DE69326377T2 - Kallus-Zellen-Induktion und Herstellung von Taxanen - Google Patents

Kallus-Zellen-Induktion und Herstellung von Taxanen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion von Callus-Zellen, die Taxane, wie Taxol, aus Explantatgeweben erzeugen können, die so erzeugten Callus-Zellen und ein Verfahren, das diese Zellen in einer Zellkultur in Suspension zur Herstellung von Taxanen verwendet.
  • Taxane sind Diterpenverbindungen, die im pharmazeutischen Gebiet Verwendung finden. Es hat sich zum Beispiel gezeigt, dass Taxol, ein Taxan der Struktur:
  • in der Ph eine Phenylgruppe bedeutet, Ac eine Acetylgruppe darstellt, und Bz eine Benzoylgruppe bedeutet, ein wirksames Antikrebsmittel ist, das besonders bei der Behandlung von Ovarialkrebs nützlich ist.
  • Taxane, wie Taxol, können in Pflanzenmaterialien gefunden werden und wurden daraus isoliert. Diese Taxane können jedoch in relativ kleinen Mengen in Pflanzenmaterialien vorhanden sein, so dass im Fall von Taxol zum Beispiel sehr viele langsam wachsende Eibenbäume, die eine Quelle für die Verbindung bilden, erforderlich sein können. Das Fachgebiet setzte somit die Suche nach anderen Verfahren zur Gewinnung von Taxanen, wie Taxol, fort. Besonders werden effiziente Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen in einer Zellkultur in Suspension gesucht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Induktion von Callus-Zellen, die mindestens ein Taxan aus Explantatgewebe erzeugen können, bereit, umfassend die Schritte:
  • (a) Inkontaktbringen mindestens eines Teils des Explantatgewebes mit einem flüssigen Medium ohne vollständiges Eintauchen des Gewebes in das Medium; und
  • (b) Induzieren der Erzeugung von Callus-Zellen.
  • Die Induktion von Callus-Zellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht den direkten Transfer der so gebildeten Zellen in ein flüssiges Medium zur Herstellung von Taxanen in einer Zellkultur in Suspension ohne einen gesonderten Wachstums- oder Vermehrungsschritt, was somit die Gesamtentwicklungszeit verkürzt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Callus-Zellen, die durch das vorstehende Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, und ein Verfahren zur Verwendung dieser Zellen zur Herstellung von Taxanen in einer Zellkultur in Suspension bereit. Die vorliegende Erfindung wird wie folgt ausführlicher beschrieben.
    • Definitionen
  • Der hier verwendete Begriff "Explantatgewebe" bezeichnet Gewebe aus einer ursprünglichen Pflanzenquelle, wobei zum Beispiel das Gewebe vorher nicht mit einer künstlichen Flüssigkeit oder einem festen Medium zur Erzeugung von Callus-Zellen in Kontakt gebracht wurde.
  • Der hier verwendete Begriff "Induktion" bezeichnet die anfängliche Entdifferenzierung aus dem vorstehend erwähnten Explantatgewebe zur Erzeugung von Callus-Zellen. Der hier verwendete Begriff "Callus-Zelle" bezeichnet eine beliebige Zelle, die bezüglich des Explantatgewebes, aus dem sie stammte, entdifferenziert ist.
  • Der hier verwendete Begriff "festes Medium" bezeichnet ein Medium, das (ein) Geliermittel in einer Menge enthält, die zur Verfestigung des Mediums ausreicht.
  • Der hier verwendete Begriff "flüssiges Medium" bezeichnet ein Medium, das (ein) Geliermittel in einer Menge enthält, die zur Verfestigung des Mediums nicht ausreicht, oder das überhaupt kein(e) Geliermittel enthält.
  • Der hier verwendete Begriff "dispergierte Zellen" bezeichnet die Callus-Zellen oder Callus-Zellcluster, die nach der Entdifferenzierung aus Explantatgewebe nicht an dem verbliebenen Explantatgewebe haften und somit freie Zellen oder Zellcluster in dem umgebenden flüssigen Medium werden.
  • Der hier verwendete Begriff "Membranfloß" bezeichnet eine blattartige Trägerstruktur für das Explantatgewebe, wobei die Struktur bevorzugt ausreichend porös ist, um einen Transport von Nährstoffen zu ermöglichen.
  • Der hier verwendete Begriff "Entdifferenzierung" bezeichnet Änderungen in einem differenzierten Gewebe, wobei die Änderungen derart sind sind, dass sie zur Umwandlung des Zelltyps in einen gewöhnlichen Zelltyp führen.
    • Explantatgewebe
  • Das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Explantatgewebe kann ein beliebiges Pflanzengewebe sein, aus dem Callus-Zellen, die in der Lage sind, ein Taxan zu erzeugen, induziert werden können. Typische Quellen für Explantatgewebe umfassen Pflanzen der Familie Taxaceae, wie Pflanzen der Gattung Amentotaxus, Austrotaxus, Pseudotaxus, Torreya und Taxus. Als Quellen von Explantatgewebe sind Pflanzen der Gattung Taxus bevorzugt, im besonderen die Arten T. brevifolia, T. baccata, T. x media (z. B. Taxus media hicksii), 71 wallichiana, T. canadensis, T. cuspidata, T. floridiana, T. celebica und T. x hunnewelliana.
  • Ein beliebiger Teil der Pflanze, aus dem Callus-Zellen induziert werden können, kann als die Explantatquelle verwendet werden, wie die Rinde, das Kambium, die Wurzeln, Blätter oder Nadeln, die Stiele, Äste, Zweige, das Holz, die Keime, Samen oder Keimlinge. Bevorzugt werden die Pflanzenorgane, umfassend die Wurzel, den Stiel, das Blatt oder den Keim, verwendet, besonders wenn die Quelle des Wurzelgewebes aus dem Wurzelmeristem (wachsende Spitze) oder Wurzelkambium (Wurzelrinde) stammt, wenn das Stielgewebe aus der Rinde, den Ästen oder Zweigen stammt und wenn das Keimgewebe aus unreifen Keimen oder gekeimten, reifen Keimen aus Samen stammt. Das Alter oder die Reife der als die Explantatquelle verwendeten Pflanze kann von der von unreifen Keimen, Keimen, Keimlingen bis zu und einschließlich reifen Bäumen reichen. Stielgewebe ist am meisten bevorzugt.
  • Bevorzugt wird vor der Verwendung in der vorliegenden Erfindung das Explantatgewebe in Stücke mit einer zur Verwendung darin geeigneten Größe, wie Größen mit einer Länge im Bereich von etwa 1 cm bis etwa 5 cm, geschnitten. Die Oberfläche des Explantatgewebes wird auch bevorzugt vor der Verwendung sterilisiert. Die Sterilisation kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, wie durch die Verwendung eines chlorierten Bleichmittels, einer Alkohollösung, wie einer Ethanol/Wasser-Lösung (z. B. 70% Ethanol) oder eines Gemisches davon, durchgeführt werden. Antimikrobielle Mittel können auch verwendet werden, um Sterilität zu erzielen und aufrechtzuerhalten.
    • Träger
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Explantatgewebe wird in einer solchen Stellung gehalten, dass mindestens ein Teil des Gewebes in Kontakt mit dem flüssigen Medium ist, während ein vollständiges Eintauchen in das flüssige Medium, das für die Callus- Induktion unerwünscht ist, vermieden wird. Somit kann ein Träger verwendet werden, der das Explantatgewebe in einer Stellung hält, in der ein Teil des Gewebes in Kontakt mit der umge benden Atmosphäre, am meisten bevorzugt Luft, ist, während der verbliebene Teil mit dem flüssigen Medium in Kontakt ist.
  • Ein beliebiger Träger, der das Explantatgewebe der vorliegenden Erfindung so anbringt, kann verwendet werden. Das Explantatgewebe kann zum Beispiel auf ein Membranfloß, was bevorzugt ist, oder auf einen Schwamm gelegt werden. Zur Verwendung als Membranfloß bevorzugte Materialien umfassen mikroporöses Polypropylen oder Celluloseacetat. Der mittlere Durchmesser der Poren des Floßes ist bevorzugt geringer als der mittlere Durchmesser der einzelnen erzeugten Callus-Zellen. Die Membranmaterialien, die keinen Transfer von Callus-Zellen durch die Membran ermöglichen, sind besonders bevorzugt. Das Niveau des flüssigen Mediums liegt außerdem bevorzugt oberhalb des Niveaus des Membranfloßes, wobei das Floß so unterhalb des Niveaus des flüssigen Mediums angebracht ist, dass sich Flüssigkeit sowohl oberhalb als auch unterhalb des Niveaus des Floßes befindet. Diese Ausführungsformen erleichtern die Erzeugung dispergierter Zellen und insbesondere von Clustern dispergierter Zellen.
    • Flüssiges Medium
  • Ein beliebiges flüssiges Medium, das eine Callus-Induktion ermöglicht, kann verwendet werden. Typische flüssige Medien sind wässriges Gamborg B5-Medium (Tabelle 1 nachstehend), Murashige- und Skoog-Medium (Tabelle 2 nachstehend), Anderson-Rhododendron-Basal-Salts-Medium (Tabelle 3 nachstehend), Whites-Medium (Tabelle 4 nachstehend) sowie Variationen dieser Medien. Typische Variationen der vorstehend erwähnten Medien umfassen die Zugabe von Zuckern, wie Saccharose, Glucose oder Maltose, Casaminosäuren (z. B. 0,2%), Enzym-hydrolysiertem Casein (z. B. 0,02%) und Glycin (z. B. 0,002%) und verschiedenen Auxinen und Cytokinen. Die Verwendung von wässrigem Gamborg B5- Medium ist bevorzugt.
    • Tabelle 1 Zusammensetzung von Gamborg B5-Medium
  • Grundsalze mg/l
  • Ammoniumsulfat 134,000
  • Borsäure 3,000
  • wasserfreies Calciumchlorid 113,240
  • Cobaltchloridhexahydrat 0,025
  • Kupfer(II)-sulfatpentahydrat 0,025
  • Dinatrium-EDTA-dihydrat 37,300
  • Eisen(II)-sulfatheptahydrat 27,800
  • wasserfreies Magnesiumsulfat 122,090
  • Mangan(II)-sulfatmonohydrat 10,000
  • Kaliumiodid 0,750
  • Kaliumnitrat 2500,000
  • Natriummolybdatdihydrat 0,250
  • wasserfreies, einbasiges Natriumphosphat 130,500
  • Zinksulfatheptahydrat 2,000
  • Vitamine
  • Myoinosit 100,0
  • Thiamin-HCl 10,0
  • Pyridoxin-HCl 1,0
  • Nicotinsäure 1,0
  • Zucker
  • Saccharose 20000,0
  • Hormone
  • 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ("2,4-D") 1,5
    • Tabelle 2 Zusammensetzung von Murashige- und Skoog-Medium
  • Grundsalze mg/l
  • Borsäure 6,20
  • wasserfreies Calciumchlorid 332,20
  • Cobaltchloridhexahydrat 0,025
  • Kupfer(II)-sulfatpentahydrat 0,025
  • Dinatrium-EDTA-dihydrat 37,260
  • Eisen(II)-sulfatheptahydrat 27,800
  • wasserfreies Magnesiumsulfat 180,70
  • Mangan(II)-sulfatmonohydrat 16,90
  • Kaliumiodid 0,830
  • Kaliumnitrat 1900,00
  • Natriummolybdatdihydrat 0,250
  • wasserfreies, einbasiges Kaliumphosphat 170,00
  • Zinksulfatheptahydrat 8,60
  • Ammoniumnitrat 1650,00
  • Vitamine
  • Myoinosit 100,0
  • Thiamin-HCl 10,0
  • Pyridoxin-HCl 1,0
  • Nicotinsäure 1,0
  • Zucker
  • Saccharose 20000,0
  • Hormone
  • 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 1,5
    • Tabelle 3 Zusammensetzung von Anderson-Rhododendron-Basal-Salts-Medium
  • Grundsalze mg/l
  • Ammoniumnitrat 400,00
  • Borsäure 6,200
  • wasserfreies Calciumchlorid 332,20
  • Cobaltchloridhexahydrat 0,025
  • Kupfer(II)-sulfatpentahydrat 0,025
  • Dinatrium-EDTA-dihydrat 74,500
  • Eisen(II)-sulfatheptahydrat 55,70
  • wasserfreies Magnesiumsulfat 180,70
  • Mangan(II)-sulfatmonohydrat 16,90
  • Kaliumiodid 0,300
  • Kaliumnitrat 480,00
  • Natriummolybdatdihydrat 0,250
  • wasserfreies, einbasiges Natriumphosphat 330,60
  • Zinksulfatheptahydrat 8,60
  • Vitamine
  • Myoinosit 100,0
  • Thiamin-HCl 10,0
  • Pyridoxin-HCl l,0
  • Nicotinsäure 1,0
  • Zucker
  • Saccharose 20000,0
  • Hormone
  • 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 1,5
    • Tabelle 4 Zusammensetzung von Whites-Medium
  • Grundsalze mg/l
  • Borsäure 1,50
  • Calciumnitrattetrahydrat 208,40
  • Kupfer(II)-sulfatpentahydrat 0,010
  • Eisen(II)-sulfat 2,50
  • wasserfreies Magnesiumsulfat 366,20
  • Mangan(II)-sulfatmonohydrat 3,788
  • Kaliumiodid 0,750
  • Kaliumnitrat 80,00
  • Natriumsulfat 200,00
  • wasserfreies, einbasiges Natriumphosphat 16,50
  • Zinksulfatheptahydrat 3,00
  • Kaliumchlorid 65,00
  • Vitamine
  • Myoinosit 100,0
  • Thiamin-HCl 10,0
  • Pyridoxin-HCl 1,0
  • Nicotinsäure 1,0
  • Zucker
  • Saccharose 20000,0
  • Hormone
  • 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 1,5
    • Callus-Induktion
  • Callus-Zellen können induziert werden, indem das System aus Explantatgewebe/- flüssigem Medium bei dafür geeigneten Bedingungen gehalten wird.
  • Die während der Induktion verwendete Temperatur liegt bevorzugt zwischen etwa 20ºC und etwa 30ºC, insbesondere bevorzugt bei etwa 22ºC. Der Teil des Explantatgewebes, der nicht mit dem flüssigen Medium in Kontakt ist, ist bevorzugt in Kontakt mit Luft, in der die relative Feuchtigkeit zum Beispiel durch festes Verschliessen des Systems reguliert wird. Die relative Feuchtigkeit kann zum Beispiel nahe der Sättigung liegen, wie zwischen etwa 80 % und etwa 100%. Diffuse, das heißt gewöhnliche Raumbeleuchtung ist bevorzugt.
  • Der Teil des Explantatgewebes, der mit dem flüssigen Medium in Kontakt ist, beträgt bevorzugt etwa 10% bis etwa 25% des Gesamtvolumens des Gewebeabschnitts. Die Induktion wird bevorzugt während einer Dauer zwischen etwa 10 Tagen und etwa 30 Tagen durchgeführt. Eine schwache Bewegung des flüssigen Mediums, das mit dem Explantatgewebe während der Induktion in Kontakt ist, kann angewendet werden, obwohl ruhige Bedingungen bevorzugt sind.
  • Callus-Zellen, die an dem verbliebenen Explantatgewebe haften bleiben und/oder die das verbliebene Explantatgewebe abstreifen, um freie Callus-Zellen oder in dem umgebenden flüssigen Medium dispergierte Zellcluster ("dispergierte Zellen") zu erzeugen, können sich bilden. Eine geringe anfängliche Vermehrung der erzeugten Callus-Zellen kann während des vorliegenden Induktionsverfahrens vorkommen.
  • Die Verwendung eines flüssigen statt eines festen Mediums bei der Induktion von Callus-Zellen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet deutliche Vorteile. Im besonderen induziert die Verwendung eines festen Mediums eine Callus-Bildung in einer relativ trockenen Umgebung, in der die erzeugten Callus-Zellen an dem Explantatgewebe haften bleiben. In dieser Umgebung erzeugte Callus-Zellen müssen an eine flüssige Umgebung akklimatisiert werden, um schließlich zu wachsen und in einer Zellkultur in flüssiger Suspension effizient Taxane zu erzeugen. Infolge der Änderung der Sauerstoffverfügbarkeit, osmotischer Unterschiede und dergleichen unterliegen auf einem festen Medium induzierte Callus- Zellen während der Akklimatisierung an eine flüssige Umgebung einer Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit und Taxanerzeugung und können eine Zunahme von Anomalien des Zelltyps und der Lyse zeigen. Ferner verlängert eine Akklimatisierung, besonders wenn sie während eines gesonderten, nachfolgenden Wachstums- oder Vermehrungsschrittes erzielt wird, die Gesamtentwicklungszeit von Explantatgewebe zu einer Zellkultur in flüssiger Suspension.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verhindert die vorstehenden Schwierig keiten. In Kontakt mit einem flüssigen Medium induzierte Callus-Zellen, im besonderen dispergierte Callus-Zellen, die so wie vorstehend beschrieben induziert wurden, werden leichter an die Bedingungen einer Zellkultur in flüssiger Suspension akklimatisiert. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung induzierte Callus-Zellen können direkt ohne Anwendung eines gesonderten Wachstums- oder Vermehrungsschrittes in ein Medium für Zellkulturen in flüssiger Suspension transferiert werden. Somit verringert das Induktionsverfahren der vorliegenden Erfindung die Gesamtentwicklungszeit vom Explantatgewebe zur Zellkultur in Suspension effizient, wodurch die Produktivität verbessert wird.
  • Weitere Vorteile können ebenfalls durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt werden. Die Callus-Induktion kann zum Beispiel eine längere Zeitdauer eher auf einem flüssigen als auf einem festen Medium erreicht werden, so dass eine größere Zahl von Callus- Zellen erhalten weren kann. Unerwünschte Verbindungen, wie Phenolverbindungen, die während der Callus-Induktion gebildet werden, diffundieren leichter in das Medium und weg von der Stelle der Callus-Induktion, wenn ein flüssiges Medium verwendet wird. Ferner weist der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildete Callus ein gesundes, grünes Aussehen auf und enthält weniger Bereiche brauner Callus-Zellen als ein auf einem festen Medium induzierter Callus.
  • Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bieten zusätzliche Vorteile. Die Bildung dispergierter Zellen und dispergierter Zellcluster ist zum Beispiel erwünscht, da diese Zellen am leichtesten an Bedingungen einer Zellkultur in flüssiger Suspension akklimatisiert werden. Somit ist die Verwendung eines flüssigen Mediums in Kontakt mit einem ausreichenden Teil des Explantatgewebes vorteilhaft, um die Bildung dispergierter Zellen und Zellcluster zu ermöglichen und zu fördern, wobei das Niveau des flüssigen Mediums oberhalb der Trägerstruktur des Explantatgewebes (z. B. Membranfloß) liegt.
  • Am vorteilhaftesten ist die Bildung von Clustern dispergierter Zellen. Cluster dispergierter Zellen erreichen am schnellsten die kritische Masse an Zellen, die für ein maximales Zellwachstum und eine maximale Taxanproduktion erforderlich ist, wenn sie in ein Zellkultursystem in flüssiger Suspension transferiert werden. Somit ist die Verwendung einer Trägerstruktur für Explantatgewebe bevorzugt, die den Transfer dispergierter Zellcluster durch die Struktur nicht ermöglicht. Die Verwendung eines Membranfloßes mit Poren, deren mittlerer Durchmesser geringer als der mittlere Durchmesser einzelner dispergierter Zellen ist, hält zum Beispiel Zellcluster oberhalb des Niveaus des Floßes und hemmt den Transfer von Zellen durch die Membran, während dem Zellcluster in einzelne Zellen aufgebrochen werden können.
    • Taxanerzeugung
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erzeugung von mindestens einem Taxan bereit, umfassend die Schritte:
  • (A) Induzieren von Callus-Zellen, die mindestens ein Taxan erzeugen können, gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Induktion von Callus-Zellen; und
  • (B) Züchten der Zellen in flüssiger Suspension in einem Zellkultursystem zur Herstellung des/der Taxans/e.
  • Bevorzugt wird ohne Verwendung einer Zwischenstufe oder eines gesonderten Wachstums- oder Vermehrungsschrittes von Schritt (A) nach Schritt (B) gegangen. Der hier verwendete "gesonderte Wachstums- oder Vermehrungsschritt" bedeutet den Transfer der Zellen an eine Stelle, die sich von der, an der die Schritte (A) und (B) durchgeführt werden, physikalisch unterscheidet, und das Wachstum oder die Vermehrung von Callus-Zellen.
  • Die Zellkultur in Suspension eines beliebigen Taxans, das durch dieses Verfahren erzeugt werden kann, soll im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen. Es ist selbstverständlich, dass ein einzelnes oder zwei oder mehrere Taxane während der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können.
  • Der Züchtungsschritt (B) des vorstehenden Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann gemäß Verfahren der Zellkultur in Suspension, wie denen, die einem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Siehe U. S. -Patent Nr. 5,019,504, das durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Typische Medien, die verwendet werden können, umfassen die vorstehend hinsichtlich der Induktionsmedien diskutierten. Agar (z. B. 0,1%) oder Phytagel (z. B. 0,025%) können gegebenenfalls ferner zu diesen Medien gegeben werden. Die während der Zellkultur in Suspension verwendete Temperatur liegt bevorzugt zwischen etwa 22 und 25ºC; die verwendete relative Feuchtigkeit liegt bevorzugt zwischen etwa 40 und etwa 60%; und der Bewegungsgrad beträgt bevorzugt etwa 30 bis etwa 200 Umdrehungen pro Minute (UpM). Induktionsmittel, wie von Pilzen stammenden Stimulatoren, Vanadylsulfat, 3,4- Dichlorphenoxytriethyl(amin) etc., können zugegeben werden. Die Taxanerzeugung kann auch durch Verwendung von Zellen, die in Calciumalginatkügelchen eingekapselt sind, sowie in einer Aufschlämmung, die z. B. durch Einbringen von 0,1% Agar in die Medien hergestellt wurde, durchgeführt werden.
  • Die Gewinnung der während der Züchtung erzeugten Taxane kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erfolgen. Asorbierende Kügelchen können zum Beispiel verwendet werden, um die Gewinnung von Taxanen, wie Taxol, zu beschleunigen. Kügelchen, die während der Erzeugung von Taxanen, wie Taxol, in der Kultur verbleiben, können durch Bindung des/der Taxanprodukts/e auch eine größere Erzeugung ermöglichen. Ferner erfolgt die Extraktion des/der Taxanprodukts/e aus dem Zellüberstand oder den Kügelchen leicht mit Lösungsmitteln, wie Ether oder Methylenchlorid.
    • Taxanverbindungen
  • Taxane sind Diterpenverbindungen, die das Taxankohlenstoffgerüst enthalten:
  • wobei das Gerüst eine ethylenische Nichtsättigung in seinem Ringsystem enthalten kann (z. B. wenn die 11- und 12-Stellung durch eine ethylenische Bindung gebunden sind). Die Herstellung aller Taxane, ob pharmakologisch wirksam oder unwirksam, soll im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen. Taxane können durch die Callus-Zellen der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, die im ursprünglichen Explantatgewebe gefunden werden (d. h. natürlich vorkommen) oder nicht.
  • Typische Taxane, die durch das Zellkulturverfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können, umfassen die der folgenden Formel I:
  • in der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub7;, R&sub8;, R&sub9;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4;, R&sub1;&sub5;, R&sub1;&sub6; und "α" wie in der folgenden Tabelle 5 definiert sind. Tabelle 5 Tabelle 5 (Fortsetzung) Tabelle 5 (Fortsetzung)
    • Fussnoten
  • 1/ "ceph" bezeichnet
  • "tax" bezeichnet
  • "taxsub" bezeichnet
  • "taxot" bezeichnet
  • 2/ "xylosyl" bezeichnet
  • 3/ "α" bezeichnet eine zwischen der 11- und 12-Stellung vorhandene Doppelbindung.
  • 4/ "α" bezeichnet die Stereostellung einer Einheit unterhalb der Ebene der vorstehend gezeigten Taxanringstruktur
  • "β" bezeichnet die Stereostellung einer Einheit oberhalb der Ebene der vorstehend gezeigten Taxanringstruktur
  • 5/ "oxetan" bezeichnet die Einheit
  • die
  • bedeutet.
  • 6/ "cyclo" bezeichnet den durch die Bindung des Restes
  • an den Taxanring A erzeugten cyclischen Rest wie folgt:
  • 7/ "epoxid" bezeichnet die Einheit
  • die
  • darstellt.
  • Taxane, die durch das Zellkulturverfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können, können auch durch die folgenden Formeln II oder III dargestellt werden:
  • in denen
  • R&sub4; eine Ketogruppe ( = O) oder eine Acetyloxygruppe bedeutet;
  • R&sub7; ein Wasserstoffatom, eine ct-Hydroxy- oder β-Hydroxygruppe bedeutet;
  • R&sub9; eine Acetyloxy-, Cinnamoyloxy- oder Hydroxylgruppe bedeutet;
  • R&sub1;&sub0; und R&sub1;&sub1; zusammen eine Methylen- oder Epoxidgruppe bilden;
  • R&sub1;&sub2; ein Wasserstoffatom, eine Benzoyloxy- oder Acetyloxygruppebedeutet; und
  • R&sub1;&sub7; ein Wasserstoffatom oder eine Acetyloxygruppe bedeutet.
  • Bevorzugte Taxane umfassen Taxol, Baccatin III, 10-Desacetylbaccatin III, 10- Desacetyltaxol, Xylosyltaxol, 7-Epitaxol, 7-Epibaccatin III und 10-Desacetyl-7-epitaxol. Die Erzeugung von Taxol in Zellkultur ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Taxane sind Verbindungen, die im pharmazeutischen Gebiet Verwendung finden, wie bei der Behandlung von Krebs. Taxol ist für die pharmakologisch wirksamen Taxane typisch, die zum Beispiel auch Cephalomannin umfassen, wobei von dem letzteren als chemotherapeutisches Mittel zur Remission von Leukämie in dem U. S. -Patent Nr. 4,206,221 berichtet wurde. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Herstellung dieser pharmakologisch wirksamen Taxane sowie die Herstellung schwach wirksamer oder unwirksamer Taxane oder der mit einer weniger erwünschten Wirksamkeit, die als Zwischenverbindungen zur Herstellung anderer pharmakologisch wirksamer Taxane verwendet werden können. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann somit die Herstellung pharmakologisch wirksamer Taxane erleichtern, indem ein effizientes Mittel zur Herstellung des Taxanausgangsmaterials durch eine Zellkultur bereitgestellt wird.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung, und sollen den Umfang der vorliegenden Ansprüche keineswegs einschränken.
    • Beispiel 1 Induktion von Callus-Zellen und Herstellung von Taxol
  • Explantate wurden aus Pflanzenstielen von Taxus media hicksii nach Sterilisieren in 70%igem Alkohol und 25%igem Bleichmittel geschnitten. Jedes Explantat mit einer Länge von ungefähr 2-3 cm wurde auf ein mikroporöses Polypropylenmembranfloß gelegt, das auf einem Medium aus Gamborg-B5-Basal-Salts und Vitaminen (siehe Tabelle 1 vorstehend), 2 % Saccharose, 1,5 mgIl 2,4-D und 2 g/l Casaminosäuren schwamm. Das Medium und das Floß befanden sich in einem Polycarbonatbehälter mit 4 · 4 Zoll, der mit einem festsitzenden Polypropylendeckel ausgestattet war, um eine hohe Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
  • Bevor das Explantat auf das Floß gelegt wurde, wurden das Gefäß und das Medium unter Standardbedingungen 15 Minuten autoklaviert. Nachdem das Explantat auf das Floß gelegt worden war, wurden 5-10 ml des vorstehenden Mediums auf die Oberseite des Explantats gegeben. Das Gefäß mit dem Floß wurde 3-4 Wochen bei 22ºC inkubiert, bis ein Callus erzeugt worden war. Nach der Inkubation wurden das Explantat und der Callus entfernt, und die auf dem Floß verbliebenen freien Zellen wurden abpipettiert und zu 25 ml des vorstehenden Gamborg-Mediums, zu dem 0,1 g/l Agar gegeben worden waren, in einen Kolben mit 125 ml gegeben. Die freien Zellen von mehreren Flößen können in einem Kolben vereinigt werden, wenn sich die Zahl der Zellen als niedrig erweist. Der angeimpfte Kolben wurde bei 22ºC auf einem Schüttler mit 50 UpM bei 45% Feuchtigkeit und Streulicht inkubiert.
  • Nach 3 Wochen wurden die Kolben geerntet und auf Taxol analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Kolben mit den Suspensionen 0,01 bis 0,02 mg/l Taxol oder ausgedrückt auf der Basis des Trockenzellgewichts 0,0002 bis 0,0004% Taxol, basierend auf dem Trockenzellgewicht, enthielten. Die Gegenwart weiterer Taxane, einschließlich Cephalomannin und Baccatin III, wurde ebenfalls nachgewiesen. (Basierend auf 2 Läufen wie folgt:
    • Beispiel 2 Variation des Mediums
  • Explantate wurden aus Pflanzenstielen von Taxus media hicksii nach Sterilisieren in 70%igem Alkohol und 25%igem Bleichmittel geschnitten. Jedes Explantat mit einer Länge von ungefähr 2-3 cm wurde auf ein mikroporöses Polypropylenmembranfloß gelegt, das auf einem Medium aus Anderson-Rhododendron-Basal-Salts (siehe Tabelle 3 vorstehend) und Gamborg-Vitaminen (siehe Tabelle 1 vorstehend), 2% Saccharose, 1,5 mg/l 2,4-D und 2 g/l Casaminosäuren schwamm. Das Medium und das Floß befanden sich in einem Polycarbonatbehälter mit 4 · 4 Zoll, der mit einem festsitzenden Polypropylendeckel ausgestattet war, um eine hohe Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
  • Bevor das Explantat auf das Floß gelegt wurde, wurden das Gefäß und das Medium unter Standardbedingungen 15 Minuten autoklaviert. Nachdem das Explantat auf das Floß gelegt worden war, wurden 5-10 ml des vorstehenden Mediums auf die Oberseite des Explantats gegeben. Das Gefäß mit dem Floß wurde 5-10 Wochen bei 22ºC inkubiert, bis ein Callus erzeugt worden war. Nach der Inkubation wurden das Explantat und der Callus entfernt, und die auf dem Floß verbliebenen freien Zellen wurden abpipettiert und zu 25 ml des vorstehenden Anderson-Mediums, zu dem 0,1 g/l Agar gegeben worden waren, in einen Kolben mit 125 ml gegeben. (Die freien Zellen von mehreren Flößen können, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, vereinigt werden.) Der angeimpfte Kolben wurde bei 22ºC auf einem Schüttler mit 50 UpM bei 45% Feuchtigkeit und Streulicht inkubiert.
  • Nach 3 Wochen wurden die Kolben geerntet und auf Taxol analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Kolben mit den Suspensionen 0,0194 mg/l Taxol oder ausgedrückt auf der Basis des Trockenzellgewichts 0,0062% Taxol, basierend auf dem Trockenzellgewicht, enthielten.

Claims (24)

1. Verfahren zur Induktion von Callus-Zellen, die mindestens ein Taxan aus Explantatgewebe erzeugen können, umfassend die Schritte:
(a) Inkontaktbringen mindestens eines Teils des Explantatgewebes mit einem flüssigen Medium ohne vollständiges Eintauchen des Gewebes in das Medium; und
(b) Induzieren der Erzeugung von Callus-Zellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Explantatgewebe aus einer Pflanze der Familie Taxaceae erhalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus den Arten T. brevifolia, T. baccata, T. x media, T. wallichiana, T. canadensis, T. cuspidata, T. floridiana, T, celebica und T. x hunnewelliana.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mindestens eine Taxan Taxol, 10-Desacetylcephalomannin, 7-Epitaxol, 10-Desacetyl-7-epitaxol, 7-Epicephalomannin, Baccatin III, Taxoter, 10-Desacetylbaccatin III, Cephalomannin, 10-Desacetyltaxol, Xylosyltaxol, Xylosylcephalomannin, 7-Epibaccatin III, Taxagifin, 8-Benzoyloxytaxagifin, 9-Acetyloxytaxusin, 9-Hydroxytaxusin, Taiwanxam, Taxan Ia, Taxan Ib, Taxan Ic und/oder Taxan Id ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das mindestens eine Taxan Taxol, Baccatin III, 10-Desacetylbaccatin III, 10-Desacetyltaxol, Xylosyltaxol, 7- Epibaccatin III, 7-Epitaxol und/oder 10-Desacetyl-7-epitaxol ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Taxan Taxol ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mindestens eine Taxan ein Taxan der Formel II und/oder III ist:
in denen
R&sub4; eine Ketogruppe (=O) oder eine Acetyloxygruppe bedeutet;
R&sub7; ein Wasserstoffatom, eine α-Hydroxy- oder β-Hydroxygruppe bedeutet;
R&sub9; eine Acetyloxy-, Cinnamoyloxy- oder Hydroxylgruppe bedeutet;
R&sub1;&sub0; und R&sub1;&sub1; zusammen eine Methylen- oder Epoxidgruppe darstellen;
R&sub1;&sub2; ein Wasserstoffatom, eine Benzyloxy- oder Acetyloxygruppe bedeutet; und
R&sub1;&sub7; ein Wasserstoffatom oder eine Acetyloxygruppe bedeutet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Explantatgewebe auf einem Membranfloß oder Schwamm getragen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Explantatgewebe auf einem Membranfloß getragen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Membranfloß mikroporöses Polypropylen oder Celluloseacetat ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Niveau des flüssigen Mediums oberhalb des Niveaus des Floßes liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei dispergierte Callus-Zellen oder dispergierte Zellcluster erzeugt werden und wobei außerdem mindestens einige der dispergierten Zellen oder Zellcluster oberhalb des Niveaus des Floßes verbleiben.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Floß eine poröse Struktur aufweist, in der der mittlere Durchmesser der Poren geringer ist als der mittlere Durchmesser der einzelnen dispergierten Zellen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das flüssige Medium wässeriges Gamborg BS-Medium, Murashige- und Skoog-Medium, Anderson-Rhododendron-Basal-Salts-Medium oder Whites-Medium ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das flüssige Medium wässeriges Gamborg B5-Medium ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Teil des Explantatgewebes, der mit dem flüssigen Medium in Kontakt ist, von etwa 10 bis etwa 25% des Gesamtvolumens des Gewebes beträgt.
17. Verfahren zur Erzeugung mindestens eines Taxans, umfassend die Schritte:
(A) Induzieren von Callus-Zellen, die mindestens ein Taxan erzeugen können gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16; und
(B) Züchten der Zellen in flüssiger Suspension in einem Zellkultursystem zur Herstellung des/der Tanxans/e.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei kein gesonderter Wachstums- oder Vermehrungsschritt nach dem Schritt (A) und vor dem Schritt (B) verwendet wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das mindestens eine Taxan Taxol, 10-Desacetylcephalomannin, 7-Epitaxol, 10-Desacetyl-7-epitaxol, 7- Epicephalomannin, Baccatin III, Taxoter, 10-Desacetylbaccatin III, Cephalomannin, 10-Desacetyltaxol, Xylosyltaxol, Xylosylcephalomannin, 7-Epibaccatin III, Taxagifin, 8-Benzoyloxytaxagifin, 9-Acetyloxytaxusin, 9-Hydroxytaxusin, Taiwanxam, Taxan Ia, Taxan Ib, Taxan Ic und/oder Taxan Id ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei Taxol, Baccatin III, 10- Desacetylbaccatin III, 10-Desacetyltaxol, Xylosyltaxol, 7-Epibaccatin III, 7-Epitaxol und/oder 10-Desacetyl-7-epitaxol erzeugt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei Taxol erzeugt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei ein Taxan der nachstehenden Formel II und/oder III erzeugt wird:
in denen
R&sub4; eine Ketogruppe ( = O) oder eine Acetyloxygruppe bedeutet;
R&sub7; ein Wasserstoffatom, eine α-Hydroxy- oder β-Hydroxygruppe bedeutet;
R&sub9; eine Acetyloxy-, Cinnamoyloxy- oder Hydroxylgruppe bedeutet;
R&sub1;&sub0; und R&sub1;&sub1; zusammen eine Methylen- oder Epoxidgruppe darstellen;
R&sub1;&sub2; ein Wasserstoffatom, eine Benzyloxy- oder Acetyloxygruppe bedeutet; und
R&sub1;&sub7; ein Wasserstoffatom oder eine Acetyloxygruppe bedeutet.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Explantatgewebe vorher nicht mit einer künstlichen Flüssigkeit oder einem festen Medium zur Erzeugung von Callus-Zellen in Kontakt gebracht wurde.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das Explantatgewebe vorher nicht mit einer künstlichen Flüssigkeit oder einem festen Medium zur Erzeugung von Callus-Zellen in Kontakt gebracht wurde.
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