FR2470603A1 - Extraits a activite antimitotique obtenus a partir de nouvelles souches de tissus de catharanthus roseus g. don - Google Patents
Extraits a activite antimitotique obtenus a partir de nouvelles souches de tissus de catharanthus roseus g. don Download PDFInfo
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Abstract
EXTRAITS ANTIMITOTIQUES, EXTRAITS CARACTERISES PAR UNE FORTE ACTIVITE ANTIMITOTIQUE ET UNE FAIBLE TOXICITE, OBTENUS A PARTIR DE TISSUS OU DE MILIEUX OBTENUS PAR CULTURE DE NOUVELLES SOUCHES DE CATHARANTHUS ROSEUS G. DON CULTIVEES IN VITRO.
Description
La présente invention a pour objet les extraits antimitotiques obtenus 5 partir de nouvelles souches de tissus de Catharanthus roseus G. Don cultivées in vitro. Ces extraits sont caractérisés par une forte activité antimitotique associée à une faible toxicité. Les nouvelles souches ont été obtenues par création d'une large population diversifiVe de souches de tissus de
Catharanthus roseus G. Don et sélection des souches actives dans cette population par un criblage approprié.
Catharanthus roseus G. Don et sélection des souches actives dans cette population par un criblage approprié.
I1 est connu que les cultures de tissus de végétaux supérieurs peuvent biosynthétiser des métabolites secondaires identiques ou non à ceux de la plante entière, et en particulier des alcaloïdes.
Les cultures de tissus de Catharanthus roseus G. Don s'inscrivent typiquement dans ce cadre. Certaines souches biosynthétisent par exemple l'ajmalicine et la serpentine (ZENK M.H.and al., in BARZ W, REINHARD E. et ZENK M.H. : "Plant tissue culture and its biotechnological application n Springer-Verlag 1976, p. 27 et BOEHRINGER .XANNHEIM Gmbh, DOS 2,639,876) ; d'autres ont permis de mettre en évidence des composés inconnus jusqu'alors et sans intérêt thérapeutique (PATTERSON B. et CAREW D.
P. ; Lloydia 1969, 32 , p. 131) d'autres encore ont abouti à des extraits ayant des activités thérapeutiques différentes de celle de la plante (KYOWS HAKKA KOGYO, Japon, KOKAI 75 101510 : "Prevention and therapy of Coccidiosis"). Aucune souche de tissus de Catharanthus roseus G. Don biosyntheti- sant des extraits à activité antimitotique n'a été signalée jusqu'ici.
La culture in vitro de tissus de Catharanthus roseus G. Don peut être effectuée selon tout procédé approprié et bien con- nu pour l'homme de lar-6.
Selon l'invention, on a créé une large population diversifiée de souches de Catharnnthus roseus G. Don.
La variabilité a été introduite dans cette population à différents niveaux : - le génotype de la plante, origine des tissus, - le type d'organe utilisé pour initier les cultures de tissus
"in vitro", - les conditions de culture : milieu nutritif, température,
photopériode, périodicité de repiquages, -la conservation des divergencés morphologiques spontanées apparaissant au cours de repiquages successifs.
"in vitro", - les conditions de culture : milieu nutritif, température,
photopériode, périodicité de repiquages, -la conservation des divergencés morphologiques spontanées apparaissant au cours de repiquages successifs.
Selon l'invention, une souche est définie de façon très stricte comme un ensemble de cals homogène et constant en ce qui concerne
<tb> - <SEP> l'origine <SEP> génotypique <SEP> 3 <SEP> <SEP> (clone <SEP> de <SEP> cal <SEP> primaire)
<tb> - <SEP> l'origine <SEP> culturale
<tb> - les conditions de culture - l'aspect morphologique et la pigmentation - la vitesse de croissance et la friabilité - l'absence totale de capacité morohogénétique.
<tb> - <SEP> l'origine <SEP> culturale
<tb> - les conditions de culture - l'aspect morphologique et la pigmentation - la vitesse de croissance et la friabilité - l'absence totale de capacité morohogénétique.
Selon l'invention, on cultive les souches de Catharanthus roseus G. Don selon tout procédé approprié de culture "in vitro", par exemple sur milieu gélosé en suspension dans un milieu liquide, en fiole d'Erlenmeyer agitée, en réacteur, en fermenteur, sous forme immobilisée sur des supports convenables, etc....
D'après les criteres définis ci-dessus, on a obtenu 80 souches différentes dont les extraits ont été soumis à un criblage pour révéler une activité antimitotique éventuelle ; deux se sont alors montrées très actives et ont fait l'objet d'études plus approfondies . Ce sont les souches référencées CR-1 et
CR-2 déposées au laboratoire du Phytotron - C.N.R.S. GI sur 't'V=TTL - 91190 - FRANCS.
CR-2 déposées au laboratoire du Phytotron - C.N.R.S. GI sur 't'V=TTL - 91190 - FRANCS.
L'invention a donc pour objet principal les extraits de cul- tures de tissus obtenus & partir des souches CR-1 et CR-2.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1 Obtention et définition des souches les plus
actives.
actives.
Toutes les souches ont été obtenues et entretenues selon les méthodes classiques (GAUTHERET R.J. "La culture des tissus végétaux" MASSON, 1959).
Chacune d'entre elles a été cultivée sur milieu gélosé et les extraits de cultures ont fait l'objet d'un test de criblage.
Celui-ci est décrit par la suite (Exemple 4).
Les deux souches qui sont apparues les plus actives se definissent comme suit
Souche CR-1
Génotype : Variété ornementale hétérogène Origine culturale : 1 plantule stérile (tige)
Milieu de culture : Milieu semi-solide
Concentration
par litre de milieu
Composition :Macro-éléments minéraux 100 ml/l
(Solution de Murashige et Skoog)
Micro-éléments minéraux 1 ml/l
(Solution de Heller)
Complexe vitaminique B1 2 ml/i
Chlorure ferrique hexahydraté 1 mc/l
Acide naphtyl-1-acétique 1 mg/l
(Furfurylamino)-6 purine i mg/l
Glucose 30 g/l
Gélose 7 g/l
Macro-éléments minéraux (Solution de Murashige et Skoog)
Concentration en mg/l de milieu
Nitrate d'ammonium 1650
Nitrate de potassium 1900
Chlorure de calcium hydraté 440
Sulfate de magnésium heptahydraté 370
Phosphate de potassium 170
Micro-éléments minéraux (Solution de Heller)
Concentration en mg/l de milieu
Sulfate de zinc heptahydraté 1
Acide borique 1
Sulfate de manganèse rtétrahydraté 0,1
Sulfate de cuivre pentahydraté 0,03
Chlorure d'aluminium hexahydraté 0,05
Iodure de potassium 0,01
Chlorure de nickel hexahydraté Q,03
Complexe vitaminique (B1)
Concentration en mg/l de milieu
Panthoténate de calcium 1
Pyridoxine 1
Acide nicotinique 1
Thiamine 1
Méso-inositol 10
Biotine 0,01
Conditions de culture : Température 220C
Eclairement par tube fluorescent
Sylvania Grolux (2500 lux)
Photopériode 16 H/24 H
Périodicité de repiquage : 5 semaines
Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux
Pigmentation : vert clair
Taux de croissance : de tordre de 6 fois
la taille de l'implant initial par cycle
de culture
Friabilité : très friable
Aucun phénomène d'organogénèse
SOUCHE CR-2
Génotype :Variété ornementale hétérogène
Origine culturale : 1 plantule stérile (tige)
Milieu de culture : Milieu semi-solide
Composition identique & celle du milieu utilisé pour la
Souche CR-1.
Souche CR-1
Génotype : Variété ornementale hétérogène Origine culturale : 1 plantule stérile (tige)
Milieu de culture : Milieu semi-solide
Concentration
par litre de milieu
Composition :Macro-éléments minéraux 100 ml/l
(Solution de Murashige et Skoog)
Micro-éléments minéraux 1 ml/l
(Solution de Heller)
Complexe vitaminique B1 2 ml/i
Chlorure ferrique hexahydraté 1 mc/l
Acide naphtyl-1-acétique 1 mg/l
(Furfurylamino)-6 purine i mg/l
Glucose 30 g/l
Gélose 7 g/l
Macro-éléments minéraux (Solution de Murashige et Skoog)
Concentration en mg/l de milieu
Nitrate d'ammonium 1650
Nitrate de potassium 1900
Chlorure de calcium hydraté 440
Sulfate de magnésium heptahydraté 370
Phosphate de potassium 170
Micro-éléments minéraux (Solution de Heller)
Concentration en mg/l de milieu
Sulfate de zinc heptahydraté 1
Acide borique 1
Sulfate de manganèse rtétrahydraté 0,1
Sulfate de cuivre pentahydraté 0,03
Chlorure d'aluminium hexahydraté 0,05
Iodure de potassium 0,01
Chlorure de nickel hexahydraté Q,03
Complexe vitaminique (B1)
Concentration en mg/l de milieu
Panthoténate de calcium 1
Pyridoxine 1
Acide nicotinique 1
Thiamine 1
Méso-inositol 10
Biotine 0,01
Conditions de culture : Température 220C
Eclairement par tube fluorescent
Sylvania Grolux (2500 lux)
Photopériode 16 H/24 H
Périodicité de repiquage : 5 semaines
Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux
Pigmentation : vert clair
Taux de croissance : de tordre de 6 fois
la taille de l'implant initial par cycle
de culture
Friabilité : très friable
Aucun phénomène d'organogénèse
SOUCHE CR-2
Génotype :Variété ornementale hétérogène
Origine culturale : 1 plantule stérile (tige)
Milieu de culture : Milieu semi-solide
Composition identique & celle du milieu utilisé pour la
Souche CR-1.
Conditions de culture : Température 220C
Eclairement par tube fluorescent
Sylvania Grolux (2500 lux)
Photopériode 16 H/ 24 H
Périodicité de repiquage : 5 semaines
Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux
Pigmentation : vert
Taux de croissance : de l'ordre de 12 fois
la taille de l'implant initial par cycle
de culture
Friabilité : très friable
Aucun phénomène d'organogenèse.
Eclairement par tube fluorescent
Sylvania Grolux (2500 lux)
Photopériode 16 H/ 24 H
Périodicité de repiquage : 5 semaines
Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux
Pigmentation : vert
Taux de croissance : de l'ordre de 12 fois
la taille de l'implant initial par cycle
de culture
Friabilité : très friable
Aucun phénomène d'organogenèse.
EXEMPLE 2 Développement des souches actives.
Afin d'obtenir des quantités plus importantes d'extraits de souches actives on a développé les cultures sous forme de cultures en suspension dans un milieu liquide. Dans ces conditions, les souches sont cultivées soit dans des fioles d'Erlenmeyer agitées, soit dans des réacteurs de culture, soit dans des fermenteurs de capacité croissante selon les besoins, soit sous forme immobilisée sur des supports convenables.
Conditions de culture en fiole d'Erlenmeyer
Flacon de 250, 500 ou 1000 ml
Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépourvu de gélose
Température : 220C à 260C
Photopériode 16 H/ 24 H
Agitation : mouvement giratoire : 100 à 150 rotations/minute.
Flacon de 250, 500 ou 1000 ml
Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépourvu de gélose
Température : 220C à 260C
Photopériode 16 H/ 24 H
Agitation : mouvement giratoire : 100 à 150 rotations/minute.
Conditions de culture en réacteur ou en fermenteur
Agitation à pales : 100 à 250 R.P.M.
Agitation à pales : 100 à 250 R.P.M.
Aération : 0,1 à 0,25 V.V.M.
Température : 250C à 300C
Obscurité totale et permanente
Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépour- vu de gélose.
Obscurité totale et permanente
Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépour- vu de gélose.
EXEMPLE 3 Préparation des extraits de cultures de souches.
La méthode mise au point po.ur l'extraction des souches répond à 3 impératifs principaux - d'une part, l'importante variabilité inhérente aux cultures
de tissus obtenues, laisse supposer des possibilités de
biosynthèse de composés actifs différents de ceux présents
dans la plante in situ. En conséquence, les méthodes d'ex
traction ne doivent pas être spécifiques d'une classe pré
cise de composes.
de tissus obtenues, laisse supposer des possibilités de
biosynthèse de composés actifs différents de ceux présents
dans la plante in situ. En conséquence, les méthodes d'ex
traction ne doivent pas être spécifiques d'une classe pré
cise de composes.
- d'autre part, le procédé d'extraction doit éviter que soit
retenu tout composant initial, y compris les sels minéraux,
du milieu nutritif des cellules végétales pouvant interfe-
rer sur la réponse des tests biologiques mis en oeuvre
(voir exemples 4 et 5).
retenu tout composant initial, y compris les sels minéraux,
du milieu nutritif des cellules végétales pouvant interfe-
rer sur la réponse des tests biologiques mis en oeuvre
(voir exemples 4 et 5).
- enfin, les moyens chimiques et physiques utilisés ne doivent
provoquer en eux-memes aucune perturbation de ces tests
biologiques. Ils doivent également tenter de conserver les
compose-s biosynthétisés par les cellules sous leur forme
native originale (eviter la formation d'artéfacts).
provoquer en eux-memes aucune perturbation de ces tests
biologiques. Ils doivent également tenter de conserver les
compose-s biosynthétisés par les cellules sous leur forme
native originale (eviter la formation d'artéfacts).
La possibilité d'excrétion de métabolites par des tissus végétaux dans le milieu nutritif su lequel ils ont proliféré, est bien connuetANDREEvA T.I. et BEREZEEGQVSKAYA L.N. Nauch.
Dokl. Vyss. Skol. Biol Nauk 1978, nc 7, pp. 107-109).
Aussi l'extraction en vue du criblage des souches a été appli- que en parallèle aux tissus et au milieu de culture correspondant.
Le procédé d'extraction préféré en fonction des 3 critères mentionnés ciodessus est décrit dans le schéma suivant
<tb> <SEP> TISSUS <SEP> OU <SEP> MILIEUX
<tb> <SEP> 15 <SEP> mn <SEP> de <SEP> fixation <SEP> dans <SEP> 2,3 <SEP> volume <SEP> de <SEP> C2H5OH <SEP> <SEP> 960 <SEP> baumé <SEP> bouillant
<tb> <SEP> FILTE <SEP> ATION
<tb> <SEP> BROYAGERES <SEP> RESIDU <SEP> FILTRAT
<tb> <SEP> ID
<tb> <SEP> AGITATION
<tb> <SEP> dans <SEP> C2HSOH <SEP> a <SEP> 7 <SEP> Oc <SEP> baumé
<tb> <SEP> 25
<tb> <SEP> FILTRATION
<tb> PSIDU <SEP> FILTRAT
<tb> ( <SEP> Elimine <SEP> ) <SEP> CONCENTRATION <SEP> sous <SEP> vide <SEP> à <SEP> 30%
<tb> <SEP> du <SEP> du <SEP> volume <SEP> initial
<tb> <SEP> FILTRATION <SEP> sur <SEP> membrane <SEP> de <SEP> porosité <SEP> 0,22y
<tb> <SEP> - <SEP> FILTRAT <SEP> I <SEP> | <SEP> RESfDU
<tb> <SEP> i <SEP> AT <SEP> I <SEP> | <SEP> (Eliminé)
<tb> <SEP> StTCC <SEP> SSIVENENTX
<tb> A) <SEP> EXTRA <SEP> TION <SEP> par <SEP> CHCl3 <SEP> usqu <SEP> a <SEP> Reprise <SEP> par~~~
<tb> <SEP> btention <SEP> d'un <SEP> E11
<tb> <SEP> au <SEP> py <SEP> :<SEP> initial <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHC13
<tb> B) <SEP> EXTRACTION <SEP> par-CHC13 <SEP> Concentration
<tb> <SEP> a <SEP> pH <SEP> 1 <SEP> obtention <SEP> d'un <SEP> o <SEP> 3usqu'à <SEP> reprise <SEP> KTRBI
<tb> <SEP> par <SEP> iS04) <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHCl3 <SEP> 3
<tb> <SEP> I <SEP> sec <SEP> 2
<tb> C) <SEP> EXTRACTION <SEP> par <SEP> CHCl3 <SEP> Concentration
<tb> <SEP> à <SEP> pH <SEP> 10 <SEP> (alcalinisa- <SEP> ~ <SEP> jusqu'à <SEP> Reprise <SEP> par
<tb> <SEP> obtention <SEP> d <SEP> un <SEP> d'un <SEP> T <SEP> E
<tb> <SEP> tion <SEP> par <SEP> N114OH) <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHOC13
<tb>
D'autres procédures d'extraction ont été également utilisées dans le cas précis de ces souches.Elles aboutissent aussi à des extraits actifs. I1 s'agit par exemple d'une procédure sensiblement identique à celle décrite ci-dessus, si ce n'est que la oremière extraction est réalisée par le CHC13 à pH alcalin (9,5-10).
<tb> <SEP> 15 <SEP> mn <SEP> de <SEP> fixation <SEP> dans <SEP> 2,3 <SEP> volume <SEP> de <SEP> C2H5OH <SEP> <SEP> 960 <SEP> baumé <SEP> bouillant
<tb> <SEP> FILTE <SEP> ATION
<tb> <SEP> BROYAGERES <SEP> RESIDU <SEP> FILTRAT
<tb> <SEP> ID
<tb> <SEP> AGITATION
<tb> <SEP> dans <SEP> C2HSOH <SEP> a <SEP> 7 <SEP> Oc <SEP> baumé
<tb> <SEP> 25
<tb> <SEP> FILTRATION
<tb> PSIDU <SEP> FILTRAT
<tb> ( <SEP> Elimine <SEP> ) <SEP> CONCENTRATION <SEP> sous <SEP> vide <SEP> à <SEP> 30%
<tb> <SEP> du <SEP> du <SEP> volume <SEP> initial
<tb> <SEP> FILTRATION <SEP> sur <SEP> membrane <SEP> de <SEP> porosité <SEP> 0,22y
<tb> <SEP> - <SEP> FILTRAT <SEP> I <SEP> | <SEP> RESfDU
<tb> <SEP> i <SEP> AT <SEP> I <SEP> | <SEP> (Eliminé)
<tb> <SEP> StTCC <SEP> SSIVENENTX
<tb> A) <SEP> EXTRA <SEP> TION <SEP> par <SEP> CHCl3 <SEP> usqu <SEP> a <SEP> Reprise <SEP> par~~~
<tb> <SEP> btention <SEP> d'un <SEP> E11
<tb> <SEP> au <SEP> py <SEP> :<SEP> initial <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHC13
<tb> B) <SEP> EXTRACTION <SEP> par-CHC13 <SEP> Concentration
<tb> <SEP> a <SEP> pH <SEP> 1 <SEP> obtention <SEP> d'un <SEP> o <SEP> 3usqu'à <SEP> reprise <SEP> KTRBI
<tb> <SEP> par <SEP> iS04) <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHCl3 <SEP> 3
<tb> <SEP> I <SEP> sec <SEP> 2
<tb> C) <SEP> EXTRACTION <SEP> par <SEP> CHCl3 <SEP> Concentration
<tb> <SEP> à <SEP> pH <SEP> 10 <SEP> (alcalinisa- <SEP> ~ <SEP> jusqu'à <SEP> Reprise <SEP> par
<tb> <SEP> obtention <SEP> d <SEP> un <SEP> d'un <SEP> T <SEP> E
<tb> <SEP> tion <SEP> par <SEP> N114OH) <SEP> résidu <SEP> sec <SEP> CHOC13
<tb>
D'autres procédures d'extraction ont été également utilisées dans le cas précis de ces souches.Elles aboutissent aussi à des extraits actifs. I1 s'agit par exemple d'une procédure sensiblement identique à celle décrite ci-dessus, si ce n'est que la oremière extraction est réalisée par le CHC13 à pH alcalin (9,5-10).
On a également utilisé des procédés d'extraction plus spécifiques des alcaloldes, par exemple, extraction du tissu ou milieu parl'éthanol à 700 Baumé à la température d'ébullition
mise à siccité
reprise par 112504 à 1%
alcalinisation par NH40H jusqu'à pH 9,5
extraction par CHC13
llca- bides (obtenus par acidification) Si l'on utilise un procédé d'extraction du même type que ceux décrits ci-dessus, à partir des souches CR-1 et CR-2, on obtient des extraits possédant une activité antimitotique élevée alliée à une faible toxicité.
mise à siccité
reprise par 112504 à 1%
alcalinisation par NH40H jusqu'à pH 9,5
extraction par CHC13
llca- bides (obtenus par acidification) Si l'on utilise un procédé d'extraction du même type que ceux décrits ci-dessus, à partir des souches CR-1 et CR-2, on obtient des extraits possédant une activité antimitotique élevée alliée à une faible toxicité.
EXEMPLE 4 Mise en évidence de l'activité antimitotique
des extraits obtenus war culture des souches CR-1
et CR-2.
des extraits obtenus war culture des souches CR-1
et CR-2.
Préalablement, il a été vérifié que 1/ les extraits E1, E2 et E3 du volume de milieu nutritif neufe
égal à celui nécessaire à la croissance de la quantité active de
tissus des souches CR-l et CR-2, ne présentaient aucune
activité antimitotique dans le test décrit ci-dessous 2/ l'rapport des extraits à tester ne perturbait en aucun cas
ce test, ni par la dilution du milieu nutritif des cellules
animales ou humaines, ni par les solvants utilisés pour
Les introduire dans ce milieu.
égal à celui nécessaire à la croissance de la quantité active de
tissus des souches CR-l et CR-2, ne présentaient aucune
activité antimitotique dans le test décrit ci-dessous 2/ l'rapport des extraits à tester ne perturbait en aucun cas
ce test, ni par la dilution du milieu nutritif des cellules
animales ou humaines, ni par les solvants utilisés pour
Les introduire dans ce milieu.
Le test utilisé est hasé sur 2'étude de la cinétique de prolifération de leucocytes de souris leucémiques (Souche L 1210) en présence des extraits à essayer. Son protocole est bien connu (Tissue culture methods and applications KRUSE P.F. and
PATTERSON M.K. 1971 - Academic Press New York)
Les extraits E1, E2 et E3 des tissus et des milieux gélosés obtenus par extraction à partir de cultures de souches CR-1 et CR-2 ont été étudiés selon ce test.
PATTERSON M.K. 1971 - Academic Press New York)
Les extraits E1, E2 et E3 des tissus et des milieux gélosés obtenus par extraction à partir de cultures de souches CR-1 et CR-2 ont été étudiés selon ce test.
Les résultats sont les suivants
Seuls les extraits E1 de tissus et de milieux nutritifs obtenus à partir des deux souches CR-1 et CR-2 sont actifs.
Seuls les extraits E1 de tissus et de milieux nutritifs obtenus à partir des deux souches CR-1 et CR-2 sont actifs.
Ces résultats sont illustrés par les figures 1 et 2, qui représentent la cinétique de croissance des cellules L 1210 en présence, respectivement de différentes quantités de tissus et de milieu de culture de la souche CR-l. On peut remarquer qu'un ralentissement notable de la croissance des cellules
L 1210 est observé dès l'introduction d'une dose d'extrait correspondant à 25 g de tissus frais, et que l'effet augmente avec la dos?.
L 1210 est observé dès l'introduction d'une dose d'extrait correspondant à 25 g de tissus frais, et que l'effet augmente avec la dos?.
EXEMPLE 5 Confirmation de l'activité antimitotique des
extraits obtenus par extraction de cultures
des souches CR-i et CR-2.
extraits obtenus par extraction de cultures
des souches CR-i et CR-2.
I1 a évidemment été vérifié que l'effet décelé par le test décrit à l'exemple 4 était une activité antimitotique et non une simple toxicité : le taux de cellules mortes reste constant durant toute la culture.
De plus, on a confirmé cette activité sur des cellules d'une autre espèce animale, et sur un autre type cellulaire que les leucocytes. On a recherché également l'effet sur des cellules normales. On a utilisé pour ces essais une souchedelymphoblastes humains (C C L leucémiques 19, ATCC), une souche de fibroblastes humains normaux ( M R C 5, ICIG) et sa lignée homologue transformée par un virus oncogène (VA 13, ICIG).
Un exemple des résultats obtenus est présenté dans les figures 3, 4 et 5. Ils confirment clairement l'activité des extraits
E1 de ces souches sur d'autres tests "in vitro" que celui basé sur la croissance des cellules L 1210.
E1 de ces souches sur d'autres tests "in vitro" que celui basé sur la croissance des cellules L 1210.
Par ailleurs la toxicité aiguë des extraits obtenus par cultures des souches CR-l et CR-2 à été déterminée par voie I,V.
(veine caudale) sur la souris CD1 (Charles River) pesant en moyenne 20 g.
La toxicité des extraits de tissus est indiquée sous forme de DLo a 300 mg/kg. On a également observé des nécroses de la guerre typiques des composés présentant une activité antimitotique.
I1 apparaît donc que la toxicité des extraits obtenus par cultures des souches CR-1 et CR-2 est très faible
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Activité sur L 1210 dlun extrait E1 de cals de la
souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml ±---+ témoin (T) : dose 0 o-----o dose 0,1 (I) ± + dose 0,5 (II) x-----x dose 1 = extrait E1 de 50 g de tissus frais (III) dose 1,5 (IV)
Figure 2 : Activité sur L 1210 d'un extrait E1 du milieu de
culture de la souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +..+ témoin (T) : dose O o o dose 0,1 (I) x-----x dose 0,2 (II)
dose 1 dose 1 = extrait E1 du milieu de 50 g de tissus
frais (III)
Figure 3 : Activité sur lymphoblastes humains leucémiques
d'un extrait de cals de Catharanthus roseus G. Don
(Souche CR-1) abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +. .+ témoin (T) : dose O
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Activité sur L 1210 dlun extrait E1 de cals de la
souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml ±---+ témoin (T) : dose 0 o-----o dose 0,1 (I) ± + dose 0,5 (II) x-----x dose 1 = extrait E1 de 50 g de tissus frais (III) dose 1,5 (IV)
Figure 2 : Activité sur L 1210 d'un extrait E1 du milieu de
culture de la souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +..+ témoin (T) : dose O o o dose 0,1 (I) x-----x dose 0,2 (II)
dose 1 dose 1 = extrait E1 du milieu de 50 g de tissus
frais (III)
Figure 3 : Activité sur lymphoblastes humains leucémiques
d'un extrait de cals de Catharanthus roseus G. Don
(Souche CR-1) abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +. .+ témoin (T) : dose O
<tb> x----x <SEP> dose <SEP> 0,2 <SEP> 7 <SEP> <SEP> (I)
<tb> o---- <SEP> o <SEP> dose <SEP> 0,1 <SEP> Extrait <SEP> E1 <SEP> de <SEP> tissus <SEP> frais <SEP> (II)
<tb> . <SEP> ~ <SEP> , <SEP> dose <SEP> 1 <SEP> (III)
<tb>
Figure 4 : Fibroblastes humains normaux (MRC5)
Figure 5 : Fibroblastes humains transformés (VA 13)
Activité comparée sur fibroblastes humains nor
maux et transformés de la vinblastine et d'un
extrait de cals de Catharanthus roseus G.Don
(souche CR-1) abscisse : temps en jours
2 ordonnée : nombre de cellules par cm +. .+ témoin (T) : dose O (T) x x méthanol 1% (vol/vol) (I) o o vinblastine 10 7 ou 0,1 mg/l (II) extrait extrait E1 de tissus frais (dose : 1) (III)
<tb> o---- <SEP> o <SEP> dose <SEP> 0,1 <SEP> Extrait <SEP> E1 <SEP> de <SEP> tissus <SEP> frais <SEP> (II)
<tb> . <SEP> ~ <SEP> , <SEP> dose <SEP> 1 <SEP> (III)
<tb>
Figure 4 : Fibroblastes humains normaux (MRC5)
Figure 5 : Fibroblastes humains transformés (VA 13)
Activité comparée sur fibroblastes humains nor
maux et transformés de la vinblastine et d'un
extrait de cals de Catharanthus roseus G.Don
(souche CR-1) abscisse : temps en jours
2 ordonnée : nombre de cellules par cm +. .+ témoin (T) : dose O (T) x x méthanol 1% (vol/vol) (I) o o vinblastine 10 7 ou 0,1 mg/l (II) extrait extrait E1 de tissus frais (dose : 1) (III)
Claims (3)
100 ml/l), des micro-éléments minéraux (solution de Heller,
1 ml/l), le complexe vitaminique B1 (2 ml/l), du chlorure
ferrique hexahydrate (1 mg/l), de l'acide naphtyl-l acéti
que (1 mg/l), de la (furfuryl-amino)-6 purine (1 mg/l), du
glucose (30 mg/l)et de la gélose (7 g/l),
chaque souche est cultivée à 220C, sous éclairement de
2500 lux pendant 16 H/jour et la périodicité de repiqua
ge est de 5 semaines,
les souches ont un aspect morphologique granuleux, sont
très friables et montrent une absence totale d'organogé nèse
les deux souches retenues présentant de plus les
caractéristiques suivantes
pour la souche CR-1, une pigmentation vert clair et un
taux de croissance de l'ordre de 6 fois la taille de
l'implant initial par cycle de culture;
pour la souche CR-2, une pigmentation verte et un taux
de croissance de l'ordre de 12 fois la taille de l'im
plant de croissance par cycle de culture.
2. Extraits selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'
ils sont obtenus par extraction de tissus ou de milieux de
culture des souches retenues, cultivées en milieu liquide
de composition semblable à celui décrit dans la revendica
tion 1, à l'exception de la gélose.
3. Méthode de production des extraits actifs selon l'une quel
conque des revendications 1 ou 2, par culture en suspen-
sion dans des fermenteurs ou sous forme immobilisée, des
souches selon la revendication 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7930050A FR2470603A1 (fr) | 1979-12-07 | 1979-12-07 | Extraits a activite antimitotique obtenus a partir de nouvelles souches de tissus de catharanthus roseus g. don |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7930050A FR2470603A1 (fr) | 1979-12-07 | 1979-12-07 | Extraits a activite antimitotique obtenus a partir de nouvelles souches de tissus de catharanthus roseus g. don |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2470603A1 true FR2470603A1 (fr) | 1981-06-12 |
| FR2470603B1 FR2470603B1 (fr) | 1983-04-08 |
Family
ID=9232495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR7930050A Granted FR2470603A1 (fr) | 1979-12-07 | 1979-12-07 | Extraits a activite antimitotique obtenus a partir de nouvelles souches de tissus de catharanthus roseus g. don |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2470603A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000968A2 (fr) * | 1986-08-04 | 1988-02-11 | Mitsui Petrochemical Industries, Ltd. | Procede et moyens pour induire la production de metabolites secondaires dans des cultures vegetales |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB870723A (en) * | 1958-12-02 | 1961-06-21 | Canadian Patents Dev | Vincaleukoblastine and its preparation |
| US3370057A (en) * | 1964-04-27 | 1968-02-20 | Lilly Co Eli | Leurosine |
-
1979
- 1979-12-07 FR FR7930050A patent/FR2470603A1/fr active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB870723A (en) * | 1958-12-02 | 1961-06-21 | Canadian Patents Dev | Vincaleukoblastine and its preparation |
| US3370057A (en) * | 1964-04-27 | 1968-02-20 | Lilly Co Eli | Leurosine |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CA1977 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000968A2 (fr) * | 1986-08-04 | 1988-02-11 | Mitsui Petrochemical Industries, Ltd. | Procede et moyens pour induire la production de metabolites secondaires dans des cultures vegetales |
| WO1988000968A3 (fr) * | 1986-08-04 | 1988-03-24 | Mitsui Petrochemical Ind | Procede et moyens pour induire la production de metabolites secondaires dans des cultures vegetales |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2470603B1 (fr) | 1983-04-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TP | Transmission of property | ||
| ST | Notification of lapse |