 않을 경우 이 바람직한 기간의 변경이 허용된다. 배양물의 증식은 바람직하기로는 암소에서 또는 빛속에서 계속된다.
배양기간후에 세포를 회수하고 통상의 기법을 사용하여 알카로이드를 추출한다. 특정한 기법은 회수될 특정의 물질에 의존되지만 이 모든것은 당업계에서 표준적인 것이다.
다음 실시예들에 의해서 본 발명의 구체적인 태양을 개시하겠다. 이들의 예에서,60㎖의 세포현탁 배양물을 3W/V% 슈크로스, 2mg/l의 α-나프타렌산 및 0.1mg의 카이네틴을 함유하는 기본 MS증식배지로 유지시킨다. 배양들을 조사된 로터리 세이카(120rpm)상의 250㎖ 에르렌마이야 프라스크(Erlen meyerflask)에 유지시켜 1 : 5 희석에 의해서 1주간마다 계대배양(subculture)한다. 아브시진산 및 D-솔비톨은 시그마사로부터 입수하고 그리고 NaCl, KCl 및 FeCl3은 핏샤 사이엔티픽사로부터 구했다. 모든 유도제는 증류수에 용해한 스톡용액으로서 조제하고 그 농도는 1㎖의 스톡용액을 세포현탁 배양물에 첨가한 경우에 소망의 최종농도를 얻어지도록 하였다.
별도기재가 없는 한 각 유도제는 세포현탁액에 증식사이클의 5일간에 무균여과용액으로서 첨가하고 그리고 세포를 3일후에 회수했다. 세포로부터 인돌알카로이드를 추출하기 위하여 표준적 추출법을 사용했다. 카사란틴 및 아디마리산의 수확량은 HPlC분석에 의해서 정량되었다. 다른 알카로이드의 존재는 TlC분리후에 황산씨리움암모늄에 의해서 가시화함으로써 정상적으로 결장했다.
[예1 ABA에 의한 유도]
99% 순도의 합성 아브시진산을 0.1-2.0mg/60㎖ 배양들의 농도범위로 도입시켰다. 얻어진 결과를 제 1 표-제 4 표에 나타냈다. 제 1 표는 세포계 JOH에 적용시킬 경우에 유도과정에 대해서 ABA의 타입 및 농도가 갖는 효과를 나타냈다. 99% 순도의 (±) 시스트랜스 합성이성체가 탁월한 결과를 나타냈지만 ABA의모든 형이 바람직한 유도성을 나타냈다.
[표 1]
Figure kpo00002
제 2 표는 계 JWM*에 대한 유도응답의 ABA농도의 효과를 나타냈다. 0.5mg/60㎖의 배양물에 있어서 최대응답이 생기고 농도의 증가에 수반되는 변화는 근소한 것이 주목될 것이다.
[표 2]
Figure kpo00003
하기의 제 3 표에 있어서 세포연령과 ABA로의 노출의 관계를 나타냈다. 3일이상의 배양증식이 최량의 효과를 가져오고, 아지마라신의 농도는 그후 저하됨이 주목될 것이다. 그러나 카사란틴 수확량은 배양증식의 6일째에도 상승을 계속했다. 제 3 표의 결과는 세포계 JOH 및 4일의 유도기간에 의한 것이다.
[표 3]
Figure kpo00004
하기의 제 4 표는 1mg의 ABA에 의한 유도에 대한 여러가지 셀라인의 응답을 나타낸다. 각 셀라인은 전기한 바와같이, Allelix lnc 또는 Plant Bio1ogy Institute (Saskatoon)으로부터 입수할 수 있다. 모든 것이 C. 로제우스에 유래한다. 이들의 결과에서 계 JOH 및 lBE-1이 바람직한 것이 명백해질 것이다.
[표 4]
Figure kpo00005
래그유도기에 있다고 생각되는 단지 1일의 증식후에도 식물세포는 ABA로의 노출에 대해서 알키로이드의 생산의 증가에 의해서 정으로 응답되는 것이 관찰되었다. 그러나 알카로이드의 축적은 어느정도 바이오마스에 관련되므로 바이오마스의 어느정도의 증가후에 세포를 유도하는 것이 바람직하다.
[예 NaCl에 의한 유도]
염화나트륨 농도의 범위(0.1-1.0g/60㎖ 프라스크)를 하기 제 5 표의 계 JOH에 있어서의 알카로이드의 축적에 대한 그들의 효과에 관해서 시험했다. 고농도의 NaCl는 바이오마스를 감소시키고 따라서 알카로이드의 수확량을 감소시키고 한편 바이오마스에 대한 한층낮은 농도의 효과는 카사란틴 생산의 촉진에 의해서 상쇄된다.
[표 5]
Figure kpo00006
[예3 염화카리움에 의한 유도]
계 JOH의 세포에 0.1 또는 0.2g의 KCl를 첨가시켰다. 알카로이드의 수확량에 대한 효과를 제 6 표에 나타냈다.
[표 6]
Figure kpo00007
[예4 염화 제 2 철에 의한 유도]
알카로이드의 축적에 대한 3mg/l의 FeCl3의 효과를 제 7 표에 나타냈다.
[표 7]
Figure kpo00008
[예5 솔비톨에 의한 유도]
솔비톨농도의 범위를 알카로이드의 축적에 대한 그들의 효과에 관해서 시험했다(최종농도 0.1-0.5M : 1.1-5.5g/60㎖ 배양물) 계 JOH에 대한 그들의 효과를 아래 제 8 표에 나타냈다.
[표 8]
Figure kpo00009
Figure kpo00010
본 발명에 의해서 세포배양물을 유도함으로써 얻어지는 주된 이점은 알카로이드(특히 카사란틴)의 수확량이 단 8일간에 비유도세포라면 달성하는데 매우 장시간이 걸리는 레벨에 도달될 수 있어 시간 및 원가의 양쪽이 매우 절약되는 것이다.
알카로이드의 생산을 스케일엎시키기 위하여 근소한 변경이 요구될 뿐이다. 예를들면 MS배지는 1mg/ℓ의 α-나프타렌 초산 및 0.lmg/ℓ의 키이네틴과 함께 소스케일에서는 3% 용액이 사용되는데 대해서 4%(W/V)슈크로스에 의해서 호적하게 강화된다. 모든 세포계 및 화학물질은 같은 그대로였다.
[예6 대규모의 유도 프로세스]
ABA를 사용하는 30l배치를 위하여 바람직하기로는 최종 배양액중 8.33mg/ℓ가 되도록 용액이 조정된다. 1ℓ의 증류수중에 용액을 조제하여 무균여과하고 그리고 무균병부터 발효조에 주입시킨다. NaCl의 용액을 1ℓ의 증류수중에 조제하여 배양물중의 최종농도가 33.33g/ℓ가 되도록 한다. 용액을 무균여과하고 무균병부터 배양물에 가한다.
유도는 통상 배양기간의 5-7일째에 행한다. 그리고, 7일까지 계속할 수 있다. 검출법은 소규모연구의 그것과 같다.
[표 9]
Figure kpo00011
[표 10]
Figure kpo00012
Figure kpo00013
[표 11]
Figure kpo00014

Claims (19)

  1. 세포를 침투압적으로 스트레스하는 것을 포함하여 되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 현탁배양되고 그리고 상기 침투압이 이 현탁배양물에 침투압 스트레스량의 화합물을 첨가함으로써 생기는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 카사란사스로제우스(Catharanthus Roseus)의 세포인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물이 이온적으로 침투압 스트레스를 생기게 하는 화합물 및 침투압 스트레스를 생기게 하는 유기화합물로부터 선택되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물이 할로겐염인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물이 제 I 족 또는 제 Ⅱ 족 원소의 할로겐염인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물이 KCl, NaCl 및 FeCl3로부터 선택되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물이 당산 또는 당알콜인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 화합물이 만니톨, 키시리톨 및 솔비톨로부터 선택되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물질이 솔비톨인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  11. 식물 생장조절물질의 존재하에 세포를 증식시키는 것을 포함하여 되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 식물세포를 상기 식물 생장조절물질이 보충된 현탁배양물중에시 증식시키는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 식물 생장조절물질이 항디베레린화합물 및 아브시진산으로부터 선택되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 식물 생장조절물질이 아브시진산인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 식물세포가 카사란사스 로제우스의 세포인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  16. 제 3 항에 있어서, 상기 식물세포로부터 인돌알카로이드를 추출하는 단계를 더 포함하여 되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 알카로이드가 카사란틴 및 아지마리신인 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 식물세포로부터 인돌알카로이드를 추출하는 단계를 더 포함하여 되는 식물세포에 의한 2차 대사산물의 합성을 유도하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 추출된 알카로이드가 카사란틴 및 아지마리신인 2차 대사산물의 합성을 유도하는방법.
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