CN113416656B - 地耳草内生真菌菌株hubu0122及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及地耳草内生真菌菌株HUBU0122及其应用。该内生真菌命名为链格孢属菌（Alternaria sp.)HUBU0122，其菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市八一路299号，保藏日期为2021年4月19日，保藏编号为CCTCC No.M2021414。该菌对沙门氏菌和水稻黄单胞菌具有抑菌作用，可作为植物内生真菌的利用资源，以为获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然成分奠定基础。

Description

地耳草内生真菌菌株HUBU0122及其应用

技术领域

本发明涉及地耳草内生菌技术领域，尤其涉及地耳草内生真菌菌株HUBU0122及其应用。

背景技术

地耳草（Hypericum japonicumThunb. ex Murray），别名香草、田基黄，是常用的药用植物之一。地耳草分布广泛，在中国主要分布于辽宁、山东至长江以南各省区，生长于海拔2800米以下比较潮湿的土地包括田边、沟边、草地以及撩荒地上。其全部组织和器官均能制成药物，能清热止血，有解毒消肿的作用，对治疗慢性肝炎、跌打损伤以及传染性疮毒有显著效果。

根据现代药理学的最新研究结果显示，地耳草中主要含有多种黄酮类、内酯类、酚类、糖类物质和鞣质，能在不同的程度上有效抑制多种致病菌，其中主要包括金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等。据报道，地耳草的水提取物具有广谱抑菌活性（除铜绿假单胞杆菌）。但是直接从植物中提取获得抗菌活性成分存在一定的局限性，例如：产率通常仅为0.01%~0.03%；产物受季节、地理位置和环境、气候等因素制约而影响其重现性；植物资源的过度开采使许多植物已濒临枯竭。

近年来科研工作者发现，具有特殊生理活性的代谢产物与特殊生长环境下的微生物存在紧密的关系，几乎已经发现的所有植物中都会含有内生真菌，这些真菌长期生活在寄主植物内的微环境中，与寄主植物一起进化，而且在这个过程中它们还可能产生与其寄主植物或相同或相似的活性化学物质。然而，现有技术并未公开相关地耳草具有相关的内生微生物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在提供一种地耳草内生菌，以其减少直接从地耳草内提取活性成分，减少对地耳草的过度开发。

第一方面，本发明实施例公开了一株地耳草内生真菌菌株，其命名为链格孢属菌（Alternaria sp.)HUBU0122，其菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市八一路299号，保藏日期为2021年4月19日，保藏编号为CCTCC No. M2021414。

第二方面，本发明实施例公开了第一方面涉及的地耳草内生真菌菌株HUBU0122或其代谢产物在制备抑菌剂中的应用。

在本发明实施例中，所述抑菌剂包括使用甲醇对所述地耳草内生真菌菌株HUBU0122的代谢产物进行提取的提取物。

在本发明实施例中，所述提取物的制备方法包括以下步骤：将地耳草内生真菌菌株HUBU0122于PDA培养基中发酵培养，得发酵液，纯化提取即可得所述提取物。

在本发明实施例中，所述发酵过程中，先将地耳草内生真菌菌株HUBU0122接种于PDA的固体培养基上进行活化7天后，再将其转接至含青霉素、链霉素的PDA液体培养基中进行发酵。

在本发明实施例中，所述发酵过程中，将发酵液用甲醇静置浸泡提取，提取时间为6-8 h，按此法连续提取3次后，过滤，滤液浓缩干燥即可得所述提取物。

在本发明实施例中，在甲醇浸泡过程中，还对发酵液进行了超声处理，超声频率10~50 KHz，并控制温度40 ℃。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明对地耳草内生真菌进行分离，并明确了具有广谱抗菌活性的内生真菌(Alternaria sp.)HUBU0122菌株的微生物学地位，通过对HUBU0122抗菌发酵液的抗菌试验发现该菌对沙门氏菌和水稻黄单胞菌具有抑菌作用，可作为植物内生真菌的利用资源，以为获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然成分奠定基础。

附图说明

图1为地耳草内生真菌Alternaria sp. HUBU0122菌株菌落的形态示意图，其中左图表示该菌株菌落正面形态示意图；右图表示该菌株菌落背面的形态示意图。

图2为本发明实施例提供的牛津杯法检测地耳草内生真菌Alternaria sp.HUBU0122对不同细菌的抑菌平板图，图2A为大肠杆菌(Escherichia coli)，图2B为沙门氏菌(Salmonella)，图2C为水稻黄单胞菌(Xanthomoas oryzae)，图2D为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

图3为本发明实施例提供的Alternaria sp. HUBU0122发酵甲醇提取物对沙门氏菌的抑菌结果图。

图4为本发明实施例提供的Alternaria sp. HUBU0122发酵甲醇提取物水稻黄单胞菌的抑菌结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10~30°C，最好是15~25°C。

实施例1、地耳草内生真菌HUBU0122的分离纯化

1、植物样品采集及预处理

新鲜健康的地耳草的全株植物于2019年9月采自湖北省黄冈市蕲春县，生长良好，无明显病虫害。将地耳草的健康植株样品用纯净水或自来水流动冲洗去除样品组织表面可能残留的杂质，冲洗干净后及时剪掉样品植株质量差的组织，切成约有0.5×1 cm切口的小片组织放于干净滤纸上吸干水分。吸干表面液体后进行表面消毒，在超净工作台内的无菌环境条件下，用75%超净过滤乙醇浸泡消毒3 min注意避免将组织切口处与乙醇直接接触，接着用无菌超纯水反复漂洗组织切片3次，最后用无菌滤纸迅速吸走多余的水分，保持表面干燥。表面消毒后做超净工作台洁净度检查及无菌漂洗液检验。

2、内生真菌分离

在无菌条件下，将消毒后的含切口的叶片组织切片最好去除掉与外界相接触的组织部分仅保留内部组织用无菌镊子转接至制备好的MEA分离培养基中，这样会更有利于植物内部的内生真菌生长，切面与培养基接触，每个培养基均匀放置四个组织切片，在26℃条件下放置培养。

3、内生真菌纯化

当根据观察结果看到组织切片边缘有少量菌丝生长出来后，在MEA分离培养基平板中本实施例选择用接种针沾取极少量生长在切片边缘的菌丝后再转接到新制备的PDA培养基中，并在过程中运用平板划线法使各个菌落由此分离开来以便得到单个菌落，当每个菌落生长至一定大小后重复这样的纯化操作5~6次，在经过多次的纯化操作后，观察到培养基平板上新长出的菌落外观性状特征均相同且每皿只有一种内生真菌生长时说明纯化完成，得到单一真菌菌株，如图1所示，记录并将菌落编号为地耳草内生真菌HUBU0122。

4、内生真菌的保藏

在超净工作台中，将已经分离纯化好的单个内生真菌菌种用接种环接种至制备好的PDA 固体斜面培养基上，在26℃恒温条件下培养3天后，用显微镜检查发现培养基无杂菌污染后，放入4℃冰箱保存，可以保存3-6个月。

实施例2、地耳草内生真菌HUBU0122的鉴定

将分离纯化的地耳草内生真菌HUBU0122接种于PDA培养基中，于28℃恒温真菌培养箱中倒置培养7天，对真菌DNA进行提取之后再将提取成功的基因组DNA进行PCR扩增操作后再测出其ITS序列，将测得的序列与数据库中已知的菌株基因组DNA序列对比得到确定的菌株种属。

1、内生真菌HUBU0122 DNA的提取

真菌基因组DNA的提取采用真菌基因组DNA提取试剂盒（货号D2300，Solarbio）进行提取，提取全过程在室温下进行，具体为：

①取50~100 mg菌丝，加200 μL溶液A，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约30 min。

②加入20 μL的蛋白酶K(10 mg/mL)，充分混匀，55℃水浴消化30 min，消化期间颠倒离心管混匀数次。12000 rpm离心2 min，将上清转移到一个新的离心管中。

③在上清中加入200 μL溶液B，充分混匀。

④再加入200 μL无水乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。

⑤12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

⑥向吸附柱中加入600 μL漂洗液，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

⑦向吸附柱中加入600 μL漂洗液，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

⑧12000 rpm离心2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟。

⑨将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加200 μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5 min，12000 rpm离心1 min。

⑩离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min，即可得到高质量的基因组DNA。将得到的DNA溶液都收集起来为提取得到的基因组DNA。试剂盒提取的基因组DNA可立即用来进行下一步的分子实验也可以放于冰柜-20°C冷冻保存备用，并可以经过琼脂糖凝胶电泳确定。

2、PCR扩增

将内生真菌的DNA成功提取后，采用真菌ITS通用引物进行PCR扩增实验，即引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，如SEQ ID NO.1所示）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，如SEQ ID NO.2所示）对内生真菌的ITS和5.8S基因进行PCR扩增。

PCR反应体系（50 μL）的组成成分及用量（见表1）：

表1 PCR反应体系组成（50 μL）

PCR反应循环参数与步骤（见表2）：

表2 PCR反应循环参数与步骤

3、电泳检测

将扩增成功的PCR产物取3 μL点样于含有溴化乙啶（0.5 μg/mL）的1%琼脂糖凝胶上，在恒压150 V条件下电泳15 min，然后在紫外灯下检测产物进行图像采集，根据对比产物条带大小来判断，如果出现500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

4、PCR产物序列测定：对于成功扩增出目的片段的PCR产物移交给上海生工进行测序。

5、序列数据分析

经鉴定的Alternaria sp. HUBU0122的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO.3所示，在GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）网站中，使用Blast对5.8s rDNA序列进行比对分析寻找相似的ITS序列。为了更加准确地确定这些真菌的种类和归属，本实施例选择下载相似率最高的几种真菌ITS序列进行比对，用MEGA 5.05软件中的 Clustal X（1.81）分析方法进行序列对比分析，采用邻接法（Neighbor-Joining）方法构建系统发育树。最后通过结合内生真菌菌株的外部形态结果和系统发育树鉴定结果，将这些内生真菌鉴定到种属。结果表明，内生真菌菌株HUBU0122与Alternaria destruens（NR 137143.1）聚为一分支，序列同源性高于99%，确定菌株HUBU0122为链格孢属（Alternaria sp.）。

实施例3、地耳草内生真菌HUBU0122代谢产物甲醇提取物抑细菌活性筛选

菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的真菌接种到含有青霉素链霉素的新鲜PDA固体培养基中，置于28℃真菌恒温培养箱中培养7天活化，反复活化两次使真菌恢复正常长势。

菌株代谢产物甲醇提取物的制备：将菌株接种于含有青霉素链霉素的新鲜PDA平板上，在28℃真菌恒温培养箱中培养7天。将PDA培养基中已培养好的菌株及其代谢产物用200 mL的甲醇浸泡6~8小时，反复提取三次，同时用超声仪40 ℃超声2~3小时。将各菌株甲醇粗提物用抽滤瓶进行抽滤，使用旋转蒸发仪将抽滤后的滤液进行减压干燥后得到菌株代谢产物甲醇提取物，于4℃备用。

抑菌试验：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌、水稻黄单胞菌）和革兰氏阳性菌（表皮葡萄球菌）为供试菌，采用牛津杯法评价菌株代谢产物甲醇提取物的抗菌活性：①称取干燥后的菌株代谢产物甲醇提取物100 mg溶于1 mL DMSO中，配制100 mg/mL的供试储备液。在超净工作台中，将样品溶液经微孔滤膜（0.22μm）过滤后，用无菌水配制成5 mg/mL的待测样品溶液待用。②将大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌接种于10mL培养液中，当细菌进入对数生长期后用NB肉汤稀释至麦氏比浊度为0.5，此时的细菌数量为108 CFU/mL，然后按照1:1000稀释后吸取500 μL菌悬液用涂布棒均匀涂布到LB固体培养基上，用无菌镊子夹取已经灭菌干燥的牛津杯竖直插入到培养基上面并轻轻加压以接触介质而没有空隙。③用移液器吸取200 μL待测样品溶液加入到牛津杯中，用做好标记，将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养，24小时后观察抑菌圈的大小，测量抑菌圈直径，每组实验重复三次，最后结果取平均值。

抑菌结果如图2所示，抑菌圈直径大小测量统计结果如表3所示。结果发现，地耳草内生真菌HUBU0122对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌均无抑制作用，对沙门氏菌和水稻黄单胞菌的生长具有抑制作用。表3中，“++”代表抑菌圈直径为10-15mm，“-”代表无抑菌活性，结果表面HUBU0122的代谢提取物对沙门氏菌具有抑菌活性。

表3 HUBU0122代谢提取物对四种供试菌的抑菌结果

实施例4、地耳草内生真菌HUBU0122代谢产物甲醇提取物的抑菌活性

本实施例中进一步测试从实施例3中得到的菌株代谢产物甲醇提取物的抑菌活性，直接将地耳草内生真菌HUBU0122接入250毫升三角瓶中(装有50毫升PDA液体培养基)，置于(26±1)℃摇床上(160转/分钟)旋转培养7天，无菌条件下过滤除去菌丝体，发酵液样品备用。

采用微量肉汤稀释法进一步评价菌株代谢产物甲醇提取物的抗沙门氏菌和水稻黄单胞菌活性。按实施例3中菌株代谢产物甲醇提取物的制备方法提取得到菌株代谢产物甲醇提取物。详细实验过程如下：

待测样品溶液制备：称取干燥后的菌株代谢产物甲醇提取物100 mg溶于1 mLDMSO中，配制100 mg/mL的供试储备液。在超净工作台中，将样品溶液经微孔滤膜（0.22 μm）过滤后，用无菌水配制成1000 μg/mL的待测样品溶液。

细菌培养：沙门氏菌或水稻黄单胞菌生长于NB液体培养基中。培养细菌置于37℃、220 rpm的恒温摇床中培养6~8 h；用NB肉汤稀释至麦氏比浊度为0.5的菌悬液，此时的细菌数量为10⁸ CFU/mL。

实验分组：

分成阴性对照组和给药组，每组设3个复孔；

阴性对照组（negative control）：未加菌株代谢产物甲醇提取物，加入菌液和等量无菌水；

给药组（HUBU0122、HUBU0122）：分别加入菌液和不同浓度梯度的菌株代谢产物甲醇提取物。

微量肉汤稀释法：取无菌的96孔板，从第二排第二孔加入20 μL的待测样品溶液，第三至九孔分别加入10 μL的无菌水，从第二孔吸取10 μL加入第三孔，混匀，再吸取10 μL至第四孔，依次类推，第九孔吸取10 μL弃去。此时各孔药物浓度依次为：1000、500、250 μg/mL，第十孔加入10 μL无菌水。将菌悬液用NB液体培养基按照1:1000稀释，混匀后吸取100 μL菌液加入96孔板中。将接种好的96孔板放置于37 ℃恒温培养箱培养16-24 h后，应用酶标仪检测600 nm波长处的OD值。结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔,则不应报告结果，需重复试验。

结果如图3、4所示，地耳草内生真菌HUBU0122的代谢提取物对沙门氏菌的抑制活性呈现出剂量线性依赖关系。根据表4，可以计算出Alternaria sp. HUBU0122（HUBU0122）抗沙门氏菌活性的最低抑菌浓度（MIC）值为3108 μg/mL，对水稻黄单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）值为1568 μg/mL。

表4

本发明对地耳草内生真菌进行分离，并明确了具有广谱抗菌活性的内生真菌HUBU0122(Alternaria sp.)菌株的微生物学地位，通过对HUBU0122抗菌发酵液的抗菌试验发现该菌对沙门氏菌和水稻黄单胞菌具有抑菌作用，可作为植物内生真菌的利用资源，以为获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然成分奠定基础。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 地耳草内生真菌菌株HUBU0122及其应用

<141> 2021-07-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 548

<212> DNA

<213> Alternaria sp.

<400> 3

gcgggccttc cgtatgatgc gggctggacc tctcggggtt acagccttgc tgaattattc 60

acccttgtct tttgcgtact tcttgtttcc ttggtgggtt cgcccaccac taggacaaac 120

ataaaccttt tgtaattgca atcagcgtca gtaacaaatt aataattaca actttcaaca 180

acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtagtgtgaa 240

ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccttt ggtattccaa 300

agggcatgcc tgttcgagcg tcatttgtac cctcaagctt tgcttggtgt tgggcgtctt 360

gtctctagct ttgctggaga ctcgccttaa agtaattggc agccggccta ctggtttcgg 420

agcgcagcac aagtcgcact ctctatcagc aaaggtctag catccattaa gccttttttt 480

tcaacttttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 540

gaggaaaa 548

Claims (6)

1. 一株地耳草内生真菌菌株HUBU0122，其命名为链格孢属（Alternaria sp.)HUBU0122，其菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市八一路299号，保藏日期为2021年4月19日，保藏编号为CCTCC No. M2021414。

2.权利要求1所述的地耳草内生真菌菌株HUBU0122在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂具有抑制沙门氏菌和/或水稻黄单胞菌的作用，所述抑菌剂包括使用甲醇对所述地耳草内生真菌菌株HUBU0122的代谢产物进行提取的提取物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提取物的制备方法包括以下步骤：将地耳草内生真菌菌株HUBU0122于PDA培养基中发酵培养，得发酵液，纯化提取即可得所述提取物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵过程中，先将地耳草内生真菌菌株HUBU0122接种于PDA的固体培养基上进行活化7天后，再将其转接至含青霉素、链霉素的PDA液体培养基中进行发酵。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将发酵液用甲醇静置浸泡提取，提取时间为6~8 h，按此法连续提取3次后，过滤，滤液浓缩干燥即可得所述提取物。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在甲醇浸泡过程中，还对发酵液进行了超声处理，超声频率10~50 KHz，并控制温度40 ℃。

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