KR100428634B1

KR100428634B1 - 진균을 이용한 탁솔의 제조

Info

Publication number: KR100428634B1
Application number: KR1019970032358A
Authority: KR
Inventors: 송성원; 심성보; 양재권
Original assignee: 주식회사 코오롱
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2004-11-03
Also published as: KR19990009824A; WO1999002648A1

Abstract

탁솔 및 탁산을 생성하는, 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균 및 상기 진균의 분리 방법, 탁솔 및 탁산 생산능에 대한 스크리닝(screening) 방법을 이용하면 탁솔 및 탁산을 현저히 높은 수율로 간편하게 제조할 수 있다.

Description

진균을 이용한 탁솔의 제조

[산업상 이용 분야]

본 발명은 진균을 이용한 탁솔의 제조에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탁수스(Taxus) 속 또는 주목 나무 또는 상기 나무가 자생하는 토양으로부터 얻어지며 탁솔 및 탁산을 생성하는, 페스탈로티아 혜테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로명명되는 진균 및 상기 진균의 분리 방법과 탁솔 및 탁산 생산능에 대한 스크리닝(screening) 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 진균을 이용하는 탁솔 및 탁산의 제조방법에 관한 것이다.

탁솔은 뛰어난 항암 활성을 가지는 물질로, 백혈병 치료제 및 항암제로서의 용도가 알려져 있는 물질이다.

[종래기술]

탁솔(taxol)은 주목 나무 수피에 함유되어 있는 테르페노이드(terpenoid) 계열의 화합물로서, 그 구조는 하기한 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

상기한 탁솔은 백혈병 치료제 및 항암제로 미합중국 식품 의약청의 승인을 받은 화합물로서, 특히 유방암 및 난소암에 대한 항암 활성이 매우 뛰어난 화합물이다.

상기한 탁솔의 구조, 백혈병 치료제 및 항암제로 사용할 수 있는 용도는 와니(Wani) 등에 의한 Journal of the American Chemical Society, May 1971, Vol93, No 9, 페이지 2325∼2327에 기재된 바 있다. 또한, 상기한 문헌은 탁솔의 알콜 추출법에 대하여서도 기재하고 있다.

상기한 바와 같이, 탁솔은 주목 나무의 수피로부터 추출될 수 있으나, 이로부터 얻어지는 수율은 수피 1kg 당 약 100mg 이하로 극히 저조할 뿐 아니라, 환경 파괴의 우려가 있고, 그 생산이 주목 나무의 성장에 전적으로 의존하게 되어 그 공급이 원활치 못한 문제점이 있다.

따라서, 미합중국 특허 제4,924,011호는 탁솔을 제조하기 위한 화학적 방법을 개시하고 있으나, 상기한 화학적 방법은 복잡한 과정을 요구하므로 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.

한편, 대한민국에 자생하고 있는 주목 나무(Taxus cuspidata) 종자의 씨눈에는 지금까지 보고된 바 있는 주목 나무 수피 내 탁솔 함유량의 최대치보다 200배 이상 많은 양의 탁솔이 함유되어 있다고 보고된 바 있다.

최근, PTC/US 93/03416에서 미국 몬타나(Montana) 대학 식물 병리학자인 안드레아 스티얼(Anderea stierle) 등은 주목 나무의 내수피(inner bark)로부터 탁솔을 생산하는 곰팡이인 탁소마이세스 안드레아나(Taxomyces andreanae)를 분리하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기한 곰팡이에서 생산되는 탁솔은 1리터 당 1∼2 마이크로그램의 미량에 불과하다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 탁솔 및 탁산을 현저히 높은 수율로 간편하게 생산할 수 있는,탁수스(Taxus) 속 나무 또는 상기 나무가 자생하는 토양으로부터 얻어지며 탁솔 및 탁산을 생성하는, 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균, 상기 진균의 분리방법 및 상기 진균을 이용하는 탁솔 및 탁산의 제조 방법을 제공하는 것이다.

도 1a는 본 발명의 방법에 따라 제조한 탁솔의 HPLC 분석 그래프이고,

도 1b는 탁솔 표준품의 HPLC 분석 그래프이고,

도 2는 본 발명의 방법에 따라 제조한 탁솔의 질량 분석기를 이용한 질량 스펙트럼이고,

도 3a는 본 발명의 방법에 따라 분리한 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis) 균사의 증식 상태의 앞면 사진이고,

도 3b는 본 발명의 방법에 따라 분리한 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis) 균사의 증식 상태를 나타내는 이면 사진이다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탁솔 및 탁산을 생성하는, 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 제공한다.

상기 진균은 탁수스(Taxus) 속 나무 또는 상기 나무가 자생하는 토양으로부터 얻어지는 것이 바람직하다.

상기 토양은 주목 나무의 자연 발생 군락지에서 탁수스 속 나무 뿌리를 중심으로 반경 1m 이내의 습기가 많은 토양으로부터 채취되는 것이 바람직하다.

본 발명은,

(1) 탁수스 속 나무가 자생하고 있는 토양을 일부 취하고;

(2) 상기 토양을 50∼95% 알콜에 침적시키고, 그 침적물을 여과하여 잔사를 얻고;

(3) 상기 잔사에 멸균 식염수를 가하여 진탕하여 진탕액을 만들고;

(4) 상기 진탕액의 상등액 일부를 진균이 증식할 때까지 아가(agar) 배지 상에서 2∼5일 간 증식시키고;

(5) 상기 증식 균사를 진균 실험용 증식 배지로 옮겨 진균 배양물을 증식시키고;

(6) 상기 진균 배양물을 함유하는 배지의 적어도 일부를 분리하고, 균사를 완전히 분쇄하여 얻은 혼합물에 액체 크로마토그래피 용매를 첨가하고;

(7) 상기 용매 중에 함유되어 있는 진균 배양물의 크로마토그래프를 얻고;

(8) 상기 배양물의 일부를 취하여 탁산, 탁솔 및 바카딘(baccatin)을 각각 정량하고, 크로마토그래프를 탁솔, 바카딘 및 세팔로만닌(cephalomannine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 탁산 표준물과 비교하는 단계;

를 포함하는 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 분리하는 방법을 제공한다.

상기한 방법은 단계(4) 다음으로, (4A) 상기 증식 균사를 균사 배양용 아가상에 놓고, 단일종이 형성될 때까지 균사 배양용 아가 상으로 이식하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

상기한 방법은 단계(8) 다음으로, (9) 탁솔을 생성하지 않는 배양물을 제거하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한,

(1) 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 진균의 증식이 일어나게 할 수 있는 영양 배지에 노출시키고;

(2) 상기 진균이 증식 및 복제할 수 있는 조건을 포함한, 진균을 함유하는 배지를 위한 배양 조건을 제공하고;

(3) 상기 배양 배지 또는 진균으로부터 목적으로 하는 탁산을 분리하거나 농축하는 과정:

을 포함하는 탁산을 제조하는 방법을 제공한다.

상기한 방법에서 상기한 탁산은 탁솔인 것이 바람직하다.

상기한 영양 배지는 벤조산, 벤조산 대사 물질 전구체 및 소디움 벤조에이트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

주목 나무가 자생하는 토양으로부터 주목 나무 뿌리를 중심으로 반경 1m 내의 토양을 채취하여 50∼95% 에탄올로 10~30초 간 살균 처리하고 잔사를 여과한후, 멸균 식염수를 가하여 진탕하여 진탕액을 얻는다. 상기 진탕액의 상등액 일부를 취하여 아가 배지상에 도포한 후 15℃, 20℃, 25℃의 항온 배양기에서 12시간 주기의 명암(明暗) 조건과 24시간의 암(暗) 조건에서 각각 배양하여 2∼4일 간 균사를 증식시킨다. 이 경우, 이물질(異物質)의 오염을 극소화한다.

분리된 곰팡이가 단일종 형태로 얻어질 때까지 연속 배양하여 단일종을 얻고, 이를 1 이상의 실험 배지에 옮긴다. 이때 사용되는 배지는 사브로드 덱스트로스 한천(Sabouraud dextrose agar, DIFCO 0382-17-9) 배지, 포테이토 덱스토로스 한천(Potato dextrose agar, DIFCO 0013-17-6) 배지와, 자펙 독스 한천(Czapec dox agar, DIFCO) 배지이다.

상기 곰팡이는 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균이다.

상기 진균은 1997년 6월 18일에, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 한국과학기술원 부설 생명공학연구소에 기탁되어 수탁번호 제KCTC 0340BP호를 부여받았다.

상기 진균이 탁솔을 생성하는지 확인하기 위하여, 아미노산과 소디움 벤조에이트가 함유된 생장 배지에서 진탕 배양기를 이용하여 2주 간 배양한다. 이 경우, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃의 다양한 온도에서 50rpm, 100rpm, 150rpm, 200rpm, 250rpm의 다양한 진탕 주기로 배양한다.

배양이 끝나면, 배양액 중의 균사를 워링 블랜더(waring blender)를 사용하여 완전히 분쇄한 후, 디클로로메탄 용매를 사용하여 추출한다. 이 때, 디클로로메탄은 균사 배양액의 부피와 같은 양으로 사용한다. 이 조작을 1회에서 3회까지 반복한다. 형성된 디클로로메탄층을 25℃∼35℃의 저온에서 진공 감압 농축한다.

상기 농축액을 박층 크로마토그래피법을 사용하여 탁솔, 바카딘 및 세팔로만닌의 표준물을 비교 물질로 하여 확인한다. 이때, 고정상으로 실리카겔 5×10cm 플레이트를 사용하며, 이동상으로 클로로포름 아세토니트릴 7:3 v/v 및 헥산 에틸아세테이트 1:2 v/v를 사용한다. 상기 탁솔, 바카딘 및 세팔로만닌은 254nm의 자외선 단파광을 흡수하고, 바닐린-황산 분무액을 제조하여 분무하면 푸른색으로 발색된 후 회색으로 변색된다.

또한, 상기한 방법으로 얻은 곰팡이 추출물이 탁솔을 함유하고 있는지 확인하기 위하여, 상기 농축액을 고성능 액체 크로마토그래피급의 메탄올로 용해하여 고성능 액체 크로마토그래피법으로 분석한 후, 표준품의 피크와 비교하여 동일한 머무름 시간(retention time)을 가지는지 확인한다.

고성능 액체 크로마토그래피법의 분석 결과, 상기 곰팡이 추출물이 탁솔인 것으로 보이면, 상기 분쇄 배양액을 디클로로메탄으로 3회 추출하여 상기한 온도에서 감압 농축하고, 남은 잔사를 하기한 표 1의 조성을 갖는 20% 메탄올 완충 수용액에 용해한 후, 일정량을 취하여 효소 면역 분석법(enzyme immunoassay analysis)을 행한다. 상기한 효소 면역 분석법을 행하기 위하여 하와이 바이오테크놀로지 그룹사(Hawaii Biotechnology Group Inc.)의 정량적 검출을 위한 면역 체계, TA 01(탁산 특이성), TA 02(탁솔 특이성), TA 03(바카딘 특이성) 키트(kit)를 이용하며, 이로써 택솔 및 그 유도체를 검정한다.

보다 확실한 검정을 위하여 질량 분석기를 사용한다. 상기 농축액을 고성능 액체크로마토그래피급의 메탄올로 용해하여 머크(Merk)사의 박층 크로마토그래피 플레이트 상에서 헥산 에틸아세테이트 1:2 v/v을 전개 용매로 하여 예비 박층 크로마토그래피를 행한다. 254nm의 단파광을 약하게 흡수하고, 바닐린 황산 분무액과 반응하는 밴드를 플레이트로부터 분리하여, 디메틸렌 클로라이드로 용출시킨다. 상기 용출물을 감압 농축하고 잔류물을 고성능 액체크로마토그래피급 아세토니트릴 용매 1ml에 용해하여 질량 분석기로 측정한다.

또한, 상기한 탁솔 및 탁산이 배양액 자체에 함유된 탁솔 및 탁산이 아님을 증명하기 위하여, E. coli 및 다른 종류의 곰팡이를 동일 조건 하에서 배양하여 동일 실험을 행하였을 경우의 탁솔 및 탁산 존재 여부를 확인한다.

[실시예]

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 설명하기 위한 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

탁수스 속의 나무들이 군집하여 서식하는 장소에서 탁수스 속 나무 뿌리로부터 반경 1m 내의 습기가 많은 토양을 일부 채취하여 70% 에탄올에 30초 동안 침적시켜 기초 멸균하였다. 상기 침적물을 여과하고 잔사를 취한 후, 잔여 에탄올을 제거하기 위하여 멸균 증류수로 2회 세척하고 식염수를 가하여 진탕하였다. 상기 진탕액을 1시간 동안 방치한 후, 상등액 중 100μl를 취하여 사브로드 덱스트로스 한천 배지와 포테이토 덱스트로스 한천배지 상에 고루 도포한 후, 15℃, 20℃, 25℃의 항온기에서 12시간 주기의 명암 조건 및 24 시간의 암 조건에서 각각 배양하였다. 배양 2일후부터 곰팡이가 출현하기 시작하였고, 이 곰팡이를 사브로드 덱스트로스 한천 배지, 포테이토 덱스트로스 한천 배지, 자펙 독스 한천배지 상에 계대 배양하였다. 이후 출현하는 진균을 1개월 간 계속 계대 배양하였다.

상기 진균은 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균으로서, 도 3a와 3b에 나타낸 바와 같이, 백색 균사를 가지고, 포테이토 덱스토로스 한천 배지에서 불규칙적으로 밀집하여 증식한다. 증식된 균사의 이면은 연어살 빛(salmon color)을 띈다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 진균의 포자는 양끝이 가늘어지는 방추형이며, 똑바르거나 약간 곡선 형태이다. 각 포자는 4개의 격막기를 갖는 5개의 세포로 이루어져 있고 3∼5개의 부속사를 갖는다. 중간의 3개 세포는 엷은 갈색을 띄며, 한쪽 끝의 세포는 1개의 부속사를, 다른 한쪽 끝의 세포는 2∼3개의 부속사를 갖는다.

[실시예 2]

1차로 계대 배양한 곰팡이를 대량으로 배양하기 위하여, 생산 배지에서 3∼4일 간 배양한 후, 배양기에 상기 생산 배지를 첨가하여 20일 간 배양하였다. 상기한 생산 배지 조성은 하기와 같았다.

상기한 방법으로 얻어진 배양액을 워링 블렌더를 사용하여 곰팡이 세포를 완전히 분쇄 혼화하고, 분쇄 혼화한 배양 배지와 동량의 디클로로메탄을 첨가하여 수용성 물질과 비수용성 물질을 분리하고 디클로로메탄층을 취하였다. 상기 수용성 물질과 비수용성 물질의 분리 조작을 추가로 2회 반복하였다. 상기의 유기 용매층을 모아 25℃∼35℃의 저온에서 감압 농축하였다. 상기 농축물이 탁솔을 함유하고 있는지를 확인하기 위하여, 탁솔 및 그 유도체를 표준품으로 하여 곰팡이 세포와배양 배지로부터 추출한 물질을 마이크로본다팩 칼럼(μ Bondapak, C18)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석한 후 표준 피크와 비교한 결과 동일한 머무름 시간대인 14분 30초에서 탁솔의 피크가 나타나는 것을 확인하였다(도 1). 상기 고성능 액체크로마토그래피 분석 결과, 곰팡이의 추출물이 탁솔이라고 믿어지지만, 다른 물질일 가능성도 배제할 수 없으므로, 상기 농축액을 하기한 표 1의 조성을 갖는 20% 메탄을 완충 용액 50ml에 용해하여 하와이 바이오테크놀로지 그룹사로부터 구입한 TA 01, TA 02, TA 03 키트를 이용하여 탁솔 및 그 유도체를 검정하였다.

그 결과, 탁솔 표준품과 동일한 경향을 나타내는 것이 확인되었으므로, 곰팡이 균체 및 배양액으로부터 얻어진 추출물이 탁솔 및 그 유도체를 포함하고 있다는 것이 입증되었다. 이 때 생성된 탁솔의 양은 3주 배양 시 1리터 당 30μg으로 측정되었다.

상기 탁솔 및 그 유도체가 배양액 자체에 함유한 탁솔 및 그 유도체가 아님을 증명하기 위하여 E. coli 및 다른 종류의 곰팡이(Mucor hiemalis f. luteus(Linndemann) Schipper)를 상기 방법과 동일 조건 하에서 배양하였으나 모두 탁솔 및 그 유도체를 생산하지 않았다.

상기 농축액을 고성능 액체 크로마토그래피급의 메탄올로 용해하여 머크사의 예비 박층 크로마토그래피 플레이트 상(20×20, 2mm, Merk)에서 헥산 에틸아세테이트 1:2 v/v을 전개 용매로 하여 예비 박층크로마토그래피를 행하였다. 약하게 단파광을 흡수하고 바닐린 황산 분무액과 반응하는 밴드를 플레이트로부터 분리하여 디메틸렌 클로라이드로 용출시키고, 이 용출물을 저온에서 감압 농축하고 잔류물을 고성능 액체 크로마토그래피급 아세토니트릴 용매 1ml에 용해하여 질량 분석기로 측정하였다. 그 결과, 상기 밴드는 854에서 M⁺¹을 나타내고, 주요 피크가 876에서 MNa⁺, 893에서 MK⁺가 나타남으로써 상기 추출물은 탁솔임이 입증되었다(도 2).

상기한 바와 같이, 본 발명에 의한 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균 및 상기 진균의 분리 방법과 탁솔 및 탁산 생산능에 대한 스크리닝 방법을 이용하면 탁솔을 현저히 높은 수율로 간편하게 얻을 수 있게 된다.

Claims

탁솔 및 탁산을 생성하는, 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균.
제1항에 있어서, 상기 진균은 탁수스(Taxus) 속의 나무 또는 상기 나무가 자생하는 토양으로부터 얻어지는 진균.
(1) 탁수스 속의 나무들이 자라고 있는 토양을 일부 취하고;

(2) 상기 토양을 50∼95% 알콜에 침적시키고, 그 침적물을 여과하여 잔사를 얻고;

(3) 상기 잔사에 멸균 식염수를 가하고 진탕하여 진탕액을 만들고;

(4) 상기 진탕액의 상등액 일부를 진균이 증식할때까지 아가 배지 상에 2∼5일 간 증식시키고;

(5) 상기 증식 균사를 진균 실험용 증식 배지로 옮겨 진균 배양물을 증식시키고;

(6) 상기 진균 배양물을 함유하는 배지의 적어도 일부를 분리하고 균사를 완전히 분쇄하여 혼합물에 고성능 액체 크로마토그래피 용매를 첨가하고;

(7) 상기 용매 중에 함유되어 있는 진균 배양물의 크로마토그래프를 얻고;

(8) 상기 배양물의 일부를 취하여 탁산, 탁솔 및 바카딘을 각각 정량하고,크로마토그래프를 탁솔, 바카딘 및 세팔로만닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 탁산 표준물과 비교하는 단계:

를 포함하는 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 분리하는 방법.
제3항에 있어서, 단계(4) 다음으로, (4A) 상기 증식 균사를 균사 배양용 아가상에 놓고, 단일종을 형성할 때까지 균사 배양용 아가상으로 이식하는 단계:

를 더욱 포함하는 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 분리하는 방법.
제3항에 있어서, 단계(8) 다음으로, (9) 탁솔을 생성하지 않는 배양물을 제거하는 단계:

를 더욱 포함하는 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 분리하는 방법.
(1) 페스탈로티아 헤테로코니스(Pestalotia Heterocornis)로 명명되는 진균을 진균의 증식이 일어나게 할 수 있는 영양 배지에 노출시키고;

(2) 상기 진균이 증식 및 복제할 수 있는 조건을 포함한, 진균을 함유하는 배지를 위한 배양 조건을 제공하고;

(3) 상기 배양 배지 또는 진균으로부터 목적하는 탁산을 분리하거나 농축시키는 과정을 포함하는 탁산의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 탁산이 탁솔인 탁산의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 영양 배지가 벤조산, 벤조산 대사 물질 전구체, 소디움 벤조에이트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 탁산의 제조방법.