CN1146488A - 由红豆杉培养细胞生产紫杉醇的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从红豆杉细胞中生产紫杉醇的工艺。采用红豆杉科植物进行愈伤组织和细胞悬浮培养，继而进行细胞大规模培养，特征是在B5培养基中附加激素2，4-D和KT条件下进行红豆杉单细胞克隆培养，获取紫杉醇含量达0.2％以上的细胞系分离纯化紫杉醇。解决了从植物树皮中生产紫杉醇工艺的资源奇缺、含量极低、污染环境、提取分离困难的缺点；与已有细胞培养生产紫杉醇工艺相比，具有易操作、降低成本、提高了目的次级产物的含量的优点。

Description

红豆杉培养细胞生产紫杉醇工艺

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及红豆杉科植物单细胞克隆培养范畴，具体地说涉及由红豆杉科植物单细胞克隆培养和发酵培养生产紫杉醇的工艺。

紫杉醇是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的抗癌天然产物，国外已用作为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的新药。目前紫杉醇的生产方法主要是通过从天然红豆杉(如太平洋紫杉Taxus brevijalia)的树皮获得。紫杉醇的含量极低(＜0.02％)。这种生产途径会导致药源红豆杉的毁耗，并破坏生态环境。红豆杉科植物资源奇缺，因此美、意、法中等国政府已下令禁止砍伐红豆杉，造成紫杉醇价格昂贵供不应求。为寻求大量生产紫杉醇的途径，各国竭力采用各种方法，力图从根本上解决药源问题。如NCI和BMS公司已着手进行生产紫杉醇的资源红豆杉属(Taxus)植物遗传学、资源学研究，进行细胞培养、生物合成，半合成和全合成，分析和分离方法改进；制剂，选择，药物代谢、抗药性及影响紫杉醇与微管结合的因素等方面的研究，但均处于初期阶段。此外1995年初美国R.A.Holton教授以及K.C.Nicolaou教授等成功地合成了紫杉醇，但合成工艺相当繁硕，即使得到改进，由于生产成本原因也难于用于工业化生产。

此外美国A.Stierle等1994年发现在附生于红豆杉树皮的真菌里含有紫杉醇，但就目前技术水平而言，从真菌培养液中仅能获得24-50纳克每升的紫杉醇，离工业化生产需求的达到毫克级每升还需解决许多技术关键问题。立足从红豆杉栽培方面来解决资源问题进行的扞插繁殖，选育优良品系等裁培工作，尽管缩短了植物从种子到苗期的时间，但仍要5年以上才能收获，而且要占用很多土地。由于采用上述方法，在今后一段时间紫杉醇的供给仍显很困难。国内、国外近年来均开展了红豆杉细胞工程学的工作，利用红豆杉培养细胞作为提取紫杉醇的原料来源，以弥补红豆杉资源的不足，保护红豆杉野生资源及其生存的生态环境。

迄今，国内外已对10种红豆杉植物的细胞与组织培养进行了研究(包括胚培养和胚状体培养)。例如日本钢铁公司从短叶红豆杉(T.brevifolia)和东北红豆杉(T.cuspidate)中诱导获得愈伤组织，筛选得到的细胞4周后增殖5倍，紫杉醇含量为0.05％，比原植物树皮含量高出10倍；Ketchum等从6种红豆属植物中进行愈伤组织诱导，获得37个能生产紫杉醇的细胞株，其中2个细胞系在21天培养中生产紫杉醇20mg/l；中国王君健等采用2升有效体积的搅拌式反应器在适宜条件下进行两步法培养25-30天，细胞生物量增至4倍，细胞培养物中紫杉醇含量达细胞干重0.07％。

虽然经上述研究，利用愈伤组织的变异和异质性已得到一些紫杉醇含量比原植物高出10倍的细胞无性系，但还没有见到利用诸如平板培养等先进手段来筛选高产培养细胞中紫杉醇高产细胞系的报道；而且目前国际上培养规模最大的仅达5升，培养细胞的生长速度和紫杉醇的含量均较低，离红豆杉培养细胞的工业化生产还有相当一段距离。进一步筛选紫杉醇高产稳定细胞系，建立从培养细胞分离纯化生产紫杉醇的全套工艺是本发明的任务。与此相适应，本发明通过提供高产稳定的优良细胞系以及生产该细胞系所需的最佳细胞培养系统的培养基和为进一步实现工业化生产必需的生物反应器的理想放大，提供规模达10升细胞大量培养的优化培养系统，以实现本发明的目的：提供一种利用红豆杉细胞单克隆培养生产紫杉醇的工艺。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

采用云南红豆杉(Taxus Yunnanensis)，红豆杉(T.Chinensis)、欧州红豆杉(T.baccata)植物外植体进行愈伤组织和细胞悬浮培养，诱导出的愈伤组织克隆单独继代培养并扩大，待各克隆长成较大的愈伤组织团后进行各克隆之间的细胞生长及紫杉醇的含量测定，淘汰不含紫杉醇的克隆，筛选出高产紫杉醇细胞克隆进行连续继代培养，筛选得到高产稳定的紫杉醇细胞系。然后从培养细胞中分离纯化并经反复结晶得到紫杉醇品体。

为了获得更好效果，可在愈伤组织培养基中添加如椰子汁或水解酪蛋白的有机附加物。

本发明指出的最佳培养条件是在B5培养基中附加10mg/l 2，4-D＋0.0lmg/l KT＋5.0mg/l人参寡糖素。

本发明提供的细胞大量培养工艺为采用大规模发酵罐，培养20-25天，培养温度26±1℃，暗培养，采用上述的最佳培养条件，培养时定时监测培养液的PH值及糖的利用率情况。培养细胞的生长率达到0.4克/l.d(即12.0g/L)，培养细胞中紫杉醇的含量达到0.12％。

为了更好地说明本发明的技术方案和有益效果，下面将简要阐述本发明具体的技术路线和达到的结果。

1、筛选出最佳的愈伤组织培养无性系及培养系统：采用云南红豆杉(Taxus Yunnanensis)、红豆杉(T.Chi-nensis)、欧州红豆杉(T.baccata)植物外植体的愈伤组织诱导、培养研究，筛选到的云南红豆杉愈伤组织为主要试验材料的愈伤组织无性系，生长速率达9.00g/L/月。通过比较不同培养基、培养基中不同激素种类、不同激素浓度以及不同激素配比对愈伤组织诱导及培养的影响，并通过研究愈伤组织的生长周期以及有机附加物和一些物理因素对愈伤组织生长的影响，建立起愈伤组织的最佳培养系统。

2、建立起红豆杉细胞悬浮培养的最佳条件：以上述红豆杉的培养细胞为实验材料进行细胞悬浮培养，通过对不同激素浓度、不同接种量、有机附加物、生长过程、碳源、氮源、加入寡糖素诱导因子以及代谢抑制剂等的研制，得出最佳培养条件为在B5培养基中附加1.0mg/l 2.4-D＋0.0lmg/l KT＋5.0mg/l人参寡糖素，在此条件下悬浮培养细胞的生长速率达0.35g/l.d即10.5g/L/月，通过HPLC测定，培养细胞中紫杉醇含量已达0.1％以上。

3、培养高产稳定的紫杉醇细胞系：利用愈伤组织的筛选和红豆杉悬浮培养细胞，采用单克隆培养技术，对紫杉醇含量较高的变异体进行稳定性试验，经过近20代继代培养得到高产稳定的紫杉醇细胞系，从第10代开始合成紫杉醇能力趋于稳定，保持高产性能，紫杉醇含量达0.2％以上，生长速率达10g/L/月，紫杉醇含量为野生植物枝叶的100倍，树皮的40倍，为愈伤组织无性系的15倍。

4、细胞大量培养及培养细胞中紫杉醇的分离纯化及结构鉴定：对培养细胞进行大规模的大量培养，采用机械搅拌式发酵罐，培养20-25天，培养温度为26±1℃，暗培养，培养基与悬浮培养的相同。培养细胞生长率达0.4g/l.d(即12.0g/L/月)，培养细胞紫杉醇含量达0.12％(其中培养液中紫杉醇含量占40％)。从培养细胞中分离纯化并经反复结晶得到紫杉醇晶体，经检测为高纯度(＞98％)的紫杉醇。研制成功从培养细胞分离纯化生产紫杉醇的全套工艺。

本发明在进行上述4方面的工艺研制中，还提供了一套微量测定培养细胞中紫杉醇的HPLC方法。即采用HPLC色谱仪，Spherisorb(10μm，4×250mm)分析柱，检测波长228nm，以甲醇∶乙腈∶水(2∶3∶8)为流动相，紫杉醇的峰面积与浓度在进样量低于10.0μg的范围内呈通过原点的线性关系，相关系数为γ＝0.999，回归方程Y＝4.70X-310，回收率平均为98.69±1.90％，变异系数为1.93％。并用该方法对1000余个样品反复检测，其最低检出量可达9ng。证实了这套微量测定技术简单、快速、准确并且稳定可靠。

本发明所用的人参寡糖素其制备工艺为：采用人参根，用常规植物组织培养方法，诱导出愈伤组织，形成细胞系，将人参细胞通过愈伤组织继代培养和悬浮培养得到的细胞进行常规预处理，冰冻干燥得细胞壁干物质，然后进行酸水解，采用0.7-1N HCl在90℃-98℃温度下反应1-1.5小时，即可得到人参寡糖素。

通过本发明的上述技术方案和路线得出的生产工艺与现有技术相比，具有如下有益效果：

1、本发明所提供的红豆杉单细胞克隆的平板培养技术具有与已有技术不同的优点，方法易操作，容易得到优良稳定的细胞系，降低了成本，提高了目的次级产物的含量，比已有技术均有明显增高。

2、由本发明的单细胞克隆的平板培养获得的高度稳产的优良细胞系，其紫杉醇含量达0.2％以上，是天然红豆杉植物的100倍，其生长速率达12g/L。

3、本发明的细胞大量培养的规模目前已达10升，是迄今规模最大的培养，建成的细胞大量(发酵)培养的优化培养系统的细胞生长和紫杉醇含量均比愈伤组织和组胞悬浮培养高且稳定。

4、本发明提供了最佳愈伤组织和细胞悬浮培养系统，提供了最佳的培养基、有机添加剂、光、温、诱导子、前体、代谢支路抑制剂，C/N比的配比和调控、易于培养出优良高气稳定的细胞系。尤其是提供的加入寡糖素诱导子使细胞生长增加了36.7％，使紫杉醇含量增加了13倍。

5、本发明提供的从培养细胞分离纯化生产紫杉醇的工艺稳定可靠，生产出高纯度的紫杉醇(纯度＞98％，最高达99.9％)。

由本发明提供的从培养细胞中生产的紫杉醇，经美国等五个法定检测单位鉴定结构，其结构与从天然红豆杉植物中分离出的紫杉醇一致，TLC与HPLC检测均为一个斑点或一个单峰，纯度超过98％，此外对从本发明培养细胞中获得的紫杉醇结晶进行三种不同类型癌细胞株——KB细胞，用EVB转化的人淋巴母细胞，胃癌细胞系的体外抗癌药理活性试验，与从天然植物中分离到的紫杉醇比较，证实本发明培养细胞生产的紫杉醇具有强的抑制癌细胞生长作用，与标准样品紫杉醇的药理试验结果一致。

附图1为云南红豆杉愈伤组织中的紫杉醇含量图

附图2为云南红豆杉细胞悬浮培养中培养基的紫杉醇含量图。

附图3为云南红豆杉细胞悬浮培养细胞中紫杉醇含量图。

附图3为云南红豆杉高产细胞系TY-208 C16代的培养基中的紫杉醇含量图。

附图4为云南红豆杉高产细胞系TY-208 C16代的培养其中的紫杉醇含量图。

附图5本发明云南红豆杉细胞系TY-208 C16代的CHCl₃提取物紫杉醇含量图。

附图6为本发明超微量测定培养细胞中紫杉醇的HPLC技术示意图。

附图7为本发明培养细胞生产的紫杉醇的含量图。

附图8为与附图7对照的从天然植物提取的紫杉醇含量图。

附图9为本发明培养细胞生产的紫杉醇的高分辩质谱图(FAB-MS谱)。

附图10为本发明培养细胞生产的紫杉醇的碳谱图(¹³C-NMR谱)。

下面将结合附图用本发明的具体实施例更深入地阐明本发明的技术方案，但本发明的技术方案不局限于此，任何本领域的普通技术人员不需经创造性劳动而加以改变就可得出的技术方案和结果，均应认为属于本发明的技术方案范畴。

采用云南红豆杉(Taxus Yunnanensis)外植体进行愈伤组织诱导培养，在MS培养基中附加适量浓度(1.0-3.0mg/l)的2，4-D或含2.4-D激素组合，接种三周开始形成愈伤组织克隆，诱导率达100％。转入B5培养基中附加与诱导培养基相近浓度的激素条件下，经12代继代培养，在继代培养时愈伤组织克隆均单独继代培养并扩大，克隆间不相互交叉。愈伤组织被驯化形成了生长及性状较一致并稳定的无性系，生长速率达0.3g/l.d(即9.0g/L)，紫杉醇的含量达0.014％，愈伤组织的生长周期35天左右。于培养基中添加有机附加物(如10％椰子汁或0.1％水解酪蛋白等)，同时在黑暗中培养温度降至22℃，使愈伤组织生产更快，旺盛生长期更长。平板细胞克隆在培养皿中三周左右即可长出，继续培养两周后转移到新鲜培养基中继续培养，继代至第10代后对各克隆进行细胞生长及紫杉醇的含量测定，对紫杉醇含量较高的克隆(＞0.02％)进行继代培养和稳定性测试，培养出一个高产紫杉醇性能稳定的细胞克隆系--命名为TY-208，该克隆系从第10代开始合成紫杉醇，22代继代培养中，平均紫杉醇含量达0.214％，生长速率达0.33g/l.d

利用云南红豆杉的培养细胞为材料进行悬浮培养，培养基及激素组合与愈伤组织的生长相似，浓度可适当降低，如2.4-D浓度降到1-1.5g/l，蔗糖浓度降至20g/l。在悬浮培养加入寡糖素诱导子，采用人参寡糖素5mg/L，大大提高了细胞的生长率(比对照组增加36.7％)以及紫杉醇含量(比对照组增加3倍)，同时使紫杉醇分泌到培养基中的比例增加(表1)表1    人参寡糖素对云南红豆杉培养细胞的影响

人参寡糖素(mg/l)	生长率(g/ld)	紫杉醇含量(％)
					培养细胞中	培养基中	合计
		1.05.010.0对照	0.320.350.270.26	0.0320.0380.0220.019				0.0150.0410.0030.007	0.0470.0790.0250.026

云南红豆杉悬浮培养的细胞的生长周期为30天左右，悬浮培养的最佳培养条件为：在B5培养基中附加1.0mg/l 2，4-D＋0.01mg/l KT＋5.0mg/l人参寡糖素，培养细胞生长速率达0.35g/l.d(即10.5g/L)。通过HPLC测定，培养细胞中紫杉醇含量达0.1％以上。

在进行上述云南红豆杉愈伤组织和细胞悬浮培养的基础上，对培养细胞进行10升规模的大量(发酵)培养，采用日本丸菱公司生产的MD-500-10L型机械搅拌式发醇罐，总容量为10L，工作体积8升，培养时间25天，通气量0.6-0.8VVm，搅拌速度50-60rpm，培养温度26±1℃，暗培养，培养基与悬浮培养相同。培养细胞生长率达0.4g/l.d(即12.0g/L)，培养细胞中紫杉醇的含量达0.12％。

本发明通过大量培养生产紫杉醇，可根据需要随时进行。例如本发明迄今已进行四批细胞大量培养，生产出1.5g纯度＞98％的紫杉醇。

本发明采用LC-3AHPC色谱仪，Spherisorb C6H5(10μm，4×250nm)分析柱，检测波长228nm，以甲醇∶乙腈∶水(2∶3∶8)为流动相，研究出超微量测定培养细胞中紫杉醇的HPLC方法(附图6)，紫杉醇的峰面积与浓度在进样量低于10.0μg范围呈通过原点的线性关系，相关系数为r＝0.999，回归方程Y＝4170X-310，回收率平均为98.69±1.90％，变异系数为1.93％，其最低检测量可达9ng。本发明已进行1000个样品的反复检测，证实该微量测定技术简单、快速、明确稳定可靠。

从本发明云南红豆杉培养细胞中分离纯化并经反复结晶得到紫杉醇晶体，经测定，熔点mp.213-215℃，分子式C47H51O14N，旋光〔α〕_D ^-20(C0.18，MeOH)，分子量M＝853，经光谱鉴定为紫杉醇(Taxol)，它的FAB-MS以及¹³CNMR数据见附图9和附图10。与标准对照品紫杉醇一致，TLC与HPLC检测均为一个斑点或一个单峰，纯度超过98％。

本发明同时还采用红豆杉(T.Chinensis)、欧州红豆杉(T.baccata)为材料生产紫杉醇，生产工艺与实施例1大同小异。

至此，已对本发明做了全面的说明，本领域技术人员可以想到，用较大范围内的任何等同的技术方案，操作方式其它参数均可实施本发明，但均认为属于不超出本发明的实质性技术发明范畴。

Claims (9)

1、红豆杉培养细胞生产紫杉醇工艺、包括采用红豆杉科植物进行愈伤组织和细胞悬浮培养，继而进行细胞大规模培养，其特征在于在B5培养基中附加激素2，4-D和KT条件下进行红豆杉单细胞克隆培养，获取紫杉醇含量达0.2％以上的细胞系分离纯化紫杉醇。

2、如权利要求1所述的工艺，其特征在于从红豆杉外植体诱导出愈伤组织克隆单独继代培养并扩大，克隆之间不相互交叉，测定各克隆之间细胞生长速率及紫杉醇含量，淘汰不含紫杉醇的克隆，筛选出高产紫杉醇细胞克隆连续继代培养，10代后用高产稳定的紫杉醇细胞系分离纯化生产紫杉醇。

3、如权利要求1所述的工艺，其特征在于原材料用云南红豆杉(Taxus Yunnanesis)、红豆杉(T.Chinensis)、欧州红豆杉(T.baccata)。

4、如权利要求1或2或3所述的工艺，其特征在于培养基中添加4-6mg/l寡糖素。

5、如权利要求1或2或3所述的工艺，其特征在于愈伤组织培养基中添加如椰子汁或水解酪蛋白的有机附加物。

6、如权利要求1或2或3所述的工艺，其特征在于优选培养条件中包括B5培养基中附加1.0-2.0mg/l 2，4-D，0.01-0.05mg/l KT，4-6mg/l寡糖素。

7、如权利要求6所述的工艺，其特征在于优选附加1.0mg/l2，4-D，0.01mg/l KT、5.0mg/l人参寡糖素。

8、如权利要求1所述的工艺，其特征在于在权利要求6所述的优选培养条件下进行红豆杉细胞大规模培养，包括用10L-500L发酵罐培养20-25天，培养温度26±1℃，暗培养。

9、如权利要求8所述的工艺，其特征在于优选用10L发酵罐培养20～25天。

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