CN100427588C - 紫杉细胞的培养方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫杉细胞的培养方法及其专用培养基。该基本培养基的配方为：MgSO4·7H2O 200-300mg，KNO3 200-300mg，KH2PO4 350-400mg，Ca(NO3)2·4H2O450-550mg，FeSO4 27-29mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 36-38mg，MnSO4·H2O 0.8-1.2mg，ZnSO4·7H2O 0.4-0.6mg，KI 0.2-0.3mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 0.2-0.3mg，盐酸噻胺8-12mg，Choline 0.4-0.6mg，L-半胱氨酸8-12mg，H2NCONH2 180-220mg，Inositol 80-120mg，用水定容至1L，pH 5.6-5.8。用该培养方法及其专用培养基可获得大量高活性的紫杉细胞，且培养周期较短，可在4周内获得300g/L高活性紫杉细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域中的细胞培养方法及其专用培养基，特别是涉及紫杉细胞的培养方法及其专用培养基。
背景技术
紫杉醇(pacilitaxel，商品名taxol)，是1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫杉(短叶红豆杉，Taxus.brevifolia)树皮中提取出来的具有独特抗癌活性的二萜类化合物。用该该化合物制备的药物于1990年进入III期临床试验，1992年底获美国FDA批准上市，用于治疗对常规化疗无效的卵巢癌和乳腺癌。1995年，我国北京协和药厂与海口制药厂分获二类新药批准文号，成为世界上第二个生产紫杉醇及其注射液的国家。由于紫杉醇具有独特的抗癌机理和广谱高效的抗癌活性，现已成为继阿霉素和顺铂后最热的抗癌药物。
紫杉又名红豆杉，是红豆杉属植物，据统计，全世界仅有11种红豆杉属植物，且生长缓慢，种群密度小，自身繁殖度低。紫杉醇多提取自紫杉的树皮或树叶，且天然的植物中紫杉醇的含量极低，只有0.003-0.006％，其中，含量最高的曼地亚红豆杉(杂交种)也仅为约0.01％。目前，全世界紫杉醇的产量只有350公斤左右，受产量限制，该药只能用于其它药物无效的癌症治疗。据估计，全世界每年的紫杉醇需求量至少约为1000kg，而目前紫杉醇的产量远远不能满足市场需求。因此，采用各种手段寻找紫杉醇及其类似物的替代资源已成为近年来全世界的研究热点。美国农业部于1991年就批准了Christen和Gibson等用细胞培养法生产紫杉醇及其类似物的专利(United States Patent，5,019,504.)，但是由于其细胞增殖缓慢，细胞中紫杉醇含量极低以及大规模培养工艺等原因，一直没有实现产业化生产。因此该领域的研究仍方兴未艾，相关的研究机构和研究人员一直有增无减。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于培养紫杉细胞的基本培养基。
本发明所提供的用于培养紫杉细胞的基本培养基，命名为紫杉基本培养基，其配方为：MgSO4·7H2O 200-300mg，KNO3200-300mg，KH2PO4 350-400mg，Ca(NO3)2·4H2O450-550mg，FeSO4 27-29mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 36-38mg，MnSO4·H2O 0.8-1.2mg，ZnSO4·7H2O 0.4-0.6mg，KI 0.2-0.3mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 0.2-0.3mg，盐酸噻胺(Aneurine hydrochloride)8-12mg，氯化胆碱(Choline)0.4-0.6mg，L-半胱氨酸(L-Cysteine)8-12mg，H2NCONH2 180-220mg，肌醇(Inositol)80-120mg，用水定容至1L，pH 5.6-5.8。
上述紫杉基本培养基的配方优选为：MgSO4·7H2O 250mg，KNO3 250mg，KH2PO4375mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，FeSO4 27.8mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 37.2mg，MnSO4·H2O1mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，KI 0.25mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO3 0.25mg，盐酸噻胺10mg，氯化胆碱0.5mg，L-半胱氨酸10mg，H2NCONH2200mg，肌醇100mg，用水定容至1L，pH 5.8。
本发明的第二个目的是提供一种紫杉细胞的培养方法。
本发明所提供的紫杉细胞的培养方法，包括以下步骤：
1)以经表面杀菌的幼嫩枝条或叶为外植体，切成小段后，将其接种于愈伤组织诱导培养基上在20-25℃、1500-3000LX、14-16小时光照/天条件下诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在上述紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-5mg/L，α-萘乙酸(NAA)0.1-5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-50g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶(Gellan Gum)1.8-2g/L，pH 5.6-5.8；
2)将愈伤组织接种于继代培养基上在20-25℃、避光条件下进行继代培养，并从中筛选出紫杉醇含量达到0.006％以上的初级高产细胞株；所述继代培养基是在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1-4mg/L，α-萘乙酸0.1-4mg/L，蔗糖或葡萄糖20-30g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶1.8-2g/L，pH 5.6-5.8；
3)先将初级高产细胞株接种于添加有10-70mg/L的秋水仙碱的紫杉基本培养基中在20-25℃、避光条件下振荡培养，再将所述经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞株再次接种于继代培养基上进行继代培养，并从中筛选出紫杉醇含量达到0.01％以上的多倍体高产细胞株；
4)将多倍体高产细胞株接种于扩增培养基上在20-25℃、避光条件下进行扩增培养，可得到大量高活力紫杉细胞；所述扩增培养基是在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.5-2mg/L，α-萘乙酸0.5-2mg/L，蔗糖或葡萄糖30-50g/L，琼脂5-8g/L或凝胶胶1.8-2g/L，pH 5.6-5.8。
在上述培养方法中，步骤1)中对外植体进行表面杀菌的方法可为：在无菌条件下，将紫杉的幼嫩枝条或叶用体积百分浓度为70％的乙醇消毒30-50s，再将其置于质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中杀菌15-20分钟，最后用无菌水冲洗2-4次，每次15-30s，以将表面残留的次氯酸钠溶液冲洗干净；此外，为获得较好的诱导效果，接种前将外值体切成长度约为1-3mm的小段；愈伤组织的诱导时间可为3-5周。
步骤2)中的继代培养周期可为3-4周，至少继代3次。
步骤3)中用含10-70mg/L不同浓度秋水仙碱的紫杉基本培养基对初级高产细胞株进行振荡培养时的振速可为80-120rpm，培养时间可为6-8天；经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞的继代培养条件与步骤2)中的继代培养条件相同，周期可为3-4周，共继代3-4次。
步骤4)中的扩增培养时间可为3-4周。
上述培养方法对任意品种的红豆杉均适用，如东北红豆杉(Taxus cuspidata Siebet Zucc)、中国红豆杉(Taxus chinensis)、南方红豆杉(T.maireiS.Y.Hu)、曼地亚红豆杉(T.media)或云南红豆杉(T.yunnanenisis Cheng et Fu)等。
用上述培养方法获得的高活力紫杉细胞也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种紫杉细胞的培养方法及其专用培养基。用该培养方法及其专用培养基可获得大量高活性的紫杉细胞，且培养周期较短，可在4周内获得300g/L高活性紫杉细胞(新鲜)。可将本发明的培养方法及其专用培养基应用于紫杉醇的生物合成中，以满足市场对紫杉醇的需求。本发明具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基的溶剂均为蒸馏水或去离子水。
实施例1、高活力紫杉细胞的获得
紫杉基本培养基：MgSO4·7H2O 300mg，KNO3 200mg，KH2PO4 400mg，Ca(NO3)2·4H2O450mg，FeSO4 27mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 38mg，MnSO4·H2O 1.2mg，ZnSO4·7H2O 0.6mg，KI 0.2mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，H3BO30.3mg，盐酸噻胺8mg，Choline 0.4mg，L-半胱氨酸12mg，H2NCONH2220mg，Inositol 80mg，用水定容至1L，pH 5.6。
愈伤组织诱导培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1mg/L，α-萘乙酸(NAA)0.1mg/L，葡萄糖20g/L，琼脂5g/L，pH 5.6。
继代培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加6-苄基腺嘌呤0.1mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L，葡萄糖20g/L，琼脂5g/L，pH 5.6。
扩增培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.5mg/L，α-萘乙酸0.5mg/L，葡萄糖30g/L，琼脂5g/L，pH 5.6。
上述培养基的灭菌条件均为：在115-120℃、0.1-0.15MPa压力下灭菌15-20min。
现用对本发明的方法对东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb et Zucc)进行体外培养，并从中筛选出高活力细胞，具体方法包括以下步骤：
1)外植体的消毒灭菌
以东北红豆杉的幼嫩枝条为外植体，在无菌条件下，将其用体积百分浓度为70％的乙醇消毒50s，再将其置于质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中杀菌15分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次30s，以将表面残留的次氯酸钠溶液冲洗干净。
2)诱导愈伤组织
在无菌条件下，将步骤1)经表面杀菌的幼茎段切成长度约为1mm的小段后接种于愈伤组织诱导培养基上，在20℃、1500LX、16小时光照/天条件下诱导愈伤组织，约3-5周后白色或绿色愈伤组织长出。
3)继代培养及初级高产细胞株的获得
将愈伤组织接种于继代培养基上在25℃、避光条件下进行继代培养，培养周期为3-4周，继代5次后，当愈伤组织变得结构疏松，生长速度趋于稳定.后，即可根据愈伤组织的株系不同，分别用称重法评价其生物量积累以及用高效液相色谱(HPLC)法检测其紫杉醇含量，并根据检测结果筛选出生长速度快，紫杉醇含量在0.006％以上的初级高产细胞株。
4)多倍体高产细胞株的筛选
先将初级高产细胞株接种于添加有10-70mg/L的秋水仙碱的紫杉基本培养基中，在22℃、避光、80rpm下振荡培养7天，再将所述经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞株再次接种于继代培养基上继代培养3次，再经生物量和紫杉醇含量检测筛选出生长速度快，生物量积累稳定，紫杉醇含量在0.01％以上的高产细胞株，该细胞系为混合多倍体细胞系，可通过染色体染色进行鉴定。
5)扩增培养
将多倍体高产细胞株接种于扩增培养基上，在20℃、避光条件下培养4周，得到大量高活力紫杉细胞，细胞量达300g/L。
实施例2、高活力紫杉细胞的获得
紫杉基本培养基：MgSO4·7H2O 250mg，KNO3 250mg，KH2PO4 375mg，Ca(NO3)2·4H2O500mg，FeSO4 27.8mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 37.2mg，MnSO4·H2O 1mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，KI 0.25mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO30.25mg，盐酸噻胺10mg，Choline 0.5mg，L-Cysteine 10mg，H2NCONH2200mg，Inositol 100mg，用水定容至1L，pH 5.8。
愈伤组织诱导培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤5mg/L，α-萘乙酸5mg/L，蔗糖50g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.8。
继代培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤4mg/L，α-萘乙酸4mg/L，蔗糖30g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.8。
扩增培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤2mg/L，α-萘乙酸2mg/L，蔗糖50g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.8。
上述培养基的灭菌条件均为：在115-120℃、0.1-0.15MPa压力下灭菌15-20min。
现用对本发明的方法对南方红豆杉(T.mairei S.Y.Hu)进行体外培养，并从中筛选出高活力细胞，具体方法包括以下步骤：
1)外植体的消毒灭菌
以南方红豆杉的幼叶为外植体，在无菌条件下，将其用体积百分浓度为70％的乙醇消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中杀菌20分钟，最后用无菌水冲洗4次，每次20s，以将表面残留的次氯酸钠溶液冲洗干净。
2)诱导愈伤组织
在无菌条件下，将步骤1)经表面杀菌的幼叶切成长度约为2mm的小段后接种于愈伤组织诱导培养基上，在25℃、3000LX、14小时光照/天条件下诱导愈伤组织，约3-5周后白色或绿色愈伤组织长出。
3)继代培养及初级高产细胞株的获得
将愈伤组织接种于继代培养基上在20℃、避光条件下进行继代培养，培养周期为3-4周，继代4次后，当愈伤组织变得结构疏松，生长速度趋于稳定以后，即可根据愈伤组织的株系不同，分别用常规方法进行生物量和紫杉醇含量检测，并根据检测结果筛选出生长速度快，紫杉醇含量在0.006％以上的初级高产细胞株。
4)多倍体高产细胞株的筛选
先将初级高产细胞株接种于添加有10-70mg/L的秋水仙碱的紫杉基本培养基中在20℃、避光、100rpm下振荡培养8天，再将所述经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞株再次接种于继代培养基上继代培养4次，再经生物量和紫杉醇含量检测筛选出生长速度快，生物量积累稳定，紫杉醇含量在0.01％以上的高产细胞株，该细胞系为混合多倍体细胞系，可通过染色体染色进行鉴定。
5)扩增培养
将多倍体高产细胞株接种于扩增培养基上在22℃、避光条件下培养4周，得到大量高活力紫杉细胞，细胞量达300g/L。
实施例3、高活力紫杉细胞的获得
紫杉基本培养基：MgSO4·7H2O 200mg，KNO3300mg，KH2PO4350mg，Ca(NO3)2·4H2O550mg，FeSO429mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 36mg，MnSO4·H2O 0.8mg，ZnSO4·7H2O 0.4mg，KI 0.2mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，H3BO3 0.3mg，盐酸噻胺8mg，Choline 0.4mg，L-半胱氨酸8mg，H2NCONH2 180mg，Inositol 120mg，用水定容至1L，pH 5.6。
愈伤组织诱导培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤5mg/L，α-萘乙酸5mg/L，蔗糖50g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.6。
继代培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤4mg/L，α-萘乙酸4mg/L，蔗糖30g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.6。
扩增培养基：在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤2mg/L，α-萘乙酸2mg/L，蔗糖50g/L，冷凝胶2g/L，pH 5.6。
上述培养基的灭菌条件均为：在115-120℃、0.1-0.15MPa压力下灭菌15-20min。
现用对本发明的方法对中国红豆杉(Taxus chinensis)进行体外培养，并从中筛选出高活力细胞，具体方法包括以下步骤：
1)外植体的消毒灭菌
以中国红豆杉的幼叶为外植体，在无菌条件下，将其用体积百分浓度为70％的乙醇消毒40s，再将其置于质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中杀菌18分钟，最后用无菌水冲洗4次，每次20s，以将表面残留的次氯酸钠溶液冲洗干净。
2)诱导愈伤组织
在无菌条件下，将步骤1)经表面杀菌的幼叶切成长度约为2mm的小段后接种于愈伤组织诱导培养基上，在20℃、3000LX、15小时光照/天条件下诱导愈伤组织，约3-5周后白色或绿色愈伤组织长出。
3)继代培养及初级高产细胞株的获得
将愈伤组织接种于继代培养基上在25℃、避光条件下进行继代培养，培养周期为3-4周，继代4次后，当愈伤组织变得结构疏松，生长速度趋于稳定以后，即可根据愈伤组织的株系不同，分别用常规方法进行生物量和紫杉醇含量检测，并根据检测结果筛选出生长速度快，紫杉醇含量在0.006％以上的初级高产细胞株。
4)多倍体高产细胞株的筛选
先将初级高产细胞株接种于添加有10-70mg/L的秋水仙碱的紫杉基本培养基中在25℃、避光、120rpm下振荡培养8天，再将所述经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞株再次接种于继代培养基上继代培养3次，再经生物量和紫杉醇含量检测筛选出生长速度快，生物量积累稳定，紫杉醇含量在0.01％以上的高产细胞株，该细胞系为混合多倍体细胞系，可通过染色体染色进行鉴定。
5)扩增培养
将多倍体高产细胞株接种于扩增培养基上在25℃、避光条件下培养3周，得到大量高活力紫杉细胞，细胞量达300g/L。
Claims (8)
1、用于培养紫杉细胞的基本培养基，其配方为：MgSO4·7H2O 200-300mg，KNO3200-300mg，KH2PO4350-400mg，Ca(NO3)2·4H2O 450-550mg，FeSO427-29mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 36-38mg，MnSO4·H2O 0.8-1.2mg，ZnSO4·7H2O 0.4-0.6mg，KI0.2-0.3mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 0.2-0.3mg，盐酸噻胺8-12mg，氯化胆碱0.4-0.6mg，L-半胱氨酸8-12mg，H2NCONH2 180-220mg，肌醇80-120mg，用水定容至1L，pH 5.6-5.8。
2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：MgSO4·7H2O250mg，KNO3 250mg，KH2PO4 375mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，FeSO4 27.8mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 37.2mg，MnSO4·H2O 1mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，KI 0.25mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO3 0.25mg，盐酸噻胺10mg，氯化胆碱0.5mg，L-半胱氨酸10mg，H2NCONH2200mg，肌醇100mg，用水定容至1L，pH 5.8。
3、一种紫杉细胞的培养方法，包括以下步骤：
1)以经表面杀菌的幼茎或叶为外植体，切成小段后，将其接种于愈伤组织诱导培养基上在20-25℃、1500-3000LX、14-16小时光照/天条件下诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在权利要求1或2所述的基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1-5mg/L，α-萘乙酸0.1-5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-50g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶1.8-2g/L或琼脂粉5-8g/L；
2)将愈伤组织接种于继代培养基上在20-25℃、避光条件下进行继代培养，并从中筛选出紫杉醇含量在0.006％以上的初级高产细胞株；所述继代培养基是在权利要求1或2所述的基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1-5mg/L，α-萘乙酸0.1-5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-30g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶1.8-2g/L；
3)先将初级高产细胞株接种于添加有10-70mg/L的秋水仙碱的权利要求1或2所述的基本培养基中在20-25℃、避光条件下振荡培养，再将所述经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞株再次接种于继代培养基上进行继代培养，并从中筛选出紫杉醇含量在0.01％以上的多倍体高产细胞株；
4)将多倍体高产细胞株接种于扩增培养基上在20-25℃、避光条件下进行扩增培养，得到大量高活力紫杉细胞；所述扩增培养基是在权利要求1或2所述的基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.5-2mg/L，α-萘乙酸0.5-2mg/L，蔗糖或葡萄糖30-50g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶1.8-2g/L。
4、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中对外植体进行表面杀菌的方法为：在无菌条件下，先将幼茎或叶用体积百分浓度为70％的乙醇消毒30-50s，再将其置于质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中杀菌15-20分钟，最后用无菌水冲洗2-4次，每次15-30s；接种前将外植体切成长度为1-2mm的小段；愈伤组织的诱导时间为3-5周。
5、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中的继代培养周期为3-4周，至少继代3次。
6、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤3)中用含10-70mg/L不同浓度秋水仙碱的紫杉基本培养基对初级高产细胞株进行振荡培养时的振速为80-120rpm，培养时间为6-8天；经过不同浓度秋水仙碱处理的初级高产细胞的继代培养条件与步骤2)中的继代培养条件相同，周期为3-4周，共继代3-4次。
7、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤4)中的扩增培养时间为3-4周。
8、用权利要求3-7任一项所述培养方法获得的高活力紫杉细胞。
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