CN113980819A - 南方红豆杉针叶内生真菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种南方红豆杉针叶内生真菌菌株及其用途，该菌株为Pseudodidymocyrtis lobariellae KL27，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22459。本发明的菌株Pseudodidymocyrtis lobariellae KL27，通过将培养的发酵液喷洒南方红豆杉苗木，可有效促进南方红豆杉针叶中紫杉醇的生物合成与积累，具有较大的应用价值。

Description

南方红豆杉针叶内生真菌菌株及其用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种南方红豆杉针叶内生真菌及其用途。

背景技术

红豆杉(Taxus sp.)又称紫杉，是红豆杉科红豆杉属的常绿乔木或灌木。红豆杉属植物在全世界约有11个种200多个栽培种，我国有4个种、1个变种和1个杂交种，即东北红豆杉、喜马拉雅红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、变种南方红豆杉和杂交种曼地亚红豆杉等。红豆杉是珍贵的用材树种并具有较高的园艺观赏价值，同时还具有很高的药用价值。红豆杉中的抗癌活性成分紫杉醇能够有效抑制癌细胞的增生繁殖，是治疗癌症的珍贵药物。但红豆杉生长缓慢，且紫杉醇含量极低，因此在不破坏野生森林资源的前提下，利用现代生物技术手段提高紫杉醇产量具有重要意义。

植物内生真菌，是指在其生活史的部分阶段或全部阶段，生存在健康植物体内而不引起植物明显感染症状的一类真菌。内生菌与宿主植物之间主要是和谐的共生关系并且协同进化，它们主要存在于植物组织细胞间隙内，其中一些内生菌还可以产生一些生物活性物质，这些特殊的化学物质还可以成为内生菌诱导子，对宿主植物的生长发育和次生代谢产物的积累起到一定的作用。

方芳等(2009)用内生真菌AL4粗诱导子对茅苍术悬浮细胞进行诱导处理，细胞中苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇和苍术素的含量均有所提高，表明添加内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞挥发油的积累有促进作用。郭婷婷(2015)以传统而新兴的药用植物红景天为研究材料，筛选出可以促进宿主化学成分如红景天苷和酪醇的积累的内生真菌菌株。朱波等(2016)通过初筛得到的铁皮石斛内生真菌可提高组培苗多糖含量，促进甘露糖和醇溶性浸出物含量积累。Hemmati等(2020)从长春花中分离到两株内生真菌既可以促进长春花愈伤的生长，还可以提高愈伤中次生代谢物秋水仙碱和长春碱的含量。

南方红豆杉(Taxus chinensis var.Mairei)，隶属于红豆杉科红豆杉属，为我国Ⅰ级保护植物，产于我国长江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中。目前关于南方红豆杉内生真菌的多样性、促生能力以及内生菌产紫杉醇等的研究报道很多，但对于内生真菌是否可以诱导南方红豆杉紫杉醇等药效成分的积累的相关研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种南方红豆杉针叶内生真菌及其用途，可促进南方红豆杉针叶内紫杉醇合成。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种南方红豆杉针叶内生真菌菌株，该菌株为Pseudodidymocyrtis lobariellaeKL27，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22459。

所述菌株28S rRNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。

一种含有所述南方红豆杉针叶内生真菌菌株的微生物菌剂。

所述的南方红豆杉针叶内生真菌菌株用于促进南方红豆杉针叶中紫杉醇的生物合成与积累的用途。

将南方红豆杉针叶内生真菌菌株KL27的发酵液喷洒于南方红豆杉苗，从而实现提高南方红豆杉针叶中紫杉醇的含量。

所述发酵液由以下步骤制得：将南方红豆杉针叶内生真菌菌株KL27接种到PDB液体培养基中，在温度28℃、转速200rpm震荡培养7d，减压过滤获得滤液，即为发酵液。

有益效果：本发明所述的菌株KL27(南方红豆杉内生真菌)，通过将过滤的发酵液喷洒南方红豆杉苗，可有效促进紫杉醇成分的生物合成与积累，具有较大的应用价值。

附图说明

图1为南方红豆杉内生真菌BL27在PDA平板培养基上的形态图；

图2为南方红豆杉内生真菌BL27发酵液喷洒于南方红豆杉植株7d后，南方红豆杉针叶的紫杉醇的含量(CK为对照，KL27为本发明内生真菌处理组)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

本发明的一种南方红豆杉针叶内生真菌菌株，该菌株为Pseudodidymocyrtislobariellae KL27，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22459。其28SrRNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。

本发明的菌株KL27(南方红豆杉内生真菌)是从红豆杉科红豆杉属植物南方红豆杉(Taxus chinensis var.Mairei)针叶中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为Pseudodidymocyrtis lobariellae。具体分离方法为：

(1)截取南方红豆杉针叶，流水冲洗2h，并将冲洗过后的样本超声波清洗3次，每次2-3min，以避免植物组织表面附着的难冲洗物质影响分离结果。然后在超净工作台内将冲洗后的样本依次用70％乙醇，无菌水，次氯酸钠和无菌水消毒冲洗。冲洗干净的样本用组织匀浆法研碎后平铺在PDA培养基上，于28℃培养，直至获得单菌落；

(2)挑取单菌落于相同的PDA平板划线纯化，于28℃培养3-5天；

(3)重复步骤(2)，直至获得纯培养物。

本发明的提高南方红豆杉针叶中紫杉醇成分的含量的方法，是将上述的菌株KL27(南方红豆杉内生真菌)接种到PDB液体培养基的中，28℃、200rpm震荡培养7d，减压过滤，滤液喷洒在南方红豆杉苗上，处理7d后剪取针叶，干燥后研磨，提取目标产物，进行色谱检测。

本发明所用的培养基包括：

A、PDA培养基：马铃薯浸出粉6.0g；葡萄糖20.0g；琼脂20.0g；蒸馏水1000ml；pH自然；

B、PDB培养基：马铃薯浸出粉6.0g；葡萄糖20.0g；蒸馏水1000ml；pH自然；

上述培养基均为常规培养基，使用前需进行常规的灭菌。

下面结合实施例对本发明进行说明。

实施例1：Pseudodidymocyrtis lobariellae KL27的分离培养、鉴定与保藏：

内生真菌菌株KL27由以下步骤分离获得：

1)分离菌株所用组织材料是采自湖北利川星斗山自然保护区(北纬29°59′49″，东经109°0′6″)内的健康野生南方红豆杉，将采摘的新鲜根、茎和针叶叶组织蜡封装于自封袋内低温带回实验室4℃保存，用于后续植物内生真菌的分离。

2)将截取的南方红豆杉针叶流水冲洗2h，并将冲洗过后的植物样本超声波清洗3次，每次2-3min，以避免植物组织表面附着的难冲洗物质影响分离结果。

3)取出南方红豆杉针叶，在超净工作台中进行消毒处理，先用无菌蒸馏水冲洗2次，然后用75％乙醇处理1min，无菌水冲洗3次，随后用0.1％升汞处理2min，无菌水冲洗5次。将表面消毒后的针叶放在无菌干燥的滤纸上吸干水分后待用。

4)将消毒后的针叶放在无菌的干净研钵中进行研磨。研碎组织均匀涂布于PDA平板上，28℃培养24h后，进行常规的无菌检测。检测合格的，继续进行培养。

5)挑取所产生的单菌种于相同培养基划线纯化分离，置于28℃培养3-5天，继续挑取单菌落；重复上述操作直至得到纯培养为止。

6)将步骤5)所得到的单菌落进行28S rRNA测序，经序列比对，确定菌株，并保藏，得到菌株Pseudodidymocyrtis lobariellae KL27。

该菌株KL27的保藏信息如下：

保藏名称为：Pseudodidymocyrtis lobariellae，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNO.22459，保藏时间2021.07.14。

本实施例的南方红豆杉内生真菌的rRNA基因序列测定结果，28S rRNA的部分序列片段如图2所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，与Pseudodidymocyrtis lobariellae KRAM AdamFlakus 25130的相似性为99.67％。

实施例2：南方红豆杉内生真菌KL27发酵液处理南方红豆杉苗

1)取实施例1所得的Pseudodidymocyrtis lobariellae KL27，在无菌条件下，挑取一接种环的菌丝，接种于100mL无菌PDB液体培养基中，置于28℃，150rpm摇床培养7天，减压过滤，收集滤液90mL。

2)将滤液倒入小喷壶中，均匀的喷洒在南方红豆杉苗上，对照组南方红豆杉苗喷洒等量的蒸馏水。处理后7d时剪取针叶样品，干燥后研磨，提取目标产物，进行色谱检测。

实施例3：南方红豆杉内生真菌对南方红豆杉针叶中紫杉醇生物合成的影响

将实施例2所获的两种红豆杉(KL27发酵液处理后的南方红豆杉、以及作为对照的南方红豆杉)的针叶45℃干燥至恒重并研磨成粉，精密称取0.5-1.0g于50mL离心管中，以1：20(w/v)的比例添加酸化甲醇溶液，超声处理1h，用双层滤纸进行过滤，保留滤液。将滤渣转移至50mL离心管中，加入相应体积的酸化甲醇溶液，超声处理1h，用双层滤纸进行过滤，保留滤液，重复此步1次。合并3次滤液，用旋转蒸发仪在<40℃的条件下，进行减压蒸干，排出酸化甲醇溶液，析出检测物。用甲醇溶解并定容至1mL，超声处理30min。在高速离心机中于10000r/min下离心10min，吸取上清液，最后用0.45μm的有机相滤膜过滤，减少固体析出物。HPLC检测条件：色谱柱：Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和0.1％甲酸水溶液(B)；流速1.0mL/min；检测波长：227nm；柱温：25℃；进样量10μL，线性梯度洗脱程序为：0min:5％A,25min:100％A,30min:100％A,35min:5％A.。

如图2所示，南方红豆杉内生真菌KL27对南方红豆杉针叶中紫杉醇合成的影响较显著，KL27处理一周后，南方红豆杉针叶中的紫杉醇含量为对照组的3.86倍，表明KL27可有效促进南方红豆杉针叶中紫杉醇成分的合成与积累。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 南方红豆杉针叶内生真菌菌株及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 607

<212> DNA

<213> Pseudodidymocyrtis lobariellae

<400> 2

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccctagtaac ggcgagtgaa 60

gcggcaacag ctcaaatttg aaatctggcc ctctttgggg gtccgagttg taatttgcag 120

agggtgcttt ggcatcggcg gcggtctaag ttccttggaa caggacatcg cagagggtga 180

gaatcccgta cgtgggcgcc tgcctttgcc gtgtaaagcc ccttcgacga gtcgagttgt 240

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agcccggact gaggtccgcg catctgctag gatgctggcg taatggctgt aagcggcccg 600

tcttgaa 607

Claims (6)

1.一种南方红豆杉针叶内生真菌菌株，其特征在于：该菌株为Pseudodidymocyrtislobariellae KL27，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22459。

2.根据权利要求1所述的南方红豆杉针叶内生真菌菌株，其特征在于：其28S rRNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。

3.一种含有权利要求1所述的南方红豆杉针叶内生真菌菌株的微生物菌剂。

4.权利要求1所述的南方红豆杉针叶内生真菌菌株用于促进南方红豆杉针叶中紫杉醇的生物合成与积累的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：将南方红豆杉针叶内生真菌菌株KL27的发酵液喷洒于南方红豆杉苗。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述发酵液由以下步骤制得：将南方红豆杉针叶内生真菌菌株KL27接种到PDB液体培养基中，在温度28℃、转速200rpm震荡培养7d，减压过滤获得滤液，即为发酵液。

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